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目的 基于Astral-数据独立采集（DIA）蛋白质组学技术筛选沙蓬粗寡糖（AOS）改善2型糖尿病肝损伤的潜在靶点，并探讨其作用机制。
方法 将12只db/db小鼠随机分为模型组、AOS低剂量组（LAOS，375 mg/kg）和高剂量组（HAOS，750 mg/kg），每组4只，另设4只db/m小鼠为空白对照组。干预8周后，采集肝脏组织进行蛋白质组学分析，通过韦恩图、KEGG通路富集、基因本体论（GO）注释、蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络及基因集富集分析（GSEA）等方法解析AOS的作用机制。
结果 LAOS组鉴定出180个差异蛋白，GO分析显示其参与细胞氨基酸分解代谢；KEGG提示与丁酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解通路相关。HAOS组筛选出282个差异蛋白，显著富集于小分子代谢、有机酸代谢、酮酸代谢、羧酸代谢过程，KEGG分析表明其通过调控代谢途径、丙酸代谢、碳代谢、氧化磷酸化以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解等通路发挥作用。PPI网络筛选出酰基辅酶A合成酶短链家族成员1（ACSS1）、含烯酰辅酶A水合酶域1（ECHDC1）和烯脂酰辅酶A水合酶1（ECHS1）等10个核心靶蛋白。GSEA显示，LAOS的作用与干扰素-γ信号和缺氧通路激活相关，而HAOS涉及上皮-间质转化、缺氧、未折叠蛋白反应、肌细胞生成以及蛋白质分泌通路。
结论 AOS可能通过调节支链氨基酸代谢、短链脂肪酸代谢、丙酮酸代谢及氧化磷酸化等途径改善糖尿病肝损伤，ACSS1、ECHDC1和ECHS1等靶点是其关键作用节点。
2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种以胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）导致的血糖升高和胰岛素分泌相对减少为特征的代谢性疾病。根据第10版《全球糖尿病地图》统计，截至2021年全球糖尿病患者已达5.37亿，患病率超过10%，预计到2045年患病人数将增加46%，届时全球将有超过1万亿美元的卫生支出用于糖尿病治疗，这一疾病正严重威胁人类健康和社会经济发展[1]。作为机体代谢的核心器官，肝脏功能在糖尿病病理进程中受到显著影响：T2DM引发的糖脂代谢紊乱和IR状态会显著增强肝细胞对炎症及损伤性刺激的敏感性，促进大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成。当ROS过度累积时，会严重破坏机体的抗氧化防御系统，最终导致肝脏实质性损伤[2]。因此，T2DM相关肝损伤已成为当前需要深入研究和解决的重大健康挑战。
蛋白质组是指特定基因组编码或在细胞、组织中表达的全部蛋白质[3]，而蛋白质组学则通过系统性分析蛋白质的表达差异，从功能层面揭示疾病机制或确定潜在药物靶点[4]。近年来，基于Orbitrap Astral质谱仪的Astral-数据独立采集（data-independent acquisition，DIA）技术为蛋白质组学研究提供了强大支持，该质谱仪凭借其高通量、高覆盖深度、高灵敏度及高定量精度的卓越性能，结合DIA技术可实现稳定检测并定量分析超过10 000个蛋白质[5]。本实验所研究的药物沙蓬粗寡糖（agriophyllum oligosaccharides，AOS）是从蒙古族特色药材沙蓬的干燥地上部分经分离纯化获得，课题组前期研究已证实其对Goto-Kakizaki（GK）大鼠及db/db小鼠具有显著降低血糖和血脂、改善糖耐量以及缓解糖尿病相关肝肾损伤的作用[6-8]。
