目的  比较黏度法、分子排阻色谱-示差折光检测器联用（SEC-RI）与分子排阻色谱-示差折光-多角度激光散射检测器联用（SEC-RI-MALLS）3种方法测定玻璃酸钠滴眼液中玻璃酸钠分子量的优缺点。

方法  分别采用这3种方法测定玻璃酸钠滴眼液中玻璃酸钠的重均分子量（Mw），采用SEC-RI法与SEC-RI-MALLS法测定分子量分布[Mw/数均分子量（Mn）]。

结果  SEC-RI法、黏度法与SEC-RI-MALLS法测定3批玻璃酸钠Mw分别为365 359~367 508、918 593~938 397、987 300~1 003 000 g/mol。

结论  SEC-RI法测定得到的玻璃酸钠Mw偏小，而黏度法与SEC-RI-MALLS法的测定结果较为接近，且SEC-RI-MALLS法不依赖于对照品，操作简便、快速，还可同时反映出玻璃酸钠的Mw与Mw/Mn等参数，适用于玻璃酸钠滴眼液中玻璃酸钠的检测。

玻璃酸钠滴眼液属于人工泪液的一种，对改善干眼症不适症状效果显著[1-3]，主要成分是透明质酸钠。其制备方式主要有2种：一是运用细菌发酵工艺获取；二是从公鸡鸡冠中进行提取。在玻璃酸钠的众多理化参数里，分子量及其分布极为关键，这一因素会直接影响药物的安全性和有效性[4-5]。

玻璃酸钠在《日本药典》（JP18）[6]、《欧洲药典》（EPI1.0）[7]以及我国的国家药品标准WS1-(X072) 2011Z[8]中均有收载。在国家药品标准WS1-(X072) 2011Z中采用分子排阻色谱-示差折光检测器联用（size exclusion chromatography-refractive index detector，SEC-RI）法以聚苯乙烯磺酸钠为对照品进行测定。然而，聚苯乙烯磺酸钠和玻璃酸钠在结构上有较大差异，致使测定结果难以体现玻璃酸钠的真实分子量。在JP18中采用黏度法以乌氏粘度计来测定特性黏数（[η]），进而折算出玻璃酸钠的分子量。而《英国药典》（BP2024）与EP11.0同样采用黏度法，仅针对玻璃酸钠的[η]进行测定。

对比黏度法、SEC-RI法与SEC-RI-多角度激光散射检测器联用（SEC-RI-refractive index detector-multi-angle laser light scattering，SEC-RI-MALLS）法的优劣，黏度法在实际操作中存在诸多弊端，如试验时容易产生气泡、试验结果重复性欠佳、受主观因素干扰明显，且无法提供分子量分布[重均分子量（weight-average molecular weight，Mw）/数均分子量（number-average molecular weight，Mn）]相关信息等[9-10]。SEC- RI法在《中国药典（2020年版）》二部[11]中收录于部分品种测定项下，如右旋糖苷20与右旋糖苷40的分子量与分子量分布的测定等，使用时需寻找分子量大小契合且结构一致的对照品，但通常大分子对照品不仅稳定性差，且获取难度也较大[12]。SEC-RI-MALLS法融合了色谱法与光散射法的优势。该技术无需标准品即能迅速、精准地测定高分子的绝对Mw、Mw/Mn以及分子构象等物理参数[13-14]。SEC-RI-MALLS法能更全面地展现玻璃酸钠的结构特性，为药品质量控制工作提供关键的技术支撑。

本文对玻璃酸钠滴眼液在黏度法、SEC-RI法以及SEC-RI-MALLS法这3种方法的优缺点进行了对比分析，为提升该品种分子量测定标准提供有力参考。

1 材料

1.1 主要仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司），DAWN HELEOS-II 多角度激光光散射仪和OptilabT-rEX 示差检测器（美国Wyatt公司）；e2695高效液相色谱仪和2414示差检测器（美国Waters 公司）；XPE26电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；乌氏黏度计（沈阳市兴亚石油玻璃仪器厂，毛细管内径：0.6 mm）。

