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目的 采用网络药理学方法探究栀子调控铁死亡治疗脑缺血再灌注损伤（CIRI）的分子机制。
方法 采用中药系统药理数据库及分析平台（TCMSP）获取栀子有效活性成分及其预测靶点，利用基因卡（GeneCards）数据库收集获取CIRI的基因靶点，通过韦恩图工具获得栀子有效活性成分和CIRI的交集基因。利用Cytoscape 3.9.1软件构建栀子、活性成分以及预测靶点间的相互关系网络图。应用R语言软件对“栀子-CIRI”交集基因进行基因本体（GO）富集和京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析。使用铁死亡FerrDb数据库，收集铁死亡的相关基因，对栀子活性成分、CIRI、铁死亡三者间的公共靶点进行综合分析并预测栀子调控铁死亡干预CIRI的有效成分及靶点。
结果 从栀子中筛选出有对应基因靶点的65个有效活性成分进行相关预测，得到缺氧诱导因子RE-1亚基α（HIF-1α）、肿瘤蛋白P53（TP53）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、血红素加氧酶1（HMOX1）、一氧化氮合酶2（NOS2）、核因子κB（NF-κB）亚基-RELA原癌基因（RELA）、白细胞介素-6（IL-6）等24个栀子调控铁死亡干预CIRI的可能作用靶标，介导HIF-1、肿瘤坏死因子（TNF）、MAPK和Toll样受体信号通路等途径调控铁死亡过程，从而对CIRI损伤产生治疗作用。
结论 栀子可能通过调控铁死亡途径治疗CIRI。
脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）是由于大脑长时间缺血后重新恢复血流灌注引起进行性加重的脑损伤，其发病率和死亡率较高，病理机制复杂，与氧化应激、炎症损伤等多种病理过程相互作用以及细胞凋亡、细胞焦亡等多种细胞死亡方式有关，最终导致线粒体功能障碍、血脑屏障破坏及神经元坏死[1-2]。铁死亡是一种以铁代谢紊乱和脂质过氧化物过度蓄积为特征，有别于凋亡与坏死的细胞程序化死亡方式。研究显示，铁死亡作为新的细胞死亡方式参与CIRI，脑缺血再灌注模型中出现神经元铁死亡，药物通过抑制铁死亡可以显著减轻CIRI [3- 4]。铁死亡已经成为CIRI干预的重要潜在靶点[5]。寻找干预铁死亡的中药及其有效组分，可能成为CIRI药物研究的方向之一。
中医理论中，CIRI属“中风”范畴，郁而化热，热毒上犯于脑络导致中风，因此清热解毒法是治疗中风的有效手段[6]。中药栀子性寒而味苦，长于清热泻火、凉血解毒，在临床治疗缺血性脑卒中应用广泛，是中风常用药物清开灵、醒脑静注射液、天麻钩藤饮以及安宫牛黄丸等的重要组成药材。现代医学证实栀子具有抗氧化、抗炎等药理作用，能显著改善大脑中动脉栓塞 /再灌注（middle cerebral artery occlusion/reper-fusion, MCAO/R）大鼠神经功能评分，减轻脑损伤，提升脑组织的超氧化物歧化酶（SOD）活性，且有效降低丙二醛（MDA）水平、显著改善脑内环氧化酶-2（COX-2）和5-脂氧合酶（5-LOX）的活力[7-8]，降低白细胞介素（IL）- 6、IL-1B、肿瘤坏死因子（TNF）-α水平，提示栀子可能通过调控铁死亡从而减轻CIRI，发挥对CIRI的保护作用。本研究利用网络药理学，从药物到相关靶点，系统地研究“栀子有效活性成分-靶点-疾病-通路”之间的相互作用网络关系，分析栀子调控铁死亡治疗CIRI的潜在作用机制。
1 资料与方法
1.1 栀子生物活性成分的收集和筛选
在中药系统药理数据库及分析平台（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP）（https://old.tcmsp-e.com/index.php）首页搜索栏，检索输入“ZHIZI”，下载收集栀子的所有活性成分的ID、名称以及预测靶点信息，并去除无预测靶点的活性成分，得到栀子有效活性成分及其作用靶点名称。
1.2 栀子的药物基因靶点预测
在UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）中，利用首页UniProtKB搜索功能，检索全部基因靶点信息，筛选限定物种为“human”，选择已验证基因“reviewed”，保存靶点信息后，将栀子活性成分预测靶点匹配到全部靶点信息中对应的标准化基因名称，进而将从TCMSP数据库中收集得到的栀子活性成分的靶点名称，转换为UniProt中的标准化基因名称，得到栀子的药物基因靶点。
1.3 栀子-化合物-靶点网络的构建