AOS是一种成分复杂的大分子结构糖类物质，可能通过多机制改善T2DM的肝损伤。研究表明，AOS能够激活胰岛素受体（insulin receptor，INS-R）/胰岛素受体底物-2（insulin receptor substrate-2，IRS-2）/磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）/葡萄糖转运蛋白 4（glucose transporter 4，Glut4）/过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）-γ通路，上调肝脏和胰腺组织中关键分子的表达，并促进IRS-2和AKT的磷酸化，从而改善胰岛素敏感性、减轻IR、促进肝细胞增殖和葡萄糖摄取。此外，AOS还能显著降低血糖、游离脂肪酸、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平，缓解肝脏脂质蓄积、纤维化及胰腺损伤[9-10]。然而，目前关于AOS的作用机制研究尚不全面，因此本研究利用Astral-DIA蛋白质组学技术对所有可定量蛋白进行分析，以进一步探索AOS改善T2DM肝损伤的潜在分子机制。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试药
Vanquish Neo高效液相色谱仪和Orbitrap Astral质谱仪购自美国Thermo公司；590血糖仪（批号：2011）、一次性采血针（28 G注式SOFT型，批号：M0652）、血糖试纸（葡萄糖氧化酶法，批号：1304055）均购自江苏鱼跃医疗设备股份有限公司。
AOS（藻寡糖，褐色粉末，具茶香味）由沙蓬（Agriophyllum squarrosum）醇提-树脂纯化-脱色所得粗寡糖，其1 g相当于14.4 g沙蓬原料；经苯酚-硫酸法测定，粗寡糖含量为72.6%；实验所用沙蓬地上部分采自内蒙古通辽市奈曼旗，由内蒙古民族大学蒙医药学院包桂花教授鉴定符合内蒙古药材标准（2021版）。高脂饲料（邳州市小河科技发展有限公司，脂肪含量60%，批号：23021002）。
1.2 动物
健康的db/db小鼠（12只）和db/m小鼠（4只），清洁级，8~10周龄，体重18~22 g，雌雄不限，均购自中国江苏华创信诺医药科技有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2020-0009]。所有小鼠饲养于内蒙古民族大学附属医院SPF级动物实验中心，在标准条件下培育：12 h明暗循环，恒温22~25℃，相对湿度50%~70%。本实验方案经内蒙古民族大学附属医院医学伦理委员会审批通过（伦理审批号：NM-LL-2024-03-16-03）。
1.3 方法
1.3.1 动物分组、造模及给药
将18只db/db小鼠适应性饲养1周后作为造模组，给予高脂饲料（60%脂肪）和普通饮水喂养；同时设同周龄db/m小鼠作为正常血糖对照组（normal glucose，NG），给予普通饲料和饮水喂养。持续喂养7周后，通过尾尖采血测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），若造模组小鼠FBG≥11.1 mmol/L（随机血糖≥16.7 mmol/L）则判定为T2DM造模成功[11]。随后将造模成功的小鼠随机分为3组：模型组（model glucose，MG）、AOS低剂量组（LAOS，375 mg/kg，0.5倍临床等效剂量）和AOS高剂量组（HAOS，750 mg/kg，临床等效剂量），每组4只。各给药组每日上午灌胃相应剂量的AOS溶液，NG组和MG组则给予等体积蒸馏水，连续干预8周。实验期间每周监测小鼠体重指数、FBG，并记录其进食量、饮水量及精神状态变化。
1.3.2 蛋白质组学测定
实验结束后对4组小鼠实施解剖，采集肝脏组织进行蛋白质组学分析，检测工作委托上海美吉生物医药科技有限公司分析测试平台完成。具体实验流程如下：采用质谱上样缓冲液溶解等量肽段，并用与液相系统和质谱仪进行LC-MS/MS分析；肽段经液相系统进行分离，色谱柱为Ionopticks C18柱（250 mm×75μm，1.6 μm），流动相A为含2%乙腈和0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含80%乙腈和0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脱（0~0.1 min，4%→8% B；0.1~1 min，8%→12.5% B；1~1.1 min，12.5%→12.6% B；1.1~3.1 min，12.6%→22.5% B；3.1~4.6 min，22.5%→45% B；4.6~5 min，45%→99% B；5~6.5 min，99% B），流速为300 nL/min，柱温为25℃；分离后的肽段通过纳升电喷雾离子源导入质谱仪，在DIA模式下进行分析，质谱检测采用正离子模式，离子源电压设置为1.5 kV，离子传输管温度维持在400℃，MS1分辨率设置为70 000，扫描范围为350~1 300 m/z，随后进行二级碎裂检测。
1.3.3 蛋白质组学分析
