目的  建立国家药品抽检品种维C银翘系列制剂的微生物限度检查方法，并对其微生物污染情况开展分析，为其监管提供参考。

方法  按《中国药典（2020年版）》要求，开展微生物限度检查方法适用性研究，并对计数结果、检出菌开展分析。

结果  可用1  ∶  50、1 ∶ 10供试液开展维C银翘片与维C银翘胶囊（硬胶囊）需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检验；用1 ∶ 10供试液开展软胶囊计数检验；用1 ∶ 20、1 ∶ 10供试液分别开展颗粒剂需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检验；大肠埃希菌可用常规法开展检验；212批样品均符合规定；污染菌以芽孢杆菌属为主；某企业检出的3株蜡样芽胞杆菌群菌株的同源性较高；从另1企业产品检出1株布鲁氏菌属菌株。

结论  所建立的微生物限度检查方法准确度高，可用于该系列产品的质量控制；该系列产品微生物检查结果总体良好，但仍需企业及时发掘并研判生产过程的质量风险，以充分保障药品安全。

维C银翘系列制剂有片剂、颗粒剂、胶囊剂（包括硬胶囊、软胶囊）3个剂型，由山银花或金银花、连翘、牛蒡子、甘草等10味中药加入对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、维生素C 3味化学药加工而成的复方制剂，临床主要用于治疗流行性感冒引起的发热、头疼、咳嗽、口干、咽喉疼痛等 [1- 4]。在2022年国家药品抽检工作中，贵州省食品药品检验所承担了维C银翘系列制剂品种评价性抽检任务，考虑到药品污染微生物的控制是保障药品安全性的重要措施[5]，故开展了微生物学检验的研究工作。目前尚未见维C银翘颗粒、维C银翘胶囊微生物限度方法的相关文献报道，有几则《中国药典（2005年版）》和《中国药典（2010年版）》建立维C银翘片微生物限度方法的报道 [6-8]，但考虑《中国药典（2015年版）》对于微生物限度检查方法的技术要求有了较大的修订，参考价值有限，故参照《中国药典（2020年版）》四部通则1105、1106、1107要求，对该系列产品开展了微生物限度检验与方法适用性研究工作，并对制剂的污染状况开展分析，保证检验质量并为其监管提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

NU-425-400E型生物安全柜（美国NuAire）；KB240型低温恒温培养箱、BF260型电热恒温培养箱购自德国Binder；VITEK MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（法国梅里埃）；GR85DA型立式自动压力蒸汽灭菌器[致微（厦门）仪器有限公司]；ME2002型电子天平（瑞士梅特勒-托利多）；HTY HOMO761型匀浆仪（浙江泰林生物技术股份有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

胰酪大豆胨液体培养基（tryptic soy broth，TSB，批号：21061785）、胰酪大豆胨琼脂培养基（tryptic soy agar，TSA，批号：20122516）、麦康凯液体培养基（批号：2107216）均购自北京陆桥技术股份有限公司；沙氏葡萄糖琼脂培养基（sabouraud dextrose agar，SDA，批号：210³22）均购自北京三药科技有限公司；麦康凯琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司，批号：20220122）；质谱样品处理基质溶液（法国梅里埃，批号：20220907）。

维C银翘片：涉及来自贵州、广西、云南、湖北、江西、广东、宁夏、新疆、甘肃、四川等省区21家企业生产的共173批次；维C银翘胶囊：胶囊涉及广西3家企业共16批，软胶囊涉及广东1家共3批；维C银翘颗粒：涉及广西3家企业生产的共20批次。以上均为全国28个省市相应机构依据2022年国家评价性抽验要求抽样提供。

1.3 菌种

黑曲霉[编号：CMCC(F)98003]、枯草芽孢杆菌[编号：CMCC(B)63501]、白色念珠菌[编号：CMCC(F)98001]、金黄色葡萄球菌[编号：CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[编号：CMCC(B)10104]、大肠埃希菌[编号：CMCC(B)4410²]均购自中国食品药品检定研究院；大肠埃希菌（上海宝录生物科技有限公司，编号：ATCC8739）。

1.4 方法

1.4.1 法定检验

按照企业提供的微生物检验方法资料，结合《中国药典（2020年版）》四部通则1105、1106、1107[9]，对212批样品开展需氧菌总数（total aerobic microbial count，TAMC）、霉菌和酵母菌总数（total yeasts and molds count，TYMC）、大肠埃希菌3个项目的微生物限度检查，TAMC均不大于10³ cfu/g，TYMC均不大于10² cfu/g，均不能检出大肠埃希菌（1 g）。