将获得的栀子生物活性成分和基因靶点输入Cytoscape 3.9.1软件，网络节点表示基因靶点和生物活性成分，以便表示其之间的相互作用。
1.4 CIRI的基因靶点收集
在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）中搜索获得CIRI相关的人类基因靶点，检索词为“cerebral ischemia reperfusion injury”，得到CIRI的全部基因靶点。
1.5 收集栀子治疗CIRI的相关靶点
将栀子基因靶点的结果与CIRI的疾病相关基因进行匹配。通过韦恩（Venny）图在线工具实现药物-疾病靶点的可视化和绘制Venny图，收集栀子和CIRI的交叉基因靶点作为栀子治疗CIRI的相关靶点，这可能是栀子治疗CIRI的潜在靶点。
1.6 蛋白质互作网络的构建与核心基因的筛选
将栀子和CIRI的共同基因靶标输入String数据库（https://string-db.org/）。筛选限定物种参数为人类“Homo sapiens”，默认置信度为“0.40”，网络中未连接的节点设置为“HID”。蛋白质互作网络（protein-protein interaction networks，PPI）分析结果保存PNG格式图片，同时下载TSV格式网络关系结果，将其导入Cytoscape 3.91软件制成网络图，节点按度（degree）值排序进行可视化分析。在Cytoscape的内置插件中，CytoHubba及其最大集团中心度（maximal clique centrality，MCC）算法能够有效预测核心基因靶点的算法[9]。通过MCC拓扑算法确定关键核心靶点，即栀子治疗CIRI的关键靶点，并构建栀子治疗CIRI的核心子网络，此核心子网络在共同基因互相作用网络中发挥着重要作用。
1.7 基因通路与生物学功能分析
通过R软件（https://www.r-project.org/）可以实现各种生物信息学分析和结果可视化。首先，利用R-Studio软件，从AnnotationHub和org.Hs.eg.db包获得每个核心基因的Ensmbl基因ID，然后通过DOSE、cluster Profiler和ggplot2等R包进行基因本体（gene ontology, GO）功能分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）途径分析并对各富集结果进行可视化。在编程语言中，设置了“pValue Cutoff=0.05”和“ValCIRIue Cutoff=0.05”。分析结果选择了GO富集分析中生物过程（biological process, BP）、分子功能（molecular function, MF）和细胞成分（cellular components, CC）的前10项以及与关系最密切的前20条信号通路，然后将GO分析的结果展示为条形图，KEGG分析的结果展示为气泡图。
1.8 铁死亡调控基因获取及其与栀子、CIRI三者靶点的综合分析
FerrDb数据库（http://www.zhounan.org/ferrdb/）是关于铁死亡相关基因靶点的数据库，在FerrDb数据库分别收集铁死亡相关的驱动、标记以及抑制基因，将其导出并进行汇总去重得到铁死亡总调控基因。将铁死亡总调控基因和栀子参与调控CIRI的交集基因输入至Venny图工具，提取其公共基因，即栀子通过调控铁死亡干预CIRI的基因靶点，将这些靶点导入String数据库，操作同“1.6”项，得到PPI图和对应的可视化图。通过R软件对三者间的公共基因进行GO和KEGG信号通路分析，将GO分析的结果展示为条形图，将KEGG分析的结果展示为气泡图。
1.9 “药物-活性成分-靶点-通路”网络的构建与分析
将栀子的活性化合物与筛选的前20条信号通路及其作用核心靶点基因结合，应用Cytoscape 3.9.1软件构建“药物-活性成分-靶点-通路”网络，探究栀子调控铁死亡抗CIRI过程中潜在的活性成分-靶点-通路相互作用关系。
2 结果
2.1 栀子中生物活性成分的鉴定
通过检索TCMSP数据库，获得包括藏红花酸、京尼平、栀子苷、槲皮素等化合物在内的98种栀子活性成分，去除无预测靶点的活性成分，最终获得65种栀子有效活性成分，将其命名为ZZ1~ZZ65，结果具体见表1。
2.2 药物靶点的获取与“药物成分-靶点”网络的建设
在TCMSP数据库中搜索获得的栀子生物活性成分的靶点，在UniProt数据库中进行蛋白质基因命名转化，得到687个靶点；剔除重复数据后，得到248个靶点。通过将包含有靶点的生物活性成分和基因靶点的文件输入Cytoscape 3.9.1软件，成功构建了“药物成分-靶点”网络（图1），其中圆形代表生物活性成分，菱形代表各靶点。在“药物成分-靶点”网络中有314个节点和1 372条边。