蛋白质组学数据分析流程如下：首先对鉴定蛋白进行数据预处理，剔除在＞50%样本中缺失的蛋白，并采用Sequential KNN方法对组内＞20%样本表达的蛋白进行缺失值填补。以差异表达倍数（fold change，FC）＞1.2为显著上调标准，FC＜0.83为显著下调标准筛选差异表达蛋白。为避免实验误差导致的极端FC值影响结果可靠性，进一步剔除|log2FC|＞8的差异蛋白。分别筛选MG vs. NG、LAOS vs. MG及HAOS vs. MG 3组比较的差异蛋白，绘制韦恩图获取共有差异蛋白，并进行GO功能注释和KEGG通路富集分析（结果可视化呈现）。将LAOS组和HAOS组治疗相关的差异蛋白集分别导入STRING数据库（https://cn.string-db.org/）构建蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络，运用Cytoscape 3.10.1软件可视化网络并依据度（degree）值筛选核心蛋白节点。同时，采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）4.0.0软件对MG组、LAOS组、HAOS组的全基因组表达谱进行GSEA，系统评估AOS干预对T2DM肝损伤的调控作用。
1.4 统计学分析
采用独立样本t检验进行组间差异蛋白分析。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析分别使用Benjamini-Hochberg（BH）法和Holm法进行多重假设检验校正。STRING数据库蛋白质互作网络分析中，设置最小互作置信度阈值为0.4。GSEA以P＜0.05作为显著性阈值。所有统计分析均采用双侧检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 差异表达蛋白情况分析
4组样品中共检测到104 375个肽段，经UniProt数据库比对鉴定获得8 024个蛋白质。经过数据预处理（剔除＞50%样本缺失蛋白并进行缺失值填补）后，最终保留6 156个高质量蛋白用于后续分析。通过比较MG组与NG组的蛋白表达谱，共筛选出1 570个差异表达蛋白（图1A），剔除极端值后保留1 561个有效差异蛋白，其中上调蛋白757个，下调蛋白804个。值得注意的是，在MG组中表达上调最显著的蛋白为Fmo3，而下调最显著的蛋白为Cyp7b1。
通过比较LAOS组与MG组的蛋白表达谱，共鉴定出418个差异表达蛋白（图1B）。剔除极端值后保留408个有效差异蛋白，包括164个上调蛋白和244个下调蛋白。其中，上调表达最显著的蛋白为羧肽酶A1（Cpa1），下调表达最显著的蛋白为绒毛蛋白1（Vil1），具体差异蛋白信息见表1。
通过HAOS组与MG组的蛋白质组学比较分析，共筛选出575个差异表达蛋白（图1C）。经严格质量控制（剔除异常值）后，最终获得563个有效差异蛋白，包括249个上调蛋白和314个下调蛋白。其中，组蛋白去甲基化酶Kdm3b呈现最显著上调表达，而维生素B12受体蛋白Cubn则表现出最显著下调表达，具体差异蛋白信息见表2。
2.2 差异蛋白的功能富集
通过韦恩图分析发现，将MG组与NG组的差异蛋白分别与LAOS-MG组和HAOS-MG组的差异蛋白进行比较，获得了与AOS治疗相关的关键蛋白集合。结果显示：LAOS组治疗相关的交集蛋白共180个（图2A），而HAOS组治疗相关的交集蛋白更多，达282个（图2B）。
通过GO富集分析发现，LAOS组180个差异蛋白显著富集于细胞氨基酸分解代谢过程（GO：0009063）（图3A），而HAOS组282个差异蛋白则广泛参与多种代谢通路，包括小分子代谢过程（GO: 0044281）、有机酸代谢过程（GO: 0044281）、酮酸代谢过程（GO: 0043436）、羧酸代谢过程（GO: 0019752）以及羧酸分解代谢过程（GO: 0046395）等（图3B）。
KEGG通路富集分析结果显示，LAOS组的180个差异蛋白主要富集于丁酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解2条代谢通路（图4A）。相比之下，HAOS组的282个差异蛋白则显示出更广泛的代谢调控作用，显著富集于包括代谢途径、丙酸代谢、碳代谢、氧化磷酸化以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解在内的多个重要通路（图4B）。
2.3 差异蛋白的交互网络分析
