目的  以甜叶菊标准汤剂质量为依据，建立甜叶菊配方颗粒提取工艺设计空间。

方法  制备15批甜叶菊标准汤剂并测定出膏率、甜菊苷提取量以及新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸总提取量。通过层次分析-熵权法确定各指标的权重系数，计算标准汤剂的综合评分。以综合评分作为关键质量属性，以浸泡时间、提取时间、加水倍数为关键工艺参数，利用Box-Behnken设计对甜叶菊配方颗粒提取工艺进行优化，建立设计空间。对模型准确性、工艺稳定性、工艺适用性进行验证。

结果  15批甜叶菊标准汤剂的综合评分范围为56.77~98.30，平均值为78.03。建立的甜叶菊配方颗粒提取设计空间为浸泡时间10~30  min、加水倍数11~12倍，提取时间45~55 min。3个验证点的综合评分为85.24、85.19、88.25分，且同个验证点的重复性良好。不同批次甜叶菊饮片经过设计空间内的工艺参数进行提取，综合评分也得到较好提升。

结论  所建立的设计空间能够保证甜叶菊提取工艺的稳定性，为制备与标准汤剂具有一致性的配方颗粒提供参考思路。

甜叶菊又名甜菊、甜草、甜茶，是菊科植物甜叶菊Stevia rebaudiana（Bertoni）Hemsl.的干燥叶，具有生津止渴、养阴潜阳的功效，主治消渴、头晕[1]。现代研究表明，甜叶菊富含糖苷类、绿原酸类、黄酮类、多酚类、生物碱等多种功能性成分，在降血糖、降血脂、辅助治疗糖尿病等方面效果明显，可作为中草药或天然药物被开发利用[2-5]。同时也因其成分甜菊糖苷含量高、热量低，是一种广受欢迎的天然甜味剂[6]。

甜叶菊配方颗粒是甜叶菊经提取、浓缩、干燥、制粒工艺制备而成的新型配方制剂。甜叶菊配方颗粒的物质基础应与以中医理论为指导、临床应用为基础，经标准化工艺制备而成的甜叶菊标准汤剂具有一致性。其提取工艺等各环节的优化应以标准汤剂的出膏率、有效成分含量范围为依据[7-8]。在现有的研究中，标准汤剂的质量属性多用于指导配方颗粒质量标准的建立，对工艺的具体指导思路较为少见[9-10]。本研究将制备15批甜叶菊标准汤剂，测定出膏率，甜菊苷提取量，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸总提取量，通过层次分析-熵权法确定各指标的权重系数，计算综合评分。以标准汤剂的综合评分作为甜叶菊配方颗粒的关键质量属性，利用Box-Behnken设计对甜叶菊配方颗粒提取工艺进行优化，建立能够体现与标准汤剂具有一致性的设计空间。

1 材料

1.1 主要仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技）；BT-125D型十万分之一电子天平（德国赛多利斯）；AE200型万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多）；30B²型煎药壶（康雅顺电器有限公司）；TC-15型恒温电热套（海宁市华星仪器厂）；RE-52CS-1型旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司）；LGJ-10C型冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）；DL-480E型超声波清洗器（苏州江东精密仪器有限公司）；HHS-21-8型电热恒温水浴锅（上海添时科学仪器有限公司）；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海捷呈实验仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

新绿原酸（批号：ST06230120，纯度98.0%）和隐绿原酸（批号：ST07850120，纯度98.0%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；绿原酸（批号：110753-201716，纯度96.8%）和甜菊苷（批号：111515-202104，纯度93.2%）购自中国食品药品检定研究院；甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

15批甜叶菊（批号：2022033001~ 2022033005，产地：安徽省滁州市；批号：2022033006~2022033010，产地：福建省顺昌县；批号：2022033011~2022033015，产地：湖南省安乡县）经浙江景岳堂药业有限公司孙立恩副主任中药师鉴定为菊科植物甜叶菊Stevia rebaudiana（Bertoni）Hemsl.的干燥叶，按2015年版《浙江省中药炮制规范》检测合格。

2 方法与结果

2.1 甜菊苷的含量测定

2.1.1 色谱条件

采用Chrom Core AR C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸溶液（75  ∶  25）为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为205 nm。理论板数按甜菊苷峰计算应不低于3 000[11]。

