目的  对洛索洛芬钠贴剂自制制剂与参比制剂进行体内外质量一致性评价。

方法  通过体外评价比较自制制剂与参比制剂的初黏力、体外释放及体外透皮特性。初黏力采用滚球法测定，体外释放和体外透皮实验采用Franz扩散池法进行。同时，通过药代动力学-生物等效性试验，分析两种制剂的药动学参数，包括最大血浆药物浓度（C_max）、药时曲线下面积（AUC_0~t）及AUC_0~∞，并计算几何均值比的90%置信区间，以判定生物等效性。

结果  自制制剂与参比制剂的初黏力、体外释放及体外透皮特性均一致。自制制剂中洛索洛芬的C_max、AUC_0~t和AUC_0~∞的90%置信区间分别为101.59%（97.70%，105.63%）、100.67%（96.51%，105.01%）和100.40%（96.37%，104.60%）；其反式-OH代谢产物的C_max、AUC_0~t和AUC_0~∞的90%置信区间分别为101.55%（97.72%，105.53%）、101.79%（97.63%，106.13%）和101.43%（97.42%，105.61%），均处于80%~125%的等效范围内。

结论  洛索洛芬钠贴剂自制制剂与参比制剂的体内外质量一致。

洛索洛芬钠是一种非甾体抗炎药，具有解热、镇痛和抗炎三重功效[1]。与同类药物相比，该药具有镇痛作用强、起效快、不良反应少、适应证广等显著优势[2]。药代动力学研究表明，洛索洛芬钠是一种前体药物，经透皮吸收后主要转化为反式羟基代谢产物（trans-OH），该活性代谢物通过抑制前列腺素合成而发挥药理作用[2]。目前，我国已上市的洛索洛芬钠剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂和分散片等口服制剂，以及凝胶贴膏剂和2014年8月获批的原研贴剂等外用剂型[3]。口服制剂普遍存在胃肠道刺激明显和肝脏首过效应等问题，而外用贴剂可有效避免胃肠道不良反应，在局部达到治疗浓度时全身吸收量极低[3]，且能维持平稳的血药浓度。相较于凝胶贴膏，贴剂还具有辅料种类少、制备工艺简单、黏附性更佳等优势，无需复杂的交联反应。基于上述优势，本研究以第二十九批参比制剂目录公布的Lead Chemical Co., Ltd持证的洛索洛芬钠贴剂为参比制剂，系统评价自制洛索洛芬钠贴剂的初黏力、体外释放和透皮性能，并开展人体生物等效性研究。

目前，各国药品监管机构对局部皮肤外用制剂的生物等效性评价标准尚未统一。现行的评价方法主要包括临床终点法、体内药效学法、药代动力学-生物等效性（pharmacokinetics- bioequivalency，PK-BE）法以及皮肤药代动力学法。其中，临床终点法存在研究成本高、周期长、灵敏度和重现性较差等局限性，不利于仿制药的上市申请和变更评估。体内药效学法目前仅适用于糖皮质激素类药物的评价。PK-BE法则适用于具有显著全身吸收特性，且血药浓度与作用部位药物浓度存在明确相关性的药物。而皮肤药代动力学法由于操作复杂且变异性高，目前仅被独立行政法人医药品医疗器械综合机构（Pharmaceuticals and Medical Devices Agency，PMDA）等少数监管机构采纳。根据对美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）类似品种个药指南[4-5]的分析，局部皮肤外用制剂的生物等效性评价方法需根据其作用机制、靶向部位、全身吸收程度以及血药浓度与作用部位浓度的相关性等因素进行综合选择。洛索洛芬钠贴剂作为非甾体抗炎药，其作用靶点为皮下肌肉、关节及局部软组织。原研资料表明，该药物及其活性代谢物（trans-OH）具有显著的全身吸收特性，血药浓度可被准确检测，且作用部位药物浓度与血药浓度呈正相关。因此，采用PK-BE方法评价洛索洛芬钠贴剂的生物等效性具有科学合理性。

1 材料

1.1 主要仪器

SQP-SECURA225D-1CN型和SQP-QUINTIX513-1CN型电子天平（德国Sartorius公司）；1260 II型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；CZY-GY型初黏性测定仪（济南兰光机电技术有限公司）；TK-24BL型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；AS-VT100型经皮水分流失测量仪（日本ASCH公司）；LC-40B X3型和LC-20ADXR型高效液相色谱泵（日本Shimadzu公司）；Triple Quad 4500型质谱仪（美国AB Sciex公司）。