1.2 主要药品与试剂

葡聚糖对照品（英国Malvern公司，Mw：66  710 g/mol，批号：X0607，规格：23.58 mg/支）；牛血清白蛋白对照品（德 国Sigma公司，Mw：66  450 g/mol，批号：90484608）；聚苯乙烯磺酸钠对照品（北京硅谷同创科技有限公司，Mw：6 600  000 g/mol，批号：PSS6.2M；Mw：3 330  000  g/ mol，批号：PSS3.2M；Mw：1 890  000  g/mol，批号：PSS2M；Mw：876  000  g/ mol，批号：PSS1M；Mw：679  000  g/ mol，批号：PSS600K；Mw：258  000  g/ mol，批号：PSS280K）；硝酸钠（天津市大茂化学试剂厂，批号：20210501）；叠氮化钠（浙江菱湖精细化工厂，批号：20130108）；某企业提供的3批玻璃酸钠滴眼液（批号：220914、220915、220916）。

2 方法与结果

2.1 黏度法

2.1.1 供试品溶液的配制

按JP18方法进行测定[6]。取玻璃酸钠滴眼液10支，混匀，精密量取25 mL，置50 mL量瓶中，用0.2 mol/L氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.2 测定方法

采用乌氏黏度计，在（30.0±0.1）℃条件下分别测定0.2 mol/L氯化钠溶液的流出时间（T0）与供试品溶液的流出时间（T）。所有测试采用同一黏度计，不重装试样，重复测定3次。在装样过程中要确保缓慢倒入，避免剧烈摇晃，同时润洗毛细管，以上步骤能减少气泡产生。若操作过程中产生气泡采用超声波法对气泡进行消除。按下式计算[η]：

式中相对黏度（ηr）=T/T₀，增比黏度（ηsp）= ηr-1，C为供试品溶液的浓度（g/100 mL），本品密度为1.008。结果见表1。

• 
  表格1 3种测定方法的比较

  Table 1.Comparison of the three assay methods

  

2.2 SEC-RI法

2.2.1 色谱条件

按国家药品标准WS1-(X072)2011Z中SEC- RI法进行测定[7]。采用SB-806 HQ色谱柱，以0.2  mol/L氯化钠溶液为流动相，柱温为35℃，流速为0.5 mL/min，进样体积为100 μL。

2.2.2 溶液配制

分别精密称取聚苯乙烯磺酸钠对照品（Mw分别为258 000、679 000、876 000、1 890 000、3 330 000、6 600 000 g/mol）适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液各5 mL，置于50 mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。供试品溶液配制方法同“2.1.1”项。对照品溶液与供试品溶液同时放置过夜。

2.2.3 溶液测定

采用SEC-RI对溶液进行测定，并采用凝胶渗透色谱（gel phermeation chromatograph，GPC）软件进行普适校正计算线性回归方程。Mark-Houwink方程是用于描述高分子稀溶液[η]与分子量之间关系的经验方程，即lg[η]=lgK+αlgM。式中，M表示高分子物质分子量，K和α是与高分子-溶剂体系及温度有关的常数，其中K称为比例常数，反映高分子链在溶液中的尺寸和形态特征，α称为扩张因子，可用于判断高分子链在溶液中构象，α=0.5时，表明高分子为无规线团构象；α=1时，说明高分子链在溶液中接近刚性伸直链构象；α介于0.5~1时高分子链处于不同程度的扩张状态。国家药品标准WS1-(X072)2011Z中聚苯乙烯磺酸钠对照品的K为0.00018，α为0.65。玻璃酸钠的K为0.00 057，α为0.75[7]。由回归方程计算出供试品的分子量Mw与Mw/Mn。

2.2.4 测定结果

当采用5种聚苯乙烯磺酸钠（Mw分别为258  000、679 000、876 000、1 890 000、3 330 000 g/mol）为对照品时，由GPC 软件进行普适校正计算得线性回归方程：Y=- 0.638X+ 1.62，r=0.992 6＞0.990 0，符合《中国药品检验标准操作规范》[14]下SEC法的系统适用性要求。而采用6种聚苯乙烯磺酸钠（Mw分别为258  000、679  000、876 000、1 890 000、3 330 000、6 600  000 g/mol）为对照品时，玻璃酸钠供试品溶液主峰的保留时间为15.3 min，对照品的出峰时间在16.0~20.4 min范围内，具体见图1。得到的线性方程：Y=-1.49X+2.96，r=0.971  7 ＜0.990  0，不符合《中国药品检验标准操作规范》[14]下SEC法的系统适用性要求。因此采用5种聚苯乙烯磺酸钠为对照品，3批玻璃酸钠滴眼液的测定结果见表1。