2.1.2 对照品溶液的制备

取甜菊苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每mL含0.40 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取甜叶菊适量（冻干粉），研细，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率：250  W，频率：40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 系统适用性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与空白溶剂（70%乙醇），按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图1）。结果显示甜菊苷色谱峰分离度良好，溶剂对含量测定无影响，专属性符合要求。

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  图1 甜菊苷含量测定的HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatogram of content determination of steviol glycoside

  注：A. 对照品；B. 供试品；C. 空白溶剂；1.甜菊苷。

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2.1.5 线性考察

配制浓度为41.12、205.60、411.20、616.80、822.40 μg/mL的甜菊苷系列浓度的对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以甜菊苷浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算得线性回归方程为：Y=0.061  9X+0.315 7（r=0.999 9）。结果表明甜菊苷在41.12~822.40 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.1.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，计算得甜菊苷峰面积的RSD为0.17%（n=6），结果表明该仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验

将供试品溶液分别于室温放置0、1、2、4、8、12、18、24 h后，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算得甜菊苷峰面积的RSD为0.41%（n=8），结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验

取同一批样品6份，精密称取0.1 g，按“2.1.3”制成供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算得甜菊苷的平均含量为213.0 mg/g，RSD为0.61%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.1.9 回收率试验

精密称取样品6份，每份约0.05 g，置具塞锥形瓶中，分别精密移取相对应成分质量的对照品母液，再依法制成回收率试验供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算得甜菊苷的平均回收率为100.6%，RSD为0.87%（n=6），结果表明该方法准确度良好。

2.2 新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的总含量测定

2.2.1 色谱条件

采用Agilent Ecllpse Plus C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1%磷酸溶液（A）-甲醇（B）为流动相，按0~30 min、80%~75% A进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为325 nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3  000[12]。

2.2.2 对照品溶液的制备

取新绿原酸对照品、绿原酸对照品、隐绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇分别制成每mL含116.40、135.40、127.70 μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取甜叶菊适量（冻干粉），研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率：250  W，频率：40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 系统适用性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与空白溶剂（50%甲醇），按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图2）。结果显示溶剂对含量测定无影响，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸色谱峰分离度良好。

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  图2 新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸总含量测定的HPLC色谱图

  Figure 2.HPLC chromatogram of total content determination of neochlorogenic acid, chlorogenic acid and cryptochlorogenic acid

  注：A. 对照品；B. 供试品；C. 空白溶剂；1. 新绿原酸；2. 绿原酸；3. 隐绿原酸。

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2.2.5 线性考察

配制新绿原酸浓度为11.64、58.22、116.4、174.60、232.90 μg/mL，绿原酸浓度为13.54、67.72、135.40、203.20、270.90 μg/mL，隐绿原酸浓度为12.77、63.86、127.70、191.60、255.40  μg/ mL的系列对照品混合溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以对照品浓度为横坐标（X， μg/ mL）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算得新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸线性回归方程分别为：Y=0.531 3X+0.664 9（r=0.999 9）、Y=0.521  9X+0.710 1（r=0.999 9）、Y=0.500 9X+0.665 8（r=0.999  9）。结果表明新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸分别在11.64~232.90、13.54~270.90、12.77~255.40 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.2.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算得新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸峰面积的RSD分别为0.49%、0.47%、0.48%（n=6），结果表明该仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验

将供试品溶液分别于室温放置0、1、2、4、8、12、18、24 h后，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸峰面积的RSD分别为0.27%、0.17%、0.44%（n=8），结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验

取同一批样品6份，精密称取0.1 g，按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的平均含量为5.3、12.6、5.9 mg/g，平均总含量为23.8 mg/g，RSD为0.75%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.2.9 回收率试验

精密称取样品6份，每份约0.05 g，置具塞锥形瓶中，分别精密移取相对应成分质量的对照品母液，再依法制成回收率试验供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的平均回收率分别为94.6%、97.5%、93.7%，RSD分别为0.62%、0.91%、1.62%（n=6），结果表明该方法准确度良好。

2.3 出膏率的测定

精密量取甜叶菊药液10 g，置于已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，烘箱105 ℃下干燥至恒重，计算出膏率：mW/（10M）×100%，其中m为10  g药液中干浸膏质量，W为总药液质量，M为饮片投料质量。