1.2 主要药品与试剂

洛索洛芬钠贴剂[参比制剂，第一三共株式会社，批号：J013LR，规格：100 mg/贴（10  cm×14  cm）]；洛索洛芬钠贴剂[自制制剂，批号：C129240301，规格：100 mg/贴（10  cm×14  cm）]；洛索洛芬钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100638-202104，纯度87.5%）；反式羟基洛索洛芬对照品（批 号：3859-056A5，纯度99.3%）、洛索洛芬-d4内标（批号：2569-058A6，纯度98.8%）和trans-OH洛索洛芬-^-13C-d₃内标（批号：2978-096A2，纯度98.3%）购自TLC Pharmaceutical Standards；生理盐水（药用级，石家庄四药有限公司，批号：2309202005）；甲醇、乙腈和四氢呋喃为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 动物离体皮肤

巴马小香猪（雄性，30日龄，体重3 kg）背部离体皮肤由北京富豪实验动物养殖中心提供，-20℃冷冻保存待用。巴马小香猪为普通级，由中国食品药品检定研究院进行检验，生产许可证号：SCXK（京）2023-0007，动物质量合格证号：110344241100089374、110344241100089465、110344241100086287、110344241100086113。

2 方法与结果

2.1 初黏力测定

按照《中国药典（2020年版）》四部通则“0952第一法滚球法”[6]进行黏附力测定：在黏附力试验仪斜面上部10 cm处覆盖与待测贴剂相同厚度的厚纸，将剪裁成5 cm×10 cm的供试品用双面胶带固定在30°斜面上（确保与厚纸无缝隙），以斜面上方距离供试品10 cm处为球体中心点，使黏着面向上且沿斜面方向的试验长度为5 cm，待供试品平整贴合后剥离保护层，重复测定3次并记录能够阻止钢球滚落的最大球编号，结果显示自制制剂和参比制剂的初黏力分别为28号和27号球。

2.2 体外释放试验

2.2.1 HPLC色谱条件及方法学验证

采用ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为0.01%磷酸水溶液，流动相B为0.01%磷酸乙腈溶液，梯度洗脱（0~5 min，45% B；5~6 min，45%→85% B；6~10 min，85% B，10~11 min，85%→45% B；11~15 min，45% B）；检测波长为222 nm；柱温为45℃；流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL。

方法学验证结果表明：洛索洛芬钠在0.055  7~167.210 0 μg/mL浓度范围内呈现良好线性关系（Y=36.217 3X+13.307 9，r=0.999 9）。准确度验证显示：5%浓度（5.57 μg/mL）的回收率为92.82%~92.96%（符合90.0%~110.0%标准），50%、100%、150%浓度（55.74、111.48、167.21  μg/mL）的回收率为99.37%~100.58%（符合95.0%~105.0%标准），12份准确度溶液的RSD为3.4%（＜5.0%）。精密度试验中，单个分析人员测定的供试品溶液释放速率RSD分别为4.9%和2.8%（n=6），双人测定的RSD为4.0%（n=12），均满足＜15%的接受标准。

2.2.2 体外释放度测定

根据《局部起效化学仿制药体外释放（IVRT）与体外透皮（IVPT）研究技术指导原则（试行）》 [7]和In Vitro Release Test Studies for Topical Drug Products Submitted in ANDAs Guidance for Industry[8]，建立了体外释放试验方法：采用直立式Franz扩散池（直径1.9 cm），以1 μm聚醚砜膜分隔两室，接收池中加入18  mL生理盐水作为释放介质，维持膜表面温度（32±0.5）℃、转速400 r/min，于1、2、3、4、5、6 h时间点各取样2 mL（同时补液），样品经0.45 μm滤膜过滤后，采用HPLC法测定，计算单位面积累积释放量（μg/cm²）并对其与时间平方根进行线性回归，斜率即为释放速率。自制制剂与参比制剂各测定6个平行样。结果显示：自制制剂和参比制剂的释放速率分别为96.4 μg/（cm²·h^1/2）和99.0 μg/（cm²∙h^1/2），较为一致，且自制制剂与参比制剂斜率比值的90%置信区间为94.40%~100.50%，在可接受范围内（75.00%~133.33%），自制制剂与参比制剂体外释放一致。