2.3 疾病靶点的获取
通过在GeneCard数据库中搜索和整合，得到1 513个CIRI基因靶点；将CIRI的靶点与栀子的靶点相交，得到152个相互交叉的基因，即药物-疾病靶点Venny图（图2）。
2.4 PPI的构建与拓扑结构
栀子调控CIRI作用靶点PPI图见图3，该图共152个节点，代表所有预测得到的基因靶点，含有3 291条连线，代表靶点间相互作用。利用插件Cytohubba中的MCC算法，筛选得前20个核心靶点，包括IL-6、IL-1B、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、AP-1转录因子亚基-JUN原癌基因（JUN）、IL-10、TNF、Toll样受体4（TLR4）、IL-4、干扰素γ（IFN-γ）等。这些基因的相互作用，可能在栀子干预CIRI病理过程中产生重要影响，PPI图见图4，前20个核心靶点筛选结果见表2。
2.5 GO功能分析
对栀子和CIRI的预测靶点基因进行GO富集分析，集中筛选GO功能分析排名前10的类别进行说明。MF涉及对活性氧类的反应、对脂多糖的反应、对氧化应激的反应等。CC分析表明，靶点主要分布在膜筏、膜微域、胞膜小窝、质膜筏、泡腔、转录因子复合体等。BP包括细胞因子受体结合、DNA结合转录因子结合、细胞因子活性和RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合等。图5为GO分析条形图。
2.6 KEGG富集分析
KEGG分析得到201个条目，包括磷酯酰肌醇3激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、TNF、IL- 17、缺氧诱导因子（HIF）-1和Toll样受体信号通路等。图6显示了KEGG分析中与CIRI关系最密切的前20条信号通路。
2.7 铁死亡调控因子的获取及其与栀子、CIRI三者共同靶点筛选和分析
在FerrDb数据库中收集铁死亡相关调控基因，含有108个驱动基因，109个抑制基因，123个标记物，汇总去重后得到259个铁死亡总调控基因。将这259个基因与上述筛选的152个交集基因进行Venny分析，共得到24个靶点（图7），包括HIF-1α、肿瘤蛋白P53（TP53）、MAPK8、血红素加氧酶1（HMOX1）、一氧化氮合酶2（NOS2）、PTGS2、核因子κB（NF-κB）亚基-RELA原癌基因（RELA）、IL-6等。栀子调控铁死亡抗CIRI作用靶点PPI图及其可视化分析结果（图8和图9）。通过R软件对得到的三者间的24个公共基因进行GO和KEGG分析，然后将GO分析的结果显示为条形图（图10），MF包括细胞对化学应激的反应、对活性氧类的反应、对氧化应激的反应以及DNA模板转录对应激反应的调控等；CC分析表明，靶点主要分布在转录调节复合物、膜筏、膜微域、胞膜窖和质膜筏等；BP包括RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、DNA结合转录因子结合等。将KEGG富集分析的结果显示为气泡图，共得到HIF-1、TNF、MAPK和Toll样受体等信号通路等187条信号通路，经过筛选与疾病无关的通路，展示前20条通路（图11）。
2.8 “药物-活性成分-靶点-通路”网络综合分析
“药物-活性成分-靶点-通路”网络见图12，由图可知，主要11种活性化合物作用于上述20种信号通路，分析显示槲皮素（MOL000098）、苏丹红Ⅲ（MOL004561）、栀子苷（MOL004557）、山柰酚（MOL000422）等成分发挥着重要作用；PTGS2、MAPK1、TLR4、RELA、IL-6、NOS2可能是栀子调控铁死亡抗CIRI的关键靶点。
3 讨论
铁死亡的概念是由Dixon等[10]于2012年首次提出，主要表现为氧化还原异常、铁代谢紊乱、脂质过氧化物的过度蓄积，呈现出一种非凋亡的新的程序性细胞死亡形式。而CIRI以炎症级联反应、氧化应激为主要特征，再灌注引起大量的活性氧（ROS）和炎性因子的释放，从而导致脑水肿和神经功能缺陷。研究发现，铁代谢失调、脂质过氧化物蓄积和谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶4（GSH/GPX4）轴紊乱与CIRI密切相关，提示铁死亡可能参与了CIRI的病理过程[11-12]。调控铁死亡可能成为干预CIRI的有效治疗手段。
铁死亡与氧化应激关系密切，致病机制类似，铁死亡可能是氧化应激重要的组成部分[13]。本研究显示，栀子主要通过作用于HIF-1α、TP53、MAPK8、HMOX1、NOS2、RELA和IL-6等靶点，影响氧化应激反应调控铁死亡，发挥治疗CIRI的作用。