2.4 甜叶菊标准汤剂综合评分的计算

2.4.1 15批甜叶菊标准汤剂的制备

依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，结合国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》（国中医药发〔2009〕3号文），综合考虑甜叶菊药性、药用部位、质地，最终确定甜叶菊标准汤剂制备方法如下：取甜叶菊饮片100 g，加水煎煮2次，第1次加12倍水，浸泡30 min，煎煮30 min，第2次加10倍水，煎煮20  min；趁热过滤（200目筛网），合并2次滤液，65 ℃减压浓缩至约100 g；取适量测定出膏率；剩余浓缩液冷冻干燥，用于测定指标成分含量。

2.4.2 评价指标权重系数的赋予

①层次分析法。运用层次分析软件Yaahp V12.9.8167对各指标进行层次分析。甜菊苷属于糖苷类成分，含量高，将其提取量作为第一重要测定指标；新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸均属于酚酸类成分，含量次于糖苷成分，故作为第二重要测定指标；出膏率可判断制备工艺稳定性，反映总体成分信息，但并非越高越好，出膏率过高会导致制剂成型困难，故作为第三重要测定指标。将3个指标分成3个层次，先后次序为甜菊苷提取量＞新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸总提取量＞出膏率，依据层次分析法理论1-9标度法[13]，对各指标进行两两比较，对相对重要程度进行打分，构建判断矩阵，具体见表1。

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  表格1 甜叶菊各指标的判断矩阵表

  Table 1.The judgment matrix table for various indicators of Folium stevia

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按几何平均法计算各指标的权重系数，甜菊苷提取量，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸总提取量，出膏率的权重系数分别为0.581 6、0.309 0、0.109 5。对计算得的各个权重系数进行一致性检验，CR=CI/RI=0.003 6，其中CI为一致性指标，RI为随机一致性指标，CR为一致性比率，CR小于0.1说明通过一致性检验，无逻辑性错误，所计算得的权重系数具有科学性。

②熵权法[14]。运用客观评价辅助软件Eva Gear V2.7552，采用“标准0-1变换-效益型”对15批甜叶菊标准汤剂测定结果进行标准化处理，采用信息熵权法对各指标进行赋值，结果为甜菊苷提取量，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸总提取量，出膏率的权重系数分别为0.337 0、0.300  3、0.362 7。

③层次分析-熵权法[15]。将主观权重与客观权重综合考虑，依据公式1计算综合权重系数，结果为甜菊苷提取量，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸总提取量，出膏率的综合权重系数分别为0.596 6、0.282 5、0.120 9。

其中C_i为层次分析法所得权重系数；Q_i为熵权法所得权重系数；n为指标个数。

④综合评分计算：依据公式2计算15批甜叶菊标准汤剂的综合评分。

其中X_i为某个指标的测定值；X_i-max为某个指标的最大测定值；W_i-综合为某个指标的综合权重系数；n为指标个数。

2.4.3 甜叶菊标准汤剂的出膏率与含量测定结果

15批甜叶菊标准汤剂出膏率结果、甜菊苷提取量以及饮片中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸总提取量结果见表2。根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，以70%~130%平均值作为标准汤剂的变异可接受范围，甜菊苷提取量为63.04~117.08 mg/ g，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸总提取量为4.98~9.24 mg/g，出膏率为27.06%~50.25%，综合评分在54.62~101.44分。

2.5 甜叶菊配方颗粒提取工艺设计空间的建立

2.5.1 Box-Behnken设计优化提取工艺

以综合评分较为接近平均值的甜叶菊饮片（批号：2022033015）为研究对象，根据前期研究结果，选择浸泡时间A（10、30、50  min）、加水倍数B（8、10、12倍）、提取时间C（20、40、60 min）作为影响因素，提取次数为2次，过滤目数为200目。基于15批甜叶菊标准汤剂测定结果以及层次分析-熵权法所得综合权重系数，以综合评分（Y）作为评价指标。采用Design-Expert.V8.0.6软件，进行Box-Behnken试验设计，优化甜叶菊配方颗粒提取工艺，设计方案与结果见表3，方差分析见表4。各工艺参数对综合评分的三维响应面图见图3。