• 
  图1 SEC-RI色谱图

  Figure 1.SEC-RI chromatogram

  注：1. 玻璃酸钠供试品；2. 聚苯乙烯磺酸钠对照品（从左至右依次为6  600 000、3 330 000、1 890 000、876 000、679 000、258 000 g/mol）。

  

2.3 SEC-RI- MALLS法

2.3.1 色谱条件

以SB-806 HQ为色谱柱，0.1 mol/L硝酸钠溶液为流动相，柱温为40℃，流速为0.5 mL/min，进样体积为100 μL。

2.3.2 溶液配制

精密称取葡聚糖对照品适量，加0.1 mol/L硝酸钠溶液溶解并定量稀释制成每1 mL含2 mg的溶液，室温放置过夜，作为系统适用性溶液。

精密量取玻璃酸钠滴眼液适量，加0.1 mol/L硝酸钠定量稀释制成每1 mL含0.2 mg的供试品溶液。

2.3.3 溶液测定

采用SEC-RI-MALLS进行测定并采用Astra 5.3.4软件进行计算，葡聚糖的折光指数增量dn/ dc值为0.138，葡聚糖的测定值与其标示量的Mw比值应在0.85~1.15之间。玻璃酸钠的折光指数增量dn/dc值为0.170（企业提供数据），计算玻璃酸钠的Mw、Mw/Mn，获得玻璃酸钠的分子量分布与分子构相。

2.3.4 测定结果

采用牛血清白蛋白对多角度激光散射仪进行校正；采用葡聚糖对校正后的仪器进行验证，葡聚糖的Mw为6.728×10⁴（±0.373%），葡聚糖的Mw测定值/Mw标示量为1.01，系统适用性良好，可进行后续样品的测定，葡聚糖90°角的光散信号见图2。

• 
  图2 葡聚糖验证测定色谱图

  Figure 2.Dextran validation assay chromatogram

  

3批玻璃酸钠滴眼液的测定结果见表1。取同一样品（批号：220914）制备供试品溶液6份，按“2.3.1”项下色谱条件测定其重复性，Mw的平均值为9.98×10⁵ g/mol，RSD为1.1%（n=6）；Mw/Mn的平均值为1.4，见表2和图3。当光散射拟合模式采用Zimm时，MALLS峰尖处的多角度拟合曲线的的线性良好，Fit R²=0.999 0，见图4。玻璃酸钠的分子量分布在2.6×10⁵~3.2×10⁶之间，见图5。分子构象图中Mw与均方根半径（rm radius）的斜率为0.56，可判断玻璃酸钠在流动相中的分子构相为无归线团，见图6。

• 
  表格2 玻璃酸钠滴眼液样品重复性试验结果

  Table 2.Repeatability test results of sodium hyaluronate eye drops samples

  

• 
  图3 玻璃酸钠滴眼液样品测定色谱图

  Figure 3.Determination chromatogram of sodium hyaluronate eye drops sample

  

• 
  图4 玻璃酸钠滴眼液MALS峰尖处的角度拟合曲线

  Figure 4.Angular fitting curve at the tip of the MALS peak of sodium hyaluronate eye drops

  

• 
  图5 玻璃酸钠滴眼液Mw/Mn结果

  Figure 5.Mw/Mn results of sodium hyaluronate eye drops

  

• 
  图6 玻璃酸钠滴眼液分子构相图

  Figure 6.Molecular composition and phase diagram of sodium hyaluronate eye drops

  

3 讨论

3.1 测定方法的差异​

采用不同测定方法，玻璃酸钠Mw的测定结果存在显著差异。黏度法与SEC-RI-MALLS法的Mw测定值较为接近，而SEC-RI法的测定结果明显偏低。黏度法仅能测定Mw，无法反映样品的分子量分布参数（如Mw/Mn），在表征样品特性上存在局限性。​

