目的  优选桂枝挥发油的最佳包合工艺，并优化关键参数。

方法  以桂枝挥发油的综合评分作为考察指标，采用β-环糊精作为包合载体，结合Plackett-Burman试验筛选关键影响因素，并运用Box-Behnken响应面法优化包合工艺参数，最终确定最优包合条件。

结果  通过饱和水溶液法制备桂枝挥发油包合物，最佳工艺参数为：β-环糊精与桂枝挥发油投料比16 ∶ 1，包合温度53℃，包合时间30 min。

结论  本研究建立的包合工艺效果良好，工艺稳定、重现性好，适用于工业化生产。

桂枝（Ramulus cinnamomi）为樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl.）的干燥嫩枝，具有发汗解肌、温通经脉等功效，在中医临床应用中历史悠久[1]，该药材主治外感风寒表证及血寒经闭等症，已被《中国药典（2020年版）》一部正式收载[2]。现代临床常用含桂枝的经典方剂包括桂枝汤、麻黄汤、葛根汤等，以及小建中系列制剂（合剂、颗粒、片剂）等中成药。

桂枝的主要化学成分包括挥发油类、有机酸类和糖苷类等[3-5]。研究表明，挥发油作为桂枝的主要活性成分，约占药材总量的1%[6-10]，其中桂皮醛是挥发油中最重要的活性成分，含量高达70%~80%[11]。然而，中药挥发油存在稳定性差、溶解度低、易挥发和氧化降解等问题[12]。目前多数制剂采用直接喷洒方式添加挥发油，这增加了含挥发性成分药品在生产、储存过程中的质量控制难度，进而影响最终产品质量[13]。针对上述问题，挥发性成分包合技术提供了一种有效的解决方案。该技术利用β-环糊精的空穴结构，通过范德华力和氢键等分子间作用力将挥发油分子包合 [14]，实现挥发油的分散和固化[15-19]。该方法显著提高了挥发性成分的利用效率和稳定性，为含挥发油中药制剂的开发提供了新的技术途径。

近年来，关于桂枝挥发油包合工艺的研究日益增多，主要包括单一桂枝挥发油包合研究及其与其他中药挥发油的共包合研究[20-34]。然而，现有研究多采用正交试验设计优化工艺参数，虽部分文献尝试应用响应面法[35-36]，但普遍存在考察因素有限的不足。相比之下，Plackett-Burman试验设计能更有效地从多因素中筛选出关键影响因素[37-38]。在此基础上，结合Box-Behnken响应面法对关键因素进行多项式拟合，通过回归方程分析实现工艺参数优化。这种将Plackett-Burman筛选设计与Box-Behnken响应面优化相结合的研究策略[39-40]，较之单一的正交试验或响应面设计，能更全面地考察工艺参数间的交互作用，显著提高工艺优化效率。

1 材料

1.1 主要仪器

e2695-2998高效液相色谱仪，包括VWD B²187E546A检测器、C²1SMC420G柱温箱等（美国沃特世科技有限公司）；MSP-5C智能磁力搅拌器（上海科兴仪器有限公司）；XS204万分之一天平和XS105 DualRange十万分之一天平购自瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 主要药品与试剂

桂枝饮片（河北荷花池药业有限公司，产地：广西玉林，批号：C²852405003）由经方与现代中药融合创新全国重点实验室范建伟高级工程师鉴定为桂枝；桂皮醛对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110710-202223，纯度99.6%）；β-环糊精（孟州市华兴生物化工有限责任公司，批 号：20220402）；无水乙醇（南京化学试剂股份有限公司，批号：210924513K）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水和饮用水。

2 方法与结果

2.1 挥发油的制备

取适量桂枝饮片，粉碎后过20目筛，精密称定；加入7倍量（v/w）饮用水浸泡2 h后，采用水蒸气蒸馏法提取6 h。收集所得挥发油，加入等体积无水乙醇混匀，4℃冷藏保存备用。

