目的  基于指纹图谱、化学模式识别、网络药理学和分子对接分析茯苓的潜在质量标志物。

方法  采用HPLC法建立20批茯苓药材的指纹图谱，结合正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）筛选组间主要差异成分；运用网络药理学方法确认与药效相关的成分，将差异成分与药效成分进行关联，预测潜在质量标志物，并通过分子对接进行验证。

结 果   建立了20批茯苓的HPLC指纹图谱，标定21个共有峰，并指认其中6个成分；OPLS-DA分析筛选出11个差异成分，并成功指认其中5个；网络药理学分析共获得15个活性成分、33个核心靶点及57条KEGG通路。综合指纹图谱与网络药理学结果，筛选出猪苓酸C、去氢土莫酸、松苓新酸和16α-羟基松苓新酸作为茯苓的潜在质量标志物。

结论  通过指纹图谱结合化学模式识别和网络药理学方法，成功识别了茯苓潜在的质量标志物，为全面控制和评价茯苓质量提供科学依据。

茯苓为多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]的干燥菌核，味甘淡，性平，归心、肺经，具有利水渗湿、健脾、宁心等功效，常用于水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、心神不安、惊悸失眠等症[1]。现代研究表明，茯苓具有利尿 [2-3]、保肝[4-5]、抗肿瘤[6]、抗氧化[7]、抗衰老[8]、抗炎[9]及免疫调节[10]等多种药理作用，其主要药效物质基础为茯苓多糖和三萜类化合物[11-12]。上海沪东医院临床应用的胃脾方，通过益气健脾、清胃消痞之功效，在治疗慢性萎缩性胃炎方面疗效显著。目前市场上以云南、安徽大别山区及湖北九资河所产茯苓品质较优，此外福建、湖南、广西、河南等地也有种植[13]。

目前，《中国药典（2020年版）》[1]仅从性状、鉴别、检查及浸出物等方面对茯苓药材的质量进行控制，尚未明确其含量测定指标，导致难以真正控制茯苓质量并对其品质作出客观综合评价。中药质量标志物（quality markers，Q-Marker）的提出为中药质量评价与质量控制提供了重要思路，其基于处方配伍、特有性、可测性、有效性及溯源性5项原则，将药效与药性纳入质量评价体系，从而更完整地反映中药质量[14]。中药指纹图谱作为一种较为成熟的共有成分分析方法，结合化学模式识别可揭示中药的整体性与差异性，而网络药理学则通过构建生物网络有效预测活性成分、作用靶点及相关通路，三者有机结合对深入挖掘茯苓Q-Marker具有重要意义[15]。

本研究基于HPLC指纹图谱与化学模式识别方法，对不同产地茯苓的质量进行评价，筛选导致质量差异的主要成分；同时借助网络药理学预测茯苓的潜在药效标志物，综合两方面结果确定其潜在Q-Marker，并进一步通过分子对接验证Q-Marker与相关靶点之间的相互作用，从而为茯苓的整体质量控制研究提供科学依据。

1 材料

1.1 主要仪器

1260型高效液相色谱仪，包括G7111A四元泵、G7129A柱温箱和G7115A DAD检测器（美国安捷伦科技有限公司）；SK250H型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；MSA125P型电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品松苓新酸（批号：MUST-24032020）、猪苓酸C（批号：MUST-24011011）、去氢茯苓酸（批号：MUST-24110724）、去氢土莫酸（批 号：MUST-24121414）、茯苓新酸A（批号：MUST-24080810）、茯苓新酸B（批号：MUST-24042305）均购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度均大于98%；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析级纯，水为超纯水。

茯苓S1~S5产自安徽岳西，购自安徽新盛中药饮片有限公司；S6~S10产自贵州黎平，购自山东金银藤中药材有限公司；S11~S15产自湖北黄冈，购自安徽敬道药业有限公司；S16~S20产自云南玉溪，购自安徽新盛中药饮片有限公司；茯苓样品批号信息见表1。茯苓药材均为茯苓块，经上海绿谷生命园张媛媛经理鉴定为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核。

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  表格1 茯苓样品批号信息

  Table 1.Batch number information of Poria cocos samples

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2 方法与结果

2.1 茯苓指纹图谱定性分析

2.1.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~15 min，50%~65% B；15~25 min，65% B；25~45 min，65%~95% B）；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：244 nm；进样量：10 μL[16-17]。