3.2 SEC-RI法的局限性​

SEC-RI法采用国家药品标准WS1-(X072)-2011Z时，需以聚苯乙烯磺酸钠为对照品进行折算[8]。然而，聚苯乙烯磺酸钠对照品的相对分子质量范围较窄，无法完全覆盖玻璃酸钠样品的分子量区间。根据《中国药典（2020 年版）》四部“9101方法验证指导原则”[15]，对照品的线性范围应覆盖待测样品，超出该范围可能不呈线性关系。本试验测定结果也证实，延长聚苯乙烯磺酸钠对照品的线性范围后，对照品不再呈现线性关系。此外，聚苯乙烯磺酸钠与玻璃酸钠的化学结构差异显著，本试验及相关研究均表明，这种结构差异会引入较大测定误差，导致 SEC-RI 法测定值偏小[16-17]。​

3.3 SEC-RI-MALLS法的优势

SEC-RI-MALLS法不仅可测定Mw，还能同步获取Mw/Mn范围及分子构象等关键参数。其中，Mw/Mn对表征高聚物“纯度”具有重要意义，高聚物纯度越高，其Mw/Mn值越趋近于1。基于其多维表征能力，在3种方法中，SEC-RI-MALLS法成为测定玻璃酸钠分子量的最佳选择。但在实际测定中，样品配制浓度对该方法的准确性影响显著。浓度过高会使溶液黏度过大，导致分子量测定结果偏低；浓度过低则检测信号变差，结果易受干扰。本研究通过对比不同浓度下的测定结果及方法学验证，最终确定0.2 mg/mL为最适宜的样品配制浓度。​

3.4 SEC-RI-MALLS 法的局限性

SEC-RI-MALLS 法也存在一定局限性，仪器成本高昂，操作需专业人员。检测器的测量角度、分辨率等参数设置不当，易引发测量误差。在测定低分子量物质时，噪音干扰尤为明显，严重影响测量准确度，降低噪音成为关键优化方向[18]。

3.5 标准改进建议

目前，现行分子量测定标准中仍有大部分采用SEC-RI法，使用结构差异较大的标准品校正供试品分子量，如羟乙基淀粉等[19]。而光散射法作为无需对照品的绝对分子量测定方法，结果直接关联样品dn/dc等参数[20]。SEC-MALLS联用法已被《美国药典》《欧洲药典》等多国法典列为分子量控制的推荐标准方法[21-22]。基于以上情况，建议采用SEC-RI-MALLS法提升玻璃酸钠滴眼液的质量标准。

1.Gomes JAP, Santo RM. The impact of dry eye disease treatment on patient satisfaction and quality of life: a review[J]. Ocul Surf, 2019, 17(1): 9-19. DOI: 10.1016/j.jtos.2018.11.003.

2.Pinto-Fraga J, de la Rosa AL, Arauzo FB, et al. Efficacy and safety of 0.2% hyaluronic acid in the management of dry eye disease[J]. Eye Contact Lens, 2017, 43(1): 57-63. DOI: 10.1097/ICL.0000000000000236.

3.Becker LC, Bergfeld WF, Belsito DV, et al. Final report of the safety assessment of hyaluronic acid, potassium hyaluronate, and sodium hyaluronate[J]. Int J Toxicol, 2009, 28 (4 Suppl): 5-67. DOI: 10.1177/1091581809337738.

4.Cyphert JM, Trempus CS, Garantziotis S. Size matters: molecular weight specificity of hyaluronan effects in cell biology[J]. Int J Cell Biol, 2015, 2015: 563818. DOI: 10.1155/2015/563818.

5.Marcellin E, Steen JA, Nielsen LK. Insight into hyaluronic acidmolecular weight control[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(16): 6947-6956. DOI: 10.1007/s00253-014-5853-x.

6.JP18-XVIII[S]. 2021: 1710-1711.

7.EP11.0[S]. 2023: 3993-3994.

8.国家食品药品监督管理局. 国家药品标准WS1-(X072)2011Z 玻璃酸钠[S]. 2011.