2.2 挥发油饱和水溶液法包合工艺

2.2.1 包合物得率测定

精密称取适量β-环糊精，加入纯化水配制成饱和溶液。精密量取1 mL桂枝挥发油乙醇溶液，采用逐滴滴加方式加入上述饱和溶液中，边加边搅拌。滴加完毕后，4℃冷藏静置24 h使包合完全。抽滤收集沉淀，用石油醚（30~60℃）洗涤3次，40℃真空干燥5 h，即得白色粉末状包合物。精密称定包合物质量，按以下公式计算包合物得率：

挥发油包合物得率（%）＝包合物重量/（β-环糊精投入量+挥发油滴入量）×100%

2.2.2 包封率测定

精密称取“2.2.1”项下制得的包合物适量，置圆底烧瓶中，加入纯化水，连接挥发油提取装置，加热回流提取至油量不再增加。冷却后，读取挥发油体积，按以下公式计算包封率：

挥发油包封率（%）＝实际收油量/（挥发油滴入量×空白回收比率）×100%  

2.2.3 空白回收率测定

精密量取1 mL桂枝挥发油乙醇混合溶液，参照“2.2.2”项下包封率测定方法进行操作。平行测定3次，分别记录挥发油回收量，按以下公式计算空白回收率：

挥发油空白回收率（%）＝回收油体积/加入挥发油体积×100%

计算得3次空白回收率的平均值为（68.48± 0.79）%。

2.3 综合评价指标

综合评价指标（Y）=0.4X₁+0.4X₂ + 0.2X₃（其中：X₁为包封率，X₂为桂皮醛含量，X₃为包合物得率）。包封率直接反映β-环糊精对挥发油的包合效率，是评价包合工艺的核心指标，其体现了主体分子（β-环糊精）对客体分子（挥发油）的包载能力，故权重定为40%。桂皮醛含量作为桂枝挥发油的特征性活性成分，其保留率可验证包合过程对热不稳定成分的保护效果，是评价包合质量的关键指标，故权重定为40%。包合物得率反映工艺操作的可行性，表征从投料至成品全过程的物料回收情况，该指标对工业化生产的成本控制具有参考价值，故权重定为20%。

2.4 桂皮醛的含量测定

2.4.1 溶液的配制

对照品溶液：精密称取桂皮醛对照品1.06 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇适量超声（功率：250 W，频率：40 kHz）10 min溶解，冷却至室温后用甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为10.6 μg/mL的桂皮醛对照品溶液。

供试品溶液和阴性样品溶液：精密称取样品约100 mg，置于25 mL量瓶中，加入10  mL纯化水，再加一定量甲醇，超声（功率：250 W，频率：40 kHz）10 min，冷却至室温后，用甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液；精密称取β-环糊精，按上述方法配制阴性样品溶液。

2.4.2 色谱条件

采用HPLC法，色谱柱为DMJK Paitil ODS-002 C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~30 min，65%A；30~31 min，65%→10%A；31~35  min，10%A；35~36 min，10%→65%A；36~45 min，65%A）；检测波长为280 nm；柱温为30°C；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL[41-43]。

2.4.3 系统适用性试验

分别精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图1）。由图可知，供试品溶液在对照品桂皮醛出峰处有相同色谱峰出现，但阴性样品在此处无干扰，表明该色谱条件系统适用性良好。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatogram

  注：A. 阴性样品溶液；B. 对照品溶液；C. 供试品溶液；1. 桂皮醛。

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2.4.4 线性关系考察

精密量取“2.4.1”项下桂皮醛对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，分别置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列浓度标准工作溶液（1.06、2.12、4.24、6.36、8.48、10.60 μg/mL）。按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，以桂皮醛浓度为横坐标（X，μg/mL）、相应峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程Y=104 063.54X+522.20（r=0.999 9）。结果表明，桂皮醛在1.06~10.60 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验