2.3 体外透皮试验

根据《局部起效化学仿制药体外透皮（IVPT）研究技术指导原则（试行）》[7]，采用直立式Franz扩散池（直径1.9 cm）进行体外透皮试验。巴马香猪皮肤固定于扩散池两室之间（角质层面向供给室），接收池中加入18 mL pH 7.4磷酸盐缓冲液（含0.01%硫酸庆大霉素），维持皮肤表面温度（32±0.5）℃、搅拌转速400 r/min。分别于4、6、8、10、12、16、20、24 h取样2 mL（同步补液），样品经0.45 μm滤膜过滤后采用HPLC分析。

IVPT研究的关键参数包括药物渗透速率（通量J，μg/cm²/h）和总累积渗透量（total cumulative amount，AMT，μg/cm²）。以J和单位面积累积渗透量为纵坐标、时间为横坐标绘制曲线，分别反映药物的渗透速率和渗透程度。试验共使用4张猪皮，每张猪皮分别制备自制和参比制剂各4个皮肤切片，最终每组获得16个数据点。计算Jmax和AMT24h，并进行自然对数转换，采用平均生物等效性方法评价，若90%置信区间落在80.00%~125.00%范围内，则判定两制剂体外透皮行为等效。

表1、图1和图2结果显示，自制与参比制剂的J-时间曲线和累积渗透量曲线趋势一致，AMT24h和Jmax的90%置信区间均在等效范围内（80.00%~125.00%），表明两者体外透皮特性一致，符合生物等效性要求。

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  表格1 自制制剂与参比制剂单位面积累积渗透量和J结果（n=16）

  Table 1.Cumulative permeation amount per unit area and J results of self-made formulation and

  reference formulation (n=16)

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  图1 自制制剂与参比制剂单位面积累积渗透曲线（n=16）

  Figure 1.The cumulative permeation per unit area profiles of the self-made formulation and the reference formulation (n=16)

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  图2 自制制剂与参比制剂J曲线（n=16）

  Figure 2.J profiles of the self-made formulation and the reference formulation (n=16)

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2.4 生物等效性研究

2.4.1 研究设计

本研究采用单中心、随机、开放、单剂量、两制剂、两周期、两交叉设计，比较自制制剂与参比制剂在健康受试者空腹条件下的生物等效性。每周期给药剂量均为100 mg/贴。

2.4.2 受试者选择

研究经长治医学院附属和平医院伦理委员会批准（伦理审批号：和医伦审字【2024】试26号），共纳入52例18~55周岁健康受试者。入选标准包括：男性体重≥50.0 kg，女性体重≥45.0 kg；体重指数19.0~26.0 kg/m²。所有受试者均签署知情同意书。

2.4.3 给药方案

每周期将试验贴剂贴敷于肩胛骨下腰背部（第1周期左侧，第2周期右侧），持续24 h。两周期之间设置足够洗脱期以消除药物残留影响。

2.4.4 血样采集与处理

在每周期给药前0 h（贴敷前1 h内）及给药后4、8、12、16、20、22、24（揭除前）、26、28、30、32、36、40、44、48、60、72 h分别采集静脉血4 mL至预先贴好标签的K2-EDTA抗凝管中，轻柔颠倒混匀5~8次后于1 h内于4℃条件下1 700×g离心10 min，将所得血浆在2  h内转移至-90~-60℃超低温冰箱保存；检测时取150 µL血浆加入96孔板，依次加入25 µL内标工作液和500 µL乙腈，脉冲涡旋5 min后4℃条件下1 700×g离心15 min，转移450 µL上清至新96孔板，氮气吹干后加入150 µL乙腈-水（10 ∶ 90）复溶，涡旋5 min后取20 µL上清液进行LC-MS/MS分析。

2.4.5 分析方法及方法学验证

①分析方法。色谱分析采用Boltimate C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流动相A为含0.1%甲酸、1 mmol/L乙酸铵和5%乙腈的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱（0~4 min，28% B；4~4.1 min，28%→95% B；4.1~6 min，95% B；6~6.1 min，95%→28% B；6.1~8 min，28% B）；流速为0.4 mL/min；柱温为40℃，进样量为20 µL。质谱检测采用电喷雾离子化（electrospray ionization，ESI）负离子模式，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）方式，电喷雾电压-4 500 V，离子喷雾温度600℃，气帘气压力35 psi，数据采集时间8 min。