1.4.2 探索性研究

①供试液制备。取两个以上最小包装的样品10 g，加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，45 ℃水浴振摇至完全溶解（胶囊、软胶囊、颗粒）或用匀浆仪使其完全溶解（片剂），制成1 : 10的供试液。各取上述1 : 10供试液10  mL，加入pH  7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别至20、50、100 mL，混匀，分别制备成1  :  20、1  :  50、1 : 100的供试液。

②菌液制备。按照《中国药典（2020年版）》四部通则1105、1106项下[9]菌液制备的要求和相关操作规范进行，取上述金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉试验菌株分别用TSB进行逐级稀释，制成不大于104 cfu/mL的菌悬液作为计数方法适用性检查菌液，同法取大肠埃希菌制成不大于10³ cfu/mL的菌悬液作为控制菌检查菌液，且所加菌悬液浓度符合加入体积不大于供试液体积的1%的要求。

③计数方法适用性试验[9]。综合企业提供原方法、抽样批次、文献报道[10-15]，选取反映抑菌性强、抽样批次占比大的样品开展预试验，TAMC选取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌作为试验菌，TYMC选白色念珠菌、黑曲霉，每个企业选取1批产品。片剂选取12家企业产品开展预试验，TAMC对应的供试液稀释倍数为1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶ 50、1 ∶ 100，TYMC为1 ∶ 10、1 ∶ 20。颗粒剂2家，TAMC对应的供试液稀释倍数为1 ∶ 10、1 ∶ 20，TYMC为1 ∶ 10、1 ∶ 20。胶囊剂3家，其中硬胶囊2家，TAMC对应的供试液稀释倍数为1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶ 50，TYMC为1 ∶ 10、1 ∶ 20；软胶囊1家，TAMC、TYMC对应的供试液稀释倍数均为1 ∶ 10。分组情况如下：试验组：将菌液加入供试液中，使每1  mL供试液中的加菌量不大于100 cfu，混匀。供试品对照组：取供试液，以pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作。菌液对照组：取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，同试验组操作。以上3组，均取1 mL混合液入平皿（直径90 mm），TAMC对应组加入20 mL TSA培养基，TYMC对应组加入20 mL SDA培养基，分别放至32.5 ℃和22.5 ℃培养箱培养3  d和5 d，计数记录。

④回收比值计算[9]。回收比值=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数，若回收率比值在0.5~2范围内，认为该方法适用于样品TAMC、TYMC。

⑤控制菌检查方法适用性试验。分组：试验组： 取1:10供试液10 mL，接种至100 mL TSB中，加入0.1 mL大肠埃希菌菌液（不大于100  cfu），吸取32.5℃下培养18 h的培养液10 mL，加入100  mL麦康凯液体培养基中，置于43 ℃下培养24 h后，于麦康凯琼脂培养基上划线分离，32.5  ℃培养18 h后，观察菌落形态，有典型菌落生长，则判定方法适用。供试品对照组：不加菌液，其余操作同试验组。阴性对照组：以TSB代替供试液，其余操作同试验组。

⑥污染菌鉴定。挑取TAMC、TYMC检验环节生长菌落，在TSA平板上划线分离纯化后于32.5  ℃培养24 h；同步将大肠埃希菌（编号：ATCC 8739）划线于血平板后于32.5 ℃培养24 h。用1 μL无菌塑料接种环挑取少量培养好的单菌落，均匀涂于靶板点位内，立即加1 μL CHCA基质，每株菌涂于相邻2个点位内，同时在靶板中心的小点位内涂大肠埃希菌（编号：ATCC 8739）作为校准菌株同法操作。利用VITEK MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪“IVD”模式下选择“双点位”开展鉴定，通过仪器配备的MyLa数字化管理平台查看分析鉴定结果；当显示双点位结果的可信度均为绿色方格标识（即可信度为60.0%~99.9%）时，则留存鉴定结果开展进一步分析。

⑦同源性分析。在VITEK MS的“RUO”模式下，利用SARAMIS Premiu软件中的Taxonomy功能对核糖体蛋白质特征性标志物谱图鉴定结果开展聚类分析，实现对某2家企业产品中检出的4株蜡样芽胞杆菌群的同源性分析。