精密吸取供试品溶液按“2.4.2”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算得桂皮醛峰面积的RSD为0.37%（n=6），结果表明该仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验

将供试品溶液置于室温条件下，分别于0、2、4、6、12、24 h按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算得桂皮醛峰面积的RSD为0.46%（n=6），结果表明该供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。

2.4.7 重复性试验

同一批次包合物分取６份，各1 g，精密称定，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算得桂皮醛的平均含量为5.89 μg/mL，RSD为0.47%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的包合物样品6份，每份0.5 g，分别加入“2.4.1”项下对照品溶液5 mL，并按供试品溶液的制备方法制备加样回收率的供试品溶液；按“2.4.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算得桂皮醛的平均回收率为100.54%，RSD为0.67%（n=6），结果表明该方法准确度良好。

2.5 包合工艺的单因素考察

2.5.1 β-环糊精-挥发油投料比

精密称取不同质量的β-环糊精（β-环糊精-挥发油比例分别为5 ∶ 1、10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1）溶于适量纯化水中，在600 r/min搅拌条件下，以3 min/mL的恒定速率滴加桂枝挥发油溶液，保持包合温度50℃、包合时间30 min，反应完成后4℃冷藏24 h使包合完全，通过综合评分结果确定最佳投料比例。图2结果表明，β-环糊精与挥发油的比例在5 ∶ 1至15 ∶ 1范围内，综合评分呈上升趋势，并在15 ∶ 1时达到峰值；而当比例从15 ∶ 1增至25 ∶ 1时，综合评分则逐渐下降。基于此变化规律，选取最高点（15 ∶ 1）两侧的10 ∶ 1和20 ∶ 1作为Plackett-Burman试验中β-环糊精-挥发油比例的低、高两个水平进行后续试验。

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  图2 β-环糊精-挥发油比例考察结果（n=3）

  Figure 2.Investigation results of β-cyclodextrin and volatile oil ratio (n=3)

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2.5.2 包合温度

按β-环糊精-挥发油比例15 ∶ 1精密称取一定量的β-环糊精溶于适量纯化水中，在600 r/min搅拌条件下，以3 min/mL的恒定速率滴加桂枝挥发油溶液，分别考察30、40、50、60、70℃ 5个不同温度的包合效果，固定包合时间为30 min，反应完成后4℃冷藏24 h使包合完全，通过综合评分结果确定最佳包合温度。图3结果表明，随着包合温度从30℃升至50℃，综合评分持续上升，并在50℃时达到峰值；而当温度继续升高至70℃时，综合评分则逐渐下降。基于此变化趋势，选取最高点（50℃）两侧的40℃和60℃作为Plackett-Burman试验中包合温度的低、高两个水平进行后续试验。

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  图3 包合温度考察结果（n=3）

  Figure 3.Investigation results of packaging temperature (n=3)

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2.5.3 包合时间

按β-环糊精-挥发油比例15 ∶ 1精密称取一定量的β-环糊精溶于适量纯化水中，在600 r/min搅拌条件下，以3 min/mL的恒定速率滴加桂枝挥发油溶液，保持包合温度50℃，分别考察10、20、30、40、50 min，5个不同包合时间的包合效果，通过综合评分结果确定最佳包合时间。图4结果表明，随着包合时间从10  min延长至30 min，综合评分呈现上升趋势，并在30  min时达到峰值；而当包合时间继续增加至50  min时，综合评分则逐渐下降。基于此变化趋势，选取峰值点（30 min）两侧的20 min和40 min作为Plackett-Burman试验中包合时间的低、高两个水平进行后续试验。

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  图4 包合时间考察结果（n=3）

  Figure 4.Investigation results of packaging time (n=3)