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  表格2 甜叶菊标准汤剂的质量属性与综合评分

  Table 2.The quality attributes and comprehensive evaluation of Folium stevia

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  表格3 Box-Behnken试验设计方案及综合评分

  Table 3.The plan and comprehensive evaluation of Box Behnken experimental design

  注：综合评分计算所代入的Xi-max为标准汤剂中各指标的最大值。

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  表格4 Box-Behnken试验的回归模型方差分析

  Table 4.The analysis of variance of regression model for Box-Behnken experiment

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  图3 各工艺参数的三维响应面

  Figure 3.The 3D response surface diagram of various process parameters

  注：A. 加水倍数与浸泡时间；B. 浸泡时间与提取时间；C. 加水倍数与提取时间。

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甜叶菊提取工艺模型的回归方程为Y=-

4.330 8+0.480 4A+11.535 6B+0.218 3C-0.026 0AB+0.002 1AC+0.038 2BC-0.005 8A²-0.528B²-0.003 6C²。模型的显著性检验P ＜0.000 1；R²=0.994 5；R_adj²=0.987 4；失拟项P＞0.05，表明模型拟合程度高。结果分析对综合评分影响程度是提取时间＞加水倍数＞浸泡时间，其中提取时间与加水倍数对综合评分的交互性影响较为明显。模型的优选条件为浸泡时间25 min、加12倍水、提取时间60 min，最优综合评分为89.4。

2.5.2 甜叶菊提取工艺设计空间

浸泡时间是对甜叶菊提取工艺影响最小的因素，在10~30 min时，对加水倍数与提取时间的设计空间基本不影响。现以浸泡时间25 min作为定值，建立加水倍数与提取时间的提取工艺设计空间，选择综合评分大于15批标准汤剂综合评分平均值（78.03）作为设计目标最低值，同时加入置信水平α=0.25的置信区间。优化的设计空间通过Overlay plot图展示（图4）。亮黄色部分是甜叶菊提取工艺优化后的设计空间，绿色部分是方便操作而进一步优选的设计空间，即加水倍数为11~12倍，提取时间为45~55 min。

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  图4 提取工艺的设计空间

  Figure 4.The design space for extraction process

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2.5.3 设计空间的验证试验

取批号为2022033015的甜叶菊饮片，选取设计空间内3个优选点，平行制备2次并测定，进行模型准确性验证试验，结果见表5。3个优选点实际值的综合评分能够满足要求，且与理论综合评分的相对误差小于2%，说明设计空间可靠，模型预测功能较好。

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  表格5 设计空间内操作点的验证实验结果

  Table 5.The verification experiment results of operating points in design space

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取批号为2022033015的甜叶菊饮片，以浸泡时间25 min、加水倍数12、提取时间50 min为参数进行提取，平行操作6次并测定，进行工艺稳定性验证。该工艺下的平均出膏率为41.34%，RSD为0.95%（n=6）；甜叶菊提取量为106.11 mg/g，RSD为2.16%（n=6）；新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸总提取量为7.19 mg/g，RSD为0.91%（n=6）；综合评分为87.22分，RSD为1.47%（n=6），结果表明该工艺的稳定性良好。

选择标准汤剂综合评分相对处于低、中、高水平的3批不同产地的甜叶菊饮片（批号：2022033002、2022033008、20220330011），浸泡25 min、加12倍水，提取50 min，平行操作2次并测定，进行工艺适用性验证，结果见表6。结果表明该工艺的适用性良好，不同产地批次的综合评分均满足要求。

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  表格6 甜叶菊提取工艺适用性的验证实验结果

  Table 6.The validation experiment results on the applicability of Folium stevia extraction process

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2.6 甜叶菊配方颗粒的制备与测定

制备3批甜叶菊配方颗粒，取甜叶菊饮片（批号：2022033015）2 000 g，加水煎煮（浸泡25  min、提取2次、加12倍水、提取50 min），滤过，滤液浓缩成清膏，加入辅料麦芽糊精适量，干燥，再加辅料适量，制粒，制成1 000 g，即得。3批甜叶菊配方颗粒甜菊苷含量分别为191.2、197.4、184.7 mg/g，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸总含量分别为11.3、12.5、13.1 mg/g。