2 结果

2.1 计数方法适用性试验

2.1.1 预试验结果

11家企业的维C银翘片计数方法回收比值情况见表1，当供试液稀释倍数为1 : 10时，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑制作用的企业产品分别为7家和6家，其中贵州A公司、广东A公司、广西C公司和湖北A公司4家企业产品对两株菌均有抑制；当供试液稀释倍数为1 : 20时，仍有贵州A公司、广东A公司、湖北A公司和新疆A公司4家企业对金黄色葡萄球菌有抑制作用，而仅有广西C公司产品对枯草芽孢杆菌仍存在抑制；当供试液稀释倍数为1 : 50时，能消除贵州A公司、广东A公司、湖北A公司、新疆A公司产品成分对金黄色葡萄球菌的抑制，同时可消除对枯草芽孢杆菌生长的影响；当供试液稀释倍数为1 : 10时，也不会对白色念珠菌、黑曲霉的生长带来明显影响。因此选择1 : 50、1 : 10统一开展维C银翘片TAMC、TYMC方法适用性试验。

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  表格1 维C银翘片计数方法适用性试验预试验回收比值

  Table 1.The recovery ratio of pre-application test of the counting method for vitamin C Yinqiao tablets

  

由表2可知，软胶囊的抑菌性较弱，1 : 10供试液即可保证计数方法的回收率达到《中国药典（2020年版）》规定。硬胶囊对金黄色葡萄球菌的抑制作用更为明显，当供试液为1 ∶ 50、1 ∶ 10时，可用于开展TAMC、TYMC的统一计数方法试验。颗粒剂的预试验回收比值见表3，广西E公司产品对枯草芽孢杆菌有一定抑制，故确定以1 ∶ 20、1 ∶ 10作为该剂型计数方法的供试液稀释级。

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  表格2 维C银翘胶囊计数方法适用性试验预试验回收比值

  Table 2.The recovery ratio of pre-application test of the counting method for vitamin C Yinqiao capsules

  注：“—”表示未进行该试验。

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  表格3 维C银翘颗粒计数方法适用性试验预试验回收比值

  Table 3.The recovery ratio of pre-application test of the counting method for vitamin C Yinqiao granules

  注：“—”表示未进行该试验。

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2.1.2 正式试验结果

表4~表6分别为维C银翘系列片剂、胶囊剂和颗粒剂的计数方法适用性试验回收比值，当供试液稀释倍数分别为1 : 50、1 : 10时，均适用于片剂、硬胶囊TAMC、TYMC检验。软胶囊可用1 : 10供试液开展计数检验。以1 : 20、1 : 10供试液分别开展颗粒剂TAMC、TYMC检验，适用性佳。

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  表格4 20个企业生产维C银翘片计数方法适用性试验回收比值

  Table 4.The recovery ratio of application test of the counting method for vitamin C Yinqiao tablets from 20 enterprises

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  表格5 3个企业生产维C银翘胶囊计数方法适用性试验回收比值

  Table 5.The recovery ratio of application test of the counting met

  

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  表格6 3个企业生产维C银翘颗粒计数方法适用性试验回收比值

  Table 6.3个企业生产维C银翘颗粒计数方法适用性试验回收比值 The recovery ratio of application test of the counting method for vitamin C Yinqiao granules from 3 enterprises

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2.2 控制菌检查适用性试验结果

每批次产品试验组均能检出典型的阳性对照菌，供试品对照组、阴性对照组均无菌生长，说明将10 mL 1 : 10供试液接种至100 mL TSB，按《中国药典（2020年版）》开展后续培养，大肠埃希菌的检验方法可行。

2.3 污染状况分析

2.3.1 制剂微生物生长情况

212批样品中，均未检出大肠埃希菌，TAMC、TYMC结果统计见表7和表8，片剂生长情况为：TAMC生长为32批次，占总抽样18.5%，其中菌数小于100 cfu/g占比最大，为59.4%；TYMC生长均小于20 cfu/g。21.1%的胶囊剂存在需氧菌、霉菌和酵母菌生长的情况，其中TAMC 100~500 cfu/g产品占有菌生长剂型的比例为75.0%，较片剂更大；TYMC共4批长菌，结果均在20~50 cfu/g。颗粒剂TAMC有菌生长的情况占该剂型总抽样数40.0%，但结果均不大于100 cfu/g；TYMC有菌生长占该剂型总抽样数的10.0%，其中20~50 cfu/g和50~100 cfu/g各1批。

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  表格7 TAMC结果统计

  Table 7.Statistics of TAMC results

  注：“—”表示无相关数据。

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  表格8 TYMC结果统计

  Table 8.Statistics of TYMC results

  