基于STRING数据库的蛋白质互作网络分析结果显示，在LAOS组中，通过degree值排序筛选出的7个关键蛋白依次为：乙酰辅酶A合成酶1（acetyl-CoA synthetase 1，ACSS1）、基底膜蛋白聚糖（lumican，LUM）、支链酮酸脱氢酶E2亚基（dihydrolipoamide branched chain transacylase E2，DBT）、烯酰辅酶A水合酶1（enoyl-CoA hydratase domain containing 1，ECHDC1）、羟基酰基辅酶A脱氢酶（hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HADA）以及胶原蛋白VI α2/α1链（collagen type VI alpha 2/1 chain，COL6A2/COL6A1）（图5A）。而HAOS组则鉴定出9个核心蛋白：烯酰辅酶A水合酶1（enoyl-CoA hydratase short chain 1，ECHS1）、NADH脱氢酶黄素蛋白1（NADH：ubiquinone oxidoreductase core subunit V1，NDUFV1）、乙酰辅酶A酰基转移酶2（acetyl-CoA acyltransferase 2，ACAA2）、琥珀酰辅酶A连接酶（succinate-CoA ligase subunit alpha，SUCLG1）、三功能酶亚基β（hydroxyacyl-CoA dehydrogenase trifunctional multienzyme complex subunit beta，HADHB）、ATP柠檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）、二氢硫辛酰胺脱氢酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD）、中链酰基辅酶A脱氢酶（acyl-CoA dehydrogenase medium chain，ACADM）和羟酰辅酶A脱氢酶（hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HADH）（图5B）。
通过UniProt检索上述核心蛋白质功能，进一步筛选确定10个关键蛋白，分别为ACSS1、ECHDC1、ECHS1、NDUFV1、ACAA2、SUCLG1、HADHA、ACLY、DLD和ACADM。
2.4 GSEA分析
为了系统解析AOS对T2DM肝损伤的调控机制，采用GSEA方法对所有可定量蛋白进行了全基因组富集分析。结果显示：与MG组相比，LAOS组蛋白显著富集于缺氧通路和干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）信号通路（图6A和图6B）；而HAOS组则表现出更广泛的调控作用，其蛋白主要富集于上皮-间质转化、缺氧、肌细胞生成、未折叠蛋白反应以及蛋白质分泌等通路（图6C~图6G）。
3 讨论
糖尿病肝损伤是一种以糖代谢紊乱与肝脏病理改变为特征的慢性肝脏疾病[12]。本研究聚焦的AOS源自传统蒙药沙蓬的干燥地上部分，该药材在蒙医临床中具有清热泻火、解毒利尿等功效，是治疗“消渴病”（糖尿病）的常用药物[13-15]。与黄连解毒汤（抗炎）、沙棘多糖（缓解内质网应激）及葛根芩连汤（抑制铁死亡）等中药成分相比，AOS的独特优势在于其能协同调控代谢与炎症通路[16]。前期研究证实，AOS可通过激活AKT磷酸化等促增殖信号通路，显著改善糖尿病肝损伤的组织病理学变化[10]。为进一步系统阐明AOS的多靶点作用机制，本研究创新性地采用蛋白质组学技术，通过对高通量测序数据的深度挖掘，全面解析了AOS改善糖尿病肝损伤的分子网络，为后续研究提供了重要理论依据。
蛋白质组学分析揭示了LAOS和HAOS组在代谢调控中的差异化作用模式。LAOS组的差异蛋白显著富集于细胞氨基酸分解代谢、丁酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路，提示其可能通过调控支链氨基酸（branched chain amino acid，BCAA）代谢和短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）代谢来靶向改善肝脏代谢稳态。相比之下，HAOS组展现出更广泛的代谢调控网络，其差异蛋白不仅参与小分子代谢、有机酸代谢和羧酸代谢，还在KEGG分析中富集于代谢主通路、丙酸代谢和氧化磷酸化等关键通路。值得注意的是，两组在BCAA降解通路的共同富集表明该途径在肝损伤修复中的核心地位，而HAOS组特有的氧化磷酸化通路激活可能解释了其更显著的全身代谢改善效果。这些发现为理解AOS的剂量依赖性治疗机制提供了重要分子依据。