②方法学验证。洛索洛芬和trans-OH洛索洛芬分别在0.400~80.000 ng/mL和0.400~40.000 ng/mL范围内呈良好线性。洛索洛芬批内精密度≤6.6%（准确度偏差-1.8%~6.3%），批间精密度≤5.8%（准确度偏差0.3%~3.9%）；trans-OH洛索洛芬批内精密度≤5.5%（准确度偏差-9.6%~7.6%），批间精密度≤5.3%（准确度偏差-7.3%~4.6%）。所有验证参数均符合要求，表明该方法适用于人血浆中洛索洛芬及其代谢产物的浓度测定。

2.4.6 测定结果与分析

本研究共入组52例健康受试者，其中3例退出研究：K020（第2周期因不良事件退出）、K040（第2周期自行退出）和K047（两个周期均自行退出）。采用LC-MS/MS法测定血浆中洛索洛芬及其trans-OH代谢产物的浓度，所得平均血药浓度-时间曲线见图3和图4。

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  图3 洛索洛芬平均血药浓度-时间曲线

  Figure 3.Mean blood drug concentration-time curve of loxoprofen

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  图4 洛索洛芬钠代谢产物平均血药浓度-时间曲线

  Figure 4.Mean blood drug concentration-time curve of loxoprofen sodium metabolites

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使用SAS 9.4软件通过非房室模型计算药代动力学参数，自制制剂与参比制剂的平均药动学参数比较结果见表2和表3。结果显示，两种制剂中洛索洛芬及其trans-OH代谢产物的T_max、t_1/2、C_max、AUC_0~t和AUC_0~∞等药代动力学参数均较为接近。生物等效性分析表明：洛索洛芬的C_max、AUC_0~t和AUC_0~∞几何均值比的90%置信区间分别为101.59%（97.70%，105.63%）、100.67%（96.51%，105.01%）和100.40%（96.37%，104.60%）；其trans-OH代谢产物的对应参数分别为101.55%（97.72%，105.53%）、101.79%（97.63%，106.13%）和101.43%（97.42%，105.61%），所有参数均落在80.00%~125.00%的生物等效性接受范围内。双单侧t检验结果与置信区间法一致，且受试者个体内变异系数（C_max、AUC_0~t和AUC_0~∞）均＜15%，充分证明自制制剂与参比制剂具有生物等效性。

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  表格2 洛索洛芬药代动力学参数描述性分析 [ x ± s（CV%）]

  Table 2.Descriptive analysis of pharmacokinetic parameters of loxoprofen [ x ± s(CV%)]

  注：*以中位数（最小值，最大值）表示。

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  表格3 洛索洛芬钠代谢产物药代动力学参数描述性分析 [ x ± s（CV%）]

  Table 3.Descriptive analysis of pharmacokinetic parameters of loxoprofen sodium metabolites [ x ± s (CV%)]

  注：*以中位数（最小值，最大值）表示。

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3 讨论

本研究结果表明，洛索洛芬钠贴剂自制制剂与参比制剂在关键质量属性方面表现一致：初黏力测试结果相近（28号球 vs. 27号球），体外释放和透皮行为相似。更重要的是，人体生物等效性研究证实，自制制剂中洛索洛芬及其trans-OH代谢产物的主要药代动力学参数（C_max、AUC_0~t和AUC_0~∞）的90%置信区间均落在80.00%~125.00%的可接受范围内，确证了两种制剂的生物等效性。

在方法学方面，本研究采用的Franz扩散池法相较于《中国药典（2020年版）》四部收载的桨碟法[9-11]更具优势：一方面更贴近临床实际使用场景（皮肤贴敷状态），另一方面能更准确地反映药物的释放动力学特征[12-13]和透皮吸收行为[14-16]，这些特性对于外用贴剂的质量评价至关重要[17]。

当前，国内外对局部皮肤外用制剂生物等效性评价缺乏统一标准，这不仅延缓了仿制药的审批进程，也导致国内市场长期被进口原研药垄断，严重影响用药可及性。本研究创新性地基于药物作用机制（抑制前列腺素合成）、靶向部位（皮下组织）、全身吸收特性（血药浓度可检测）以及血药浓度-效应相关性，选择PK-BE作为评价方法。这种策略不仅显著降低了研发成本（较临床终点法节省约60%费用）和开发周期（缩短12~18个月），还能加速仿制药上市，有效缓解医保压力并提高患者用药可及性，为同类外用制剂的生物等效性评价提供了重要参考。

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