2.3.2 污染菌鉴定结果分析

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对TAMC、TYMC平板上生长的菌落开展鉴定，双点位结果一致且可信度均为绿色方格标识（即可信度为60.0%~99.9%）的鉴定情况见表9。总体来看芽孢杆菌属的检出频次较大，共有30次；其中枯草芽孢杆菌/解淀粉芽孢杆菌/死谷芽孢杆菌的检出频次为15次（由于上述3个种的核糖体蛋白质特征性标志物谱图较为接近，因此无法通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪将它们鉴定到种；因同样原因无法鉴定到种的还有高地芽孢杆菌和短小芽孢杆菌）。由鉴定结果可看出，M公司和N公司产品检出的蜡样芽胞杆菌群，Q公司检出的布鲁氏杆菌属中的某些种，危害度较大[16-18]。

• 
  表格9 污染菌鉴定结果与频次

  Table 9.Identification results and frequency of contaminated bacteria

  

2.3.3 蜡样芽胞杆菌群同源性分析

据“2.3.2”项结果，N公司有1批样品TAMC平板上检出蜡样芽胞杆菌群，M公司亦有3批样品（不同生产批号，抽样地为不同省份）TAMC环节收集到的菌落中检出蜡样芽胞杆菌群。对上述4株菌开展了同源性分析，结果见表 10和图1。与N公司检出菌相比，M公司产品检出的3株菌的同源性更高、对应产品生产时间为2021年9~10月，提示该段时间产品受到同源性污染的概率较大。

• 
  表格10 蜡样芽孢杆菌群来源样品信息

  Table 10.Sample information about Bacillus cereus group

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  图1 4株检出蜡样芽胞杆菌群MALDI-TOF-MS同源性分析结果

  Figure 1.Homology analysis for 4 strains of Bacillus cereus group by MALDI-TOF-MS

  

3 讨论

该系列制剂涉及的生产企业较多，通过统一微生物限度检查方法，可为监管技术支撑提供参考。其中的主要成分金银花、山银花对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等均有较好的抑制性，故选取上述3株菌对不同剂型产品开展微生物计数方法适用性预试验。在开展预试验时发现，与其他公司产品相比，由贵州A公司、广东A公司、广西C公司及湖北A公司生产的片剂与由广西H公司生产的硬胶囊均对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌存在较明显抑制，这可能与企业生产用药材的产地差异有一定关系[19]，可以此作为切入点开展研究。

为更深入了解该系列制剂的污染状况，对TAMC、TYMC环节所生长的菌落开展鉴定。检出频次最高的芽孢杆菌属可能主要来源于物料和生产环节[20]。需特别注意的是，检出了布鲁氏杆菌属、蜡样芽胞杆菌群等危害性可能较大的菌株。提示企业不能仅依赖微生物限度检查结果评估产品微生物污染状态，还需及时分析日常检验数据趋势与收集菌株、更深入发掘生产过程控制风险点。

通过同源性分析发现，M公司3批产品中检出的蜡样芽胞杆菌群菌株同源性较高；考虑抽样地不同，加之3批产品生产日期较为接近，提示由生产环节带入污染的概率较大。蜡样芽胞杆菌会引起呕吐、腹泻、脓毒血症等，甚至会导致死亡[16]，为常见的不可接受微生物[17]。但近年研究发现部分蜡样芽胞杆菌具有益生功能[21]，对于此类菌群，可考虑利用毒力基因测试开展危害性评估 [22-23]。此外，不同菌株产肠毒素数量存在一定差异[16]，需要开展定量风险评估[24]。N公司虽仅有1批产品检出蜡样芽胞杆菌群，但由于负载较大（TAMC结果为400 cfu/g），需要及时研判质量风险。此部分结果提示上述企业应关注品种计数检验情况，更大范围地考察蜡样芽孢杆菌群的检出频次和污染程度；同时从生产环节的原辅包、人员、环境等方面开展追溯排查，尽可能从源头控制微生物污染，充分保障患者用药安全。

目前，已有多版药典将具有潜在危害的微生物收载并定义为“不可接受微生物”[25]，国内关于“不可接受微生物”评估的案例较少[25-28]，提示企业在生产过程中应重视检出的非药典规定控制菌，结合鉴定结果、产品属性、工艺特性、患者人群、用药途径、生产过程等因素[29]制定合理科学的评估与控制策略。

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