9.袁俊杰, 袁华. 黏度法测聚合物分子量实验的一些细节问题[J]. 当代化工, 2024, 53(10): 2505-2510. [Yuan JJ, Yuan  H. Some detailed issues in the experiment of measuring polymer molecular weight by viscosity method[J]. Contemporary Chemical Industry, 2024, 53(10): 2505-2510.] DOI: 10.13840/j.cnki.cn21-1457/tq.2024.10.024.

10.宋奇奇, 刘颖, 原琳, 等. 黏度法测定聚合物相对分子质量的改进[J]. 山东化工, 2019, 48(7): 160-161, 163. [Song QQ, Liu Y, Yuan L, et al. Improvement of determination of polymer molecular weight by viscosity method[J]. Shandong Chemical Industry, 2019, 48(7): 160-161, 163.] DOI: 10.19319/j.cnki.issn.1008-021x.2019.07.068.

11.中国药典2020年版. 二部[S]. 2020: 201-203.

12.邹剑, 杨蕾, 林涛, 等. SEC-RI-MALLS测定甘露聚糖肽分子量与分子量分布[J]. 药物分析杂志, 2024, 44(2): 256-263. [Zou J, Yang L, Lin T, et al. Determination of molecular weight and distribution of mannatide by means of SEC-RI-MALLS[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2024, 44(2): 256-263.] DOI: 10.16155/j.0254-1793.2024.02.08.

13.刘菁, 吴燕, 李华龙, 等. SEC-RI-MALLS联用技术测定甲基纤维素的分子量及分子量分布[J]. 药物分析杂志, 2019, 39(6): 1058-1062. [Liu J, Wu Y, Li HL, et al. Establishment of determination method for the molecular weight and molecular weight distribution of methyl cellulose by SEC-RI-MALLS[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 39(6): 1058-1062.] DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.06.13.

14.中国药典检验标准操作规范2019年版[S]. 2010: 114.

15.中国药典2020年版. 四部[S]. 2020: 480.

16.何素婷, 张卫东, 吕晶, 等. 3种方法测定玻璃酸钠的分子量比较[J]. 中国药师, 2015, 18(6): 929-931. [He ST, Zhang WD, Lyu J, et al. Comparison of three methods for determining molecular weight of sodium hyaluronate[J]. Chinese pharmacist, 2015, 18(6): 929-931.] DOI: 10.3969/j.issn.1008-049X.2015.06.015.

17.宋玉娟, 李颖颖, 范慧红. 玻璃酸钠及制剂分子质量与分子质量分布测定方法研究[J]. 药物分析杂志, 2014, 34(8): 1444-1448. [Song YJ, Li YY, Fan HH. Determination of molecular weight and molecular weight distribution of sodium hyaluronate and its preparations[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2014, 34(8): 1444-1448.] DOI: 10.16155/j.0254-1793.2014.08.033.

18.程广文, 范晓东, 周志勇, 等. 凝胶渗透色谱-多角度激光散射测定聚乙二醇分子量[J]. 高分子材料科学与工程, 2008, 24(10): 127-130. [Cheng GW, Fan XD, Zhou ZY, et al. Determination of molecular weight of polyether glycol by size exclusion chromatography-multi angle laser light scattering[J]. Polymer Materials Science & Engineering, 2008, 24(10): 127-130.] DOI: 10.16865/j.cnki.1000-7555.2008.10.033.

19.王悦, 宋玉娟, 刘倩, 等. 国产羟乙基淀粉130/0.4注射液质量评价及质量研究[J]. 中国药物警戒, 2022, 19(10): 1067-1072, 1090. [Wang Y, Song YJ, Liu Q, et al. Quality evaluation and quality research of domestic hydroxyethyl starch 130/0.4 injection[J]. Chinese Journal of Pharmacovigilance, 2022, 19(10): 1067-1072, 1090.] DOI: 10.19803/j.1672-8629.20220224.

20.Becker A, Köhler W, Müller B. A scanning michelson interferometer for the measurement of the concentration and temperature derivative of the refractive index of liquids[J]. Ber Bunsenges Phys Chem, 1995, 99: 600-608. DOI: 10.1002/bbpc.19950990403.

21.EP11.0 [S]. 2022: 1017.

22.WHO Expert Committee on Biological Standardization. Recommendations to assure the quality, safety and efficacy of group Amenin gococcal conjugate vaccines[S]. 2011, 962: 115-171.