2.1.2 供试品溶液的制备

取茯苓药材粉碎后过三号筛，精密称定约2 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，经超声（功率：250 W，频率：50 kHz）处理30 min，冷却至室温后过滤，滤液再经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.1.3 混合对照品溶液的制备

精密称取茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、猪苓酸C、去氢茯苓酸和松苓新酸对照品适量，加甲醇溶解制成浓度分别为9.20、15.96、29.60、12.32、14.60、5.12 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.4 参照峰的选择

在对照色谱分析中，去氢茯苓酸表现出良好的色谱峰形，分离度符合试验要求。基于该化合物稳定的保留行为，本研究选择其作为参照峰，并通过系统计算获得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.1.5 精密度试验

精密称定茯苓药材（编号：S13），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算得各色谱峰的相对保留时间RSD均小于0.2%，相对峰面积RSD均小于0.4%（n=6）。

2.1.6 稳定性试验

取同一供试品溶液（编号：S13），室温放置，按“2.1.1”项下色谱条件于0、2、4、8、12、24  h分别进样测定，记录色谱图，计算得各色谱峰的相对保留时间RSD均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于0.5%（n=6）。

2.1.7 重复性试验

精密称定茯苓药材（编号：S13）共6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件依次进样测定，记录色谱图，计算得各色谱峰的相对保留时间RSD均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于1.0%（n=6）。

2.1.8 指纹图谱的建立及共有峰指认

采用上述方法测定20批不同产地茯苓药材的指纹图谱，并运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）软件导入相应HPLC图谱数据，共识别出21个共有峰。以S1样品色谱图为参照图谱，采用中位数法进行多点校正和全谱峰匹配，生成对照指纹图谱（图1）。以该对照指纹图谱为参照，计算各批次共有峰相似度，结果（表2）显示所有产地茯苓的相似度均大于0.95，表明不同批次间化学成分组成具有良好的一致性。进一步通过与对照品图谱比对，成功指认6个共有峰，分别为：茯苓新酸B（11号峰）、去氢土莫酸（13号峰）、茯苓新酸A（14号峰）、猪苓酸C（16号峰）、去氢茯苓酸（20号峰）和松苓新酸（21号峰），结果见图2。

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  图1 20批样品的HPLC图

  Figure 1.HPLC chromatograms of 20 batches of samples

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  表格2 茯苓样品相似度评价

  Table 2.Results of similarity evaluation of Poria cocos

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  图2 茯苓药材与混合对照品溶液的HPLC色谱图

  Figure 2.HPLC of Poria cocos and mixed reference solution

  注：A. 供试品溶液；B. 混合对照品溶液；11. 茯苓新酸B；13. 去氢土莫酸；14. 茯苓新酸A；16. 猪苓酸C；20. 去氢茯苓酸；21. 松苓新酸。

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2.2 正交偏最小二乘法-判别分析

采用正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）对20批茯苓药材进行分组分析，并结合自变量投影重要性指标（variable importance in the projection，VIP）进一步考察各共有峰的差异情况，得分图和VIP结果图分别见图3和图4。得分图显示，20批样品被分为两类：第一类包括S1~S5和S11~S20，均产自安徽、湖北和云南；第二类为S6~S10，均产自贵州。以VIP值大于1.0为标准，共筛选出11个对组间差异贡献较大的成分，对应峰号为2、4、9、11~17和21。其中，已指认的峰11（茯苓新酸B）、峰13（去氢土莫酸）、峰14（茯苓新酸A）、峰16（猪苓酸C）和峰21（松苓新酸）可作为茯苓潜在的Q-Marker，用于茯苓饮片的质量控制。

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  图3 OPLS-DA分析得分图

  Figure 3.Score plot of OPLS-DA

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  图4 OPLS-DA分析VIP图

  Figure 4.VIP plot of OPLS-DA

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2.3 基于网络药理学预测茯苓Q-Marker

2.3.1 成分及靶点的收集

以“茯苓”为关键词，在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中检索并设定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及类药性（drug-likeness，DL）≥0.18的条件，初步筛选获得15个活性成分（表3），并从中获取其相关靶点。同时，通过PubChem数据库收集这些活性成分的Smiles化学式，分别提交至超级增强子数据库（Super Enhancer Archive，SEA，http://sea.bkslab.org/）和瑞士生物信息学研究所（Swiss Institute of Bioinformatics，SIB，http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库进行靶点预测。将所有预测及检索获得的靶点导入UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）进行标准化命名，合并去重后最终得到342个与茯苓活性成分相关的靶点蛋白。