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2.5.4 滴加速度

按β-环糊精-挥发油比例15 ∶ 1精密称取一定量的β-环糊精溶于适量纯化水中，在600  r/ min搅拌条件下，分别考察1、2、3、4、5 mL/min 5个滴加桂枝挥发油溶液的速度，保持包合温度50℃、包合时间30 min，反应完成后4℃冷藏24  h使包合完全，通过综合评分结果确定最佳滴加速度。图5结果表明，当滴加速度从1 mL/min提升至3 mL/min时，包合物的综合评分呈现显著上升趋势，并在3 mL/min时达到峰值；然而，当滴加速度继续增加至5 mL/min时，综合评分出现明显下降趋势。基于此变化趋势，选取最优滴加速度（3 mL/min）两侧的2 mL/min和4 mL/min作为Plackett-Burman试验中滴加速度的低、高两个水平进行后续试验。

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  图5 滴加速度考察结果（n=3）

  Figure 5.Investigation results of dropping speed (n=3)

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2.5.5 搅拌速度

按β-环糊精-挥发油比例15 ∶ 1精密称取一定量的β-环糊精溶于适量纯化水中，分别考察 200、400、600、800、1 000 r/min 5个不同搅拌条件，以3 min/mL的恒定速率滴加桂枝挥发油溶液，保持包合温度50℃、包合时间30 min，反应完成后4℃冷藏24 h使包合完全，通过综合评分结果确定最佳搅拌速度。图6结果表明，搅拌速度在200~600 r/min范围内，综合评分随转速提升呈显著上升趋势，并于600 r/min时达到最大值；当转速继续提升至1 000 r/min时，综合评分反而呈现下降趋势。基于此变化趋势，选取最优转速（600 r/min）两侧的400 r/min和800 r/min作为Plackett-Burman试验中搅拌速度的低、高两个水平进行后续试验。

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  图6 搅拌速度考察结果（n=3）

  Figure 6.Investigation results of stirring speed (n=3)

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2.5.6 冷藏时间

按β-环糊精-挥发油比例15 ∶ 1精密称取一定量的β-环糊精溶于适量纯化水中，在600 r/min搅拌条件下，以3 min/mL的恒定速率滴加桂枝挥发油溶液，保持包合温度50℃、包合时间30 min，反应完成后4℃分别冷藏 6、12、24、36、48 h，通过综合评分结果确定最佳冷藏时间。图7结果表明，冷藏时间在6~24 h范围内，综合评分随冷藏时间延长呈上升趋势，并于24 h达到峰值；但当冷藏时间延长至48 h时，综合评分反而降低。基于此变化趋势，选取最佳冷藏时间（24 h）两侧的12 h和36 h作为Plackett-Burman试验中冷藏时间的低、高两个水平进行后续试验。

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  图7 冷藏时间考察结果（n=3）

  Figure 7.Investigation results of refrigeration time (n=3)

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2.6 Plackett-Burman试验设计筛选

根据单因素考察结果，选取投料比（A）、包合温度（B）、包合时间（C）、滴加速度（D）、搅拌速度（E）、冷藏时间（F）6个因素，采用Plackett-Burman设计试验，确定每个单因素结果的最高值，选取其上下两个条件定为每个因素的高、低水平。以包封率、包合物得率、桂皮醛含量为指标，筛选出具有显著性影响的因素[44-45]，因素水平、试验设计与结果、方差分析、因素显著性柏拉图分别见表1~表3、图8。

Y与A、B、C、D、E、F之间的关联性可用方程Y=78.42+4.67A+4.25B+2.82C+1.50D+ 0.04 3E-0.88F解释；模型的P＜0.05，证明该模型准确有效，能筛选出具有显著性影响的因素。从表3和图2可以看出，A、B、C 3个因素均具有极显著性影响，而D、E、F 3个因素无显著性影响。R²=0.955 6，调整R²=0.902 3，表明该模型拟合和线性程度高，Adeq（信号噪声比）=12.908，信号响应充足，均代表此模型适用桂枝挥发油包合工艺中显著因素的筛选。