3 讨论

3.1 标准汤剂评价指标的选择

目前，《中国药典（2020版）》尚未收载甜叶菊，2015年版《浙江省中药炮制规范》《浙江省药材标准》中也仅对甜叶菊的来源、性状、鉴别作了规定，未对相关指标成分进行含量测定。甜叶菊中糖苷类、酚酸类成分已明确为功能性成分。赵向阳等[16]对甜叶菊药材进行了质量提升研究，采用HPLC法测定了甜菊苷和莱苞迪苷A的含量。张民达等[17]建立了一测多评法测定甜叶菊中6种绿原酸类成分的含量。甜菊苷属于糖苷类的主要成分，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸3种成分含量占了酚酸类的较大比例。因此本研究通过分别测定甜菊苷含量，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸3种酚酸类成分的总含量以及出膏率，从糖苷类、酚酸类、出膏率3个方面评价甜叶菊标准汤剂的质量水平。由于甜叶菊受产地、季节、炮制等影响，差异较大，多批次标准汤剂的指标成分含量和出膏率超出均值±10%，各指标RSD均超过20%，故以70%~130%平均值作为标准汤剂的变异可接受范围。

3.2 综合评分的计算

应对出膏率、甜菊苷和新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸含量进行科学的综合评价，从而整体体现甜叶菊标准汤剂的质量，以及作为甜叶菊配方颗粒提取工艺的优化指标。层次分析法属于主观赋权法，基于研究者合理主观判断，经过数学方法处理使之科学量化，并对权重进行一致性检验，排除逻辑性错误。熵权法属于客观赋权法，通过熵值判断指标的离散程度，离散程度越大，表明该指标对综合评价影响越大，权重系数应越大[18]。层次分析法结合熵权法的综合评分则是将主观权重与客观权重综合考虑，经过分析后，甜叶菊标准汤剂出膏率、甜菊苷提取量及新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸总提取量的权重分别为0.596 6、0.282  5、0.120 9。

3.3 标准汤剂对提取工艺设计空间的指导

通过试验设计与数学模型建立关键质量属性与关键工艺参数两者的相关性，依据设定的关键质量属性目标，可以建立关键工艺参数的设计空间[19]。将依据甜叶菊标准汤剂计算出的权重系数应用于甜叶菊提取工艺Box-Behnken试验综合评分的计算中，再将标准汤剂的综合评分优选范围作为提取工艺设计空间的关键质量属性目标。最终以大于标准汤剂综合评分平均值（78.03分）作为综合评分目标范围，代表甜叶菊标准汤剂的中偏上水平。建立的甜叶菊配方颗粒提取设计空间为：浸泡时间10~30 min、加水倍数11~12倍，提取时间45~55 min。

3.4 提取工艺的验证试验

本研究的验证设计分为3个部分：一是模型的验证，取2022033015批次，选择设计空间内不同工艺点，设计空间内3个验证点的综合评分（85.24、85.19、88.25分）优于标准汤剂综合评分平均值，实际综合评分与理论综合评分的相对误差均小于2%。二是工艺稳定性的验证，取2022033015批次，取同一个工艺点，进行6次重复试验，各指标RSD均小于3%。三是工艺适用性的验证，分别选择了3批不同产地的饮片，其中2022033002批次属于安徽，处于标准汤剂综合评分较低水平；2022033008批次属于福建，处于中等水平，2022033011批次属于湖南，处于较高水平。适用性验证试验采用质量不一的饮片，故3批验证结果综合评分离散度大，但提取综合评分相比标准汤剂综合评分均有所提高。表明不同批次甜叶菊饮片经过设计空间内的工艺参数进行提取，综合评分能达到较好的提升，低水平饮片地有效成分也能得到充分提取，接近标准汤剂综合评分中心值，利于制备成高质量的配方颗粒。

3.5 小结

本研究通过层次分析-熵权法对甜叶菊标准汤剂进行科学的综合评价，以标准汤剂的综合评分作为甜叶菊配方颗粒提取工艺设计空间的指导原则。所建立的设计空间不仅充分体现了标准汤剂的质量属性，而且能保证甜叶菊提取工艺的稳定性和适用性，为制备与标准汤剂具有一致性的中药配方颗粒提供思路。

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