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  表格3 茯苓活性成分基本信息

  Table 3.Basic information on active ingredients in Poria cocos

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2.3.2 蛋白质互作网络分析

将获得的342个靶点蛋白上传至STRING数据库（https://string-db.org/），设定物种为“Homo sapiens”，筛选出263个互作得分（score）＞0.900的靶点。随后，将这些靶点导入Cytoscape 3.2.1软件进行拓扑特征分析，最终筛选出33个度值、介度中心性和接近中心性均高于平均值的靶点作为核心靶点，其中包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）、90  kDa热休克蛋白αA1（hHeat shock protein HSP 90-alpha，HSP90AA1）、MAPK8、MAPK14等，并构建了核心靶点蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络图（图5）。

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  图5 核心靶点PPI

  Figure 5.PPI of core targets

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2.3.3 功能富集分析与通路分析

利用DAVID 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对33个核心靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析。GO分析涵盖生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）3个类别，KEGG分析则用于识别核心靶点所显著富集的信号通路。分析过程中物种及背景均设置为“Homo sapiens”，以P＜0.01为显著性阈值，并按照P由小到大的顺序对富集结果进行排序。

GO富集分析共获得218个GO条目，根据P ＜0.01筛选出92个显著条目，其中包括55个BP条目，主要涉及血管生成、白细胞迁移和蛋白质磷酸化的正调控等；21个MF条目，主要涉及蛋白质结合、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）结合、激酶活性及蛋白酪氨酸激酶活性等；以及16个CC条目，主要涉及质膜、荷叶边膜和膜筏等，具体结果见图6。KEGG富集分析共得到57条显著通路（P＜0.01），其中前20条包括癌症通路、磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-Kinase，PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路、雌激素信号通路、T细胞受体信号通路和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路等（表4），表明这33个核心靶点可能通过上述信号通路参与疾病进程的调控。进一步利用OmicShare平台（https://www.omicshare.com/tools/）对KEGG富集分析结果进行可视化，结果见图7。

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  表格4 前20条信号通路信息表

  Table 4.Information on the top 20 signaling pathways

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  图6 GO富集分析可视化结果

  Figure 6.Visualization results of GO enrichment analysis

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  图7 KEGG信号通路可视化结果

  Figure 7.Visualization results of the KEGG signaling pathway

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2.3.4 “成分-靶点-通路”网络构建

将核心靶点、相关活性成分及前20条信号通路导入Cytoscape 3.2.1软件，经Merge整合构建“成分-靶点-通路”网络（图8）。该网络共包含68个节点，涵盖15个活性成分、33个靶点和20条通路。节点的度值反映其连接数量，度值越高，表明该节点在网络中越关键，越可能为核心化合物或重要靶点蛋白。分析显示，去氢茯苓酸、猪苓酸C、16α-羟基松苓新酸、啤酒甾醇和去氢土莫酸的度值较高，提示其可能是茯苓发挥药效的主要成分，并具备作为茯苓药效关联的潜在Q-Marker的潜力。靶点中MAPK3、PIK3CA、TNF和雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）节点较大，表明茯苓对这些靶点具有较高调控作用，可视为关键靶点。通路节点中，“癌症中的蛋白多糖”“癌症通路”和“PI3K-Akt信号通路”等节点较大，说明这些通路富集的靶点较多，进一步提示茯苓活性成分可能通过调控这些信号通路实现治疗疾病的目的。

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  图8 茯苓成分-靶点-通路网络

  Figure 8.Component-target-pathway network of Poria cocos

  注：红色三角形代表活性成分；黄色圆形代表靶点；蓝色三角形代表通路；边代表相互作用关系。

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2.4 分子对接验证

通过指纹图谱结合化学模式识别分析，确定11号峰（茯苓新酸B）、13号峰（去氢土莫酸）、14号峰（茯苓新酸A）、16号峰（猪苓酸C）和21号峰（松苓新酸）为不同产地茯苓的共有峰，这些成分具有良好的代表性和组间差异性，符合Q-Marker的可测性与溯源性要求；网络药理学研究结果显示，去氢茯苓酸、猪苓酸C、16α-羟基松苓新酸、啤酒甾醇和去氢土莫酸与茯苓的药效密切相关，体现出良好的有效性特征。