现有研究证实，BCAAs在糖代谢调控中具有双重作用：一方面其水平升高与IR、肥胖及糖尿病风险呈正相关[17]；另一方面，柯雅蕾等 [18]揭示BCAAs可通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路抑制AKT2-胰岛素诱导的基因2（insulin-induced gene 2，INSIG2a）信号转导，从而调控肝脏脂质代谢重分布，而蛋白磷酸酶Mg2+/Mn2+依赖性1K（protein phosphatase, Mg2+/Mn2+ dependent 1K，PPM1K）则能通过激活碳水化合物反应元件结合蛋白-β（carbohydrate response element binding protein-β，ChREBP-β）转录因子促进肝脏脂质生成。在SCFAs方面，其主要由肠道菌群发酵膳食纤维和蛋白质产生，同时也可通过脂肪酸氧化途径生成[19]。其中，丁酸被发现具有多重代谢调节功能：不仅能激活胚胎干细胞中胰腺发育关键基因以促进β细胞分化，还能通过抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）活性调控p38/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，从而保护β细胞功能并改善糖代谢稳态[20]。这些机制研究为理解BCAAs和SCFAs在T2DM发生发展中的作用提供了重要理论基础，也为AOS通过调控这些代谢通路改善糖尿病肝损伤的机制研究提供了科学依据。
多项研究揭示了线粒体能量代谢与糖尿病肝损伤的密切关联。Abulizi等[21]证实，线粒体三磷酸鸟苷依赖的磷酸烯醇式丙酮酸循环在胰岛素分泌调控中起关键作用，该通路通过小分子活化增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌，同时不引起胰岛损伤，并能显著改善机体胰岛素敏感性。在糖尿病动物模型中，该代谢通路的激活还伴随糖异生减少、红细胞糖酵解增强及肝脏脂肪变性减轻等获益效应。张蕾等[22]进一步发现，糖尿病状态下肝脏线粒体功能显著受损，表现为以琥珀酸为底物时的磷氧比、呼吸控制比及H+-ATP酶合成活性均明显降低，提示糖尿病可导致线粒体氧化磷酸化耦联障碍。这些发现为理解糖尿病肝损伤中线粒体功能障碍的分子机制提供了重要证据，也印证了本研究中HAOS组差异蛋白显著富集于氧化磷酸化通路的生物学意义。
本研究通过PPI网络分析鉴定出10个枢纽基因，主要参与脂肪酸代谢、氧化磷酸化和支链氨基酸代谢等关键通路。其中：ECHDC1通过降解甲基/乙基丙二酰辅酶A调控脂肪酸合成，抑制异常支链脂肪酸形成[23]；ECHS1作为代谢开关，在营养缺乏时促进BCAAs和FAs分解供能，而在营养充足时通过乙酰化介导的酶活性抑制实现代谢重编程[24]；NDUFV1作为线粒体复合物I核心亚基，既参与质子动力产生又是ROS主要来源，其缺陷可导致严重代谢紊乱[25]；ACAA2通过抑制ATGL活性促进肝细胞脂质蓄积[26]；HADHA被证实能直接调控Pck1/G6pc/Pgc1a等糖异生关键基因表达[27]；ACLY则通过将柠檬酸转化为乙酰辅酶A，在糖脂代谢转换中起枢纽作用[28]。这些基因与KEGG/GO分析结果高度吻合，部分已被证实可导致肝糖脂代谢紊乱，虽尚未明确其是否为AOS的直接作用靶点，但为阐明T2DM肝损伤机制提供了重要线索。建议 通过基因敲除/过表达实验进一步验证这些关键靶点在AOS治疗中的作用。
本研究通过整合蛋白质组学和生物信息学分析，系统揭示了AOS改善T2DM肝损伤的多靶点作用机制。GSEA分析表明，LAOS主要通过调控IFN-γ和缺氧等炎症相关通路发挥作用，而HAOS则通过更广泛的通路网络（包括间质转化、未折叠蛋白反应、肌细胞生成等）改善糖酵解、缓解内质网应激并促进组织修复。蛋白质互作网络分析鉴定出ACSS1、ECHDC1、ECHS1、NDUFV1等10个关键靶蛋白，这些蛋白主要参与BCAA代谢、SCFAs代谢、丙酮酸代谢及氧化磷酸化等代谢通路。研究结果表明，AOS可能通过多靶点协同调控糖脂代谢、能量代谢和炎症反应来改善T2DM肝损伤。本研究不仅为阐明AOS的作用机制提供了新的理论依据，也为后续开展深入的机制验证研究指明了方向，未来我们将针对这些关键通路和靶蛋白开展系统的实验验证。
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