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  表格1 Plackett-Burman 试验设计因素水平

  Table 1.Experimental design factor levels of Plackett-Burman

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  表格2 Plackett-Burman试验设计与结果

  Table 2.Experimental design and experimental outcomes of Plackett-Burman

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  表格3 Plackett-Burman 试验方差分析结果

  Table 3.Variance analysis of Plackett-Burman test

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  图8 因素显著性柏拉图

  Figure 8.Pareto chart of significance of factors

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2.7 Box-Behnken试验优化包合工艺

选取Plackett-Burman试验设计得出能显著影响挥发油包合的因素，分别为Ａ、Ｂ、Ｃ 3个因素。再利用DesignExpert.V8.0.6.1软件中Box-Behnken设计筛选出挥发油包合条件，并以包封率、包合物得率、桂皮醛含量的综合评价作为考察指标。因素水平、试验设计与结果、方差分析、3D响应面图分别见表4~表6、图9。

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  表格4 Box-Behnken试验设计因素水平表

  Table 4.Factor level table of Box-Behnken experimental design

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  表格5 Box-Behnken 试验设计与结果

  Table 5.Experimental design and results of Box-Behnken

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根据表6可以得出Y=96.65+3.01A+4.36B+ 3.57C+3.79AB-3.11AC-0.60BC-8.19A²-8.14B²-11.80C²。模型P＜0.05、失拟项P＞0.05，体现出此模型真实可靠；一次项对Y的影响程度均具有极显著性差异，AC交互作用具有显著性差异，二次项A²、B²、C²均具有极显著性差异。其中R²=0.983 8，调整R²=0.963 1，表明该模型拟合程度高，信号噪声比=19.372，表明信号响应充足，二者均证明此模型可用于桂枝挥发油包合工艺筛选。

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  表格6 Box-Behnken 试验方差分析结果

  Table 6.Variance analysis results of the Box-Behnken test

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  图9 3D 响应面图

  Figure 9.3D response surface plot

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2.8 验证试验

通过响应面法优化获得理论最佳工艺参数为：β-环糊精-挥发油投料比16.18 ∶ 1，包合温度53.19℃，包合时间31.12 min，此时综合评分达97.90%。基于实际生产可行性考虑，将工艺参数调整为：投料比16 ∶ 1、包合温度53℃、包合时间30 min。

按优化后的最佳工艺条件平行制备3批包合物，综合评分测定结果分别为：96.86%、95.37%、95.02%，平均值为95.75%。与模型预测值相比，相对误差为2.146%，符合工艺验证可接受标准（≤3%）。

3 讨论

本研究采用β-环糊精包合技术有效解决了桂枝挥发油稳定性差、易氧化等关键技术难题。通过整合Plackett-Burman试验设计与Box-Behnken响应面法，成功优化了桂枝挥发油的包合工艺参数。Plackett-Burman设计以其多因素、少水平的优势，能够通过少量试验筛选出显著性影响因素；而Box-Behnken响应面法则通过数据建模实现了工艺参数的精确优化。两种方法的联合应用显著提高了研究结果的准确性和可靠性[46-49]。

尽管本研究设计科学合理，但仍存在若干需要完善之处：首先，虽然现有综合评价指标能够满足基本工艺需求，但其权重分配的精确性较熵值法等客观赋权方法有所不足，后续研究可采用更精确的赋权方法[50-51]；其次，在获得最佳包合工艺后，需进一步建立完善的质量控制体系，建议采用气相色谱指纹图谱结合化学计量学方法，建立科学的质量控制标准；最后，虽然包合工艺显著提高了挥发油的稳定性，但包合物长期稳定性的系统评价仍是工艺研究的关键环节，这将作为本课题组后续重点研究方向。

这些改进方向将有助于推动桂枝挥发油包合工艺从实验室研究向产业化应用的转化，为中药挥发油制剂的质量控制提供更可靠的技术支持。

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