通过网络药理学结合指纹图谱与OPLS-DA分析，发现猪苓酸C和去氢土莫酸为共有成分，同时考虑到16α-羟基松苓新酸作为松苓新酸的羟基化衍生物，在结构和性质上具有高度相似性，最终将猪苓酸C、去氢土莫酸、松苓新酸及16α-羟基松苓新酸确定为茯苓的潜在Q-Marker。为验证其可靠性，进一步开展分子对接验证：首先从TCMSP数据库下载潜在Q-Marker的分子结构（mol2格式），并从PDB数据库（https://www1.rcsb.org/）获取关键靶点的配体结构；随后使用PyMol 2.3.4对成分和配体进行加氢、去除水分子和电荷等预处理，再借助AutoDock 4.2软件将各成分与靶点进行分子对接，计算结合能。结合能低于-5 kcal/mol表明该化合物与靶点之间具有良好的结合活性，且结合能越低，结合活性越强。

分子对接结果（表5）显示，4个潜在Q-Marker与关键靶点均表现出良好的亲和力，其结合能均低于-6 kcal/mol。其中，松苓新酸与各靶点的结合能整体最低，表明其潜在作用活性最强；而PIK3CA与各Q-Marker的结合能均低于-8.5 kcal/mol，提示该靶标可能是茯苓多种成分共同发挥药效的关键作用位点。利用PyMol软件对分子对接结果进行可视化，结果见图9。

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  表格5 分子对接结合能测定结果（kcal/mol）

  Table 5.Binding energy of molecular docking (kcal/mol)

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  图9 关键靶点PIK3CA与活性成分的分子对接模式图

  Figure 9.Molecular docking model diagram of the core target PIK3CA and its ligands

  注：A. PIK3CA与16α-羟基松苓新酸；B. PIK3CA与去氢土莫酸；C. PIK3CA与松苓新酸；D. PIK3CA与猪苓酸C。

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3 讨论

近年来，中药指纹图谱结合化学模式识别与网络药理学方法在中药Q-Marker的预测与分析中已得到广泛应用。本研究在建立HPLC指纹图谱过程中发现，在244 nm波长下色谱峰数量较多、特征性显著，因此选定该波长，并对流动相和洗脱程序进行了系统优化，最终确定的色谱条件出峰时间适宜、峰形良好。此外，通过比较不同比例甲醇溶液（50%、70%及纯甲醇）及不同提取时间（15、30、45 min）的效果，结果表明采用甲醇提取30 min时，色谱峰数量较多、峰面积较大且基线稳定。基于所建立的指纹图谱对茯苓化学信息进行整体表征，其相似度均大于0.95，显示不同批次样品间化学成分组成具有较高一致性。结合OPLS-DA分析可将20批茯苓样品分为两类：安徽、湖北和云南产地的样品聚为一类，贵州产样品单独聚为一类，说明不同产地茯苓存在一定质量差异。进一步通过VIP分析发现，茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、猪苓酸C和松苓新酸可能是导致产地差异的标志性成分，这些成分符合Q-Marker的可测性与溯源性要求，可作为茯苓潜在的Q-Marker，为其饮片的质量控制提供依据。

网络药理学筛选结果显示，去氢茯苓酸、猪苓酸C、16α-羟基松苓新酸、啤酒甾醇和去氢土莫酸等度值较高的成分可能是茯苓发挥临床疗效的主要物质基础，符合Q-Marker的有效性原则。茯苓的利尿作用主要与其三萜类成分相关，田婷等[18]研究发现，茯苓皮乙醇提取物具有显著利尿效果，其机制可能与茯苓酸、猪苓酸C、去氢土莫酸和齿孔酸等四环三萜类成分拮抗醛固酮、抑制肾小管对Na⁺的重吸收和K+的排泄有关。在抗炎方面，茯苓活性成分通过多途径发挥作用：Cai等[19]指出29-羟基猪苓酸C和猪苓酸C可通过减少诱导型一氧化氮合酶表达、抑制一氧化氮释放并阻断激活蛋白-1信号通路实现抗炎；啤酒甾醇在脂多糖诱导的巨噬细胞中通过下调MAPK信号、减少促炎细胞因子、失活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和激活蛋白1转录因子，并上调核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor-erythroid factor 2-related factor 2，Nrf2）介导的血红素加氧酶1表达以发挥抗炎作用[20]；去氢土莫酸和茯苓酸则在急慢性炎症模型中表现出剂量依赖性抗炎效果，其机制为抑制磷脂酶A2活性从而减少组胺、血清素等炎症介质释放，且去氢土莫酸因无糖皮质激素样副作用可能更具安全性优势[21]。此外，茯苓三萜酸类成分还具有抗癫痫和镇静作用，可能与上调抑制性神经递质γ-氨基丁酸水平及下调兴奋性神经递质谷氨酸水平相关[22]。倪付勇等[23]发现包括齐墩果酸、猪苓酸C、茯苓酸、去氢茯苓酸、松苓新酸和土莫酸在内的多种茯苓三萜酸类化合物对经典补体激活途径具有不同程度抑制作用。去氢茯苓酸还可通过调节辅助性T细胞（T helper cell，Th）1/Th2平衡影响机体免疫功能，并剂量依赖性地减轻湿疹相关病变[24]。16α-羟基松苓新酸能够通过糖皮质激素受体介导的PI3K/Akt/NF-κB信号通路改善肠道屏障功能[25]。在抗肿瘤方面，猪苓酸C可通过诱导细胞凋亡有效抑制肺癌细胞增殖：一方面通过激活死亡受体介导的外源性凋亡途径直接诱导程序性细胞死亡；另一方面显著抑制PI3K/ Akt信号通路活性，同时增强肿瘤抑制因子p53的磷酸化水平及转录活性，Akt抑制与p53功能协同可能共同参与其凋亡诱导过程[26]。

依据Q-Marker的可测性、溯源性、有效性及特有性筛选原则，本研究整合HPLC指纹图谱、OPLS-DA分析与网络药理学方法，最终确定猪苓酸C、去氢土莫酸、松苓新酸和16α-羟基松苓新酸作为茯苓的潜在Q-Marker。这些成分可能通过作用于MAPK3、PIK3CA、TNF和ESR1等关键靶点，调控癌症通路、PI3K-Akt等信号通路，从而在治疗癌症、利尿、保肝、抗氧化、抗炎及免疫调节等方面发挥药效。MAPK3（又称ERK1）作为MAPK家族成员，在细胞增殖、凋亡和侵袭等多种基本过程中起核心调控作用，其信号通路异常与多种疾病发生相关。ERK1/2参与先天性和适应性免疫系统中的多个信号传导过程，是免疫细胞功能的关键调节因子；直接抑制ERK1/2或其上游调节因子可用于治疗炎症和自身免疫性疾病[27]。此外，ERK信号传导还与阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病密切相关[28]。MAPK/ ERK通路还可通过抑制凝血酶敏感蛋白-1的表达影响血管生成，进而促进肿瘤生长、侵袭和转移[29]。PIK3CA是调控细胞生长、转化、黏附、凋亡、存活和运动的关键因子，在约15%的人类癌症中发生突变，尤其在肝癌、结肠癌和乳腺癌中突变频率较高[30]。该基因还参与肌肉、肝脏和脂肪组织中的胰岛素响应调节[31]。TNF作为一种多效细胞因子，广泛参与机体的炎症与免疫过程，对多种肿瘤细胞具有细胞毒性，并可诱导胰岛β细胞凋亡[32]。目前已有3种TNF抑制剂被批准用于类风湿关节炎的临床治疗[33]。ESR1是乳腺上皮中雌激素作用的主要介质，雌激素暴露是其驱动乳腺癌发展的核心机制之一[34]。同时，ESR1也被认为是骨质疏松的易感基因[35]。

为进一步验证所筛选Q-Marker的有效性，本研究进行了分子对接验证。结果显示，各成分与关键靶点的结合能均低于-6 kcal/mol，表明茯苓潜在Q-Marker与核心靶点之间具有良好的亲和力。结合前述文献药理研究及分子对接结果，可有力证明基于网络药理学与指纹图谱方法筛选出的茯苓Q-Marker具有合理性和可靠性。然而，分子对接作为一种计算机模拟技术，仍存在一定的局限性，后续需通过分子实验或体内实验进行多维度验证，以进一步增强其生物学可信度。

综上所述，猪苓酸C、去氢土莫酸、16α-羟基松苓新酸和松苓新酸这4种成分可作为茯苓的Q-Marker，为其在中药复方制剂研发及药用价值的深入开发提供科学依据。

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