本研究通过检索TCMSP数据库，获得包括藏红花酸、京尼平、栀子苷、槲皮素等65种栀子有效活性成分，栀子对CIRI的治疗作用与这些成分的生物效应高度相关，近年来大量报道了这些单体成分对缺血性脑卒中的改善作用。栀子苷通过促进星形胶质细胞分泌生长因子，营养已受损神经元[14]，并改善内皮细胞氧化应激[15]，提高脑内COX-2和5-LOX的活力[8]，对CIRI神经元具有保护作用。藏红花酸通过干预氧化应激，提高脑内SOD的活性、降低脑内一氧化氮（NO）和MDA的水平，对CIRI有明显的改善作用[16]。研究表明京尼平可以增强线粒体自噬，减轻ROS累积，缓解CIRI[17]。山柰酚被报道可通过激活Wnt3a/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路，上调神经营养因子分泌，促进缺血性脑卒中小鼠神经元再生[18]。槲皮素可以降低MCAO小鼠的脑组织炎症因子和MDA水平，调节PI3K/Akt/mTOR通路，促进缺血性卒中小鼠康复[19]。也有研究表明槲皮素可有效提高MCAO 模型大鼠海马和额叶皮质区的谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽（GSH）、SOD和谷胱甘肽还原酶（GR）活性[20]。
HIF-1α在脑缺血后神经元和星形胶质细胞中的表达显著上调，通过转铁蛋白受体增加细胞对铁的摄取来加重铁累积，继而诱导铁死亡[21]。栀子苷可以通过抑制局灶性脑缺血损伤引起的HIF-1α过渡表达发挥脑保护作用[22]。TP53编码的肿瘤抑制因子p53是细胞铁死亡发生过程中的重要启动调节因子，在ROS的应激下，p53可抑制SLC7A11的转录以及表达，使胱氨酸严重缺乏，从而诱导细胞发生铁死亡[23-24]。MAPK8 又名 JNK，编码Jun氨基末端激酶。作为p53 重要的上游信号，JNK信号通路的激活可导致p53表达增加[23-25]。JNK1/2 的抑制剂可以减少脂质ROS的产生，抑制铁死亡，另外铁死亡诱导剂的干预能引起相关蛋白p-JNK的表达显著增加[26]。有研究显示熊果酸可上调JNK/p53信号表达诱导肿瘤细胞发生铁死亡，但在脑缺血/再灌注中的作用尚未见报道[27]。HMOX1 编码血红素加氧酶1（HO-1），铁死亡过程中，HO-1是铁代谢紊乱性脂质过氧化的必需酶。Kwon等[28]证实HO-1通过下调过氧化物酶-6的表达，促进脂质过氧化，从而诱导细胞铁死亡。另有研究证实Nrf2-HO-1途径可以调节细胞内铁浓度[29]，高水平的HMOX1催化铁的积累，进一步诱导ROS的产生，促进了细胞的氧化应激，导致铁死亡的发生[30]。栀子总环烯醚萜苷可以下调大鼠脑出血后HO-1的表达，抵抗脂质过氧化，从而减轻脑损伤[31]。槲皮素通过调节Nrf2/HO-1信号通路，提升GSH水平，抑制CIRI诱导的氧化应激损伤[32-33]。NOS2在经过伊拉斯汀（Erastin）/RSL3 诱导的铁死亡过程中显著表达，被认为是一种铁死亡标记[34]。栀子苷干预下的MCAO大鼠脑组织内SOD、GPX和NOS的活性显著上调，细胞内 ROS水平大量降低，减少了细胞死亡[35]。
炎症反应是脑缺血/再灌注的主要病理特征，而铁死亡与炎症反应关系密切，研究报道铁死亡具有较强的促炎作用，会导致损伤模式相关分子 （DAMPs）的大量释放，使固有免疫活化，引起IL-1β和IL-6等促炎因子的释放和促炎通路活化；另外，铁死亡过程中，可通过LOX和COX产物促进炎性因子释放，加重炎症反应[36]；给予铁死亡抑制剂可抑制铁死亡，降低组织中IL-1β和 TNF-α含量，从而有效干预CIRI。
NF-κB转录因子家族介导了炎症、免疫和凋亡等诸多生物过程，在各种进程中是一系列信号转导的终点，NF-κB通路也是调节细胞氧化还原状态的关键。RELA为原癌基因，编码NF-κB的p65亚基，研究中RELA在铁死亡抑制剂处理后出现下调[37]，表明其可能参与了铁死调控亡。TLR4激活NF-κB和蛋白激酶磷酸酶家族等活化反应，加重炎症反应。
IL-6是参与机体免疫、炎症反应的重要细胞因子，在CIRI急性期作为炎症介质，促进脑损伤。研究显示缺血增加IL-6等细胞因子的表达，通过JAK/STAT3途径增强铁代谢调节肽铁调素的表达，使膜铁转运蛋白表达和细胞铁释放减少，导致铁蓄积[38]。ROS升高激活了NF-κB信号通路，使得IL-6和IL-1β的表达相应增加；而IL-6和IL-1β是铁调素抗菌肽（HAMP）的前体，导致HAMP基因表达增加。研究表明HAMP对铁代谢有调节作用，当铁超载时，HAMP表达高度上调，抑制了铁蛋白的功能，导致细胞内Fe2+的大量聚集和脂质过氧化反应，最终导致铁死亡 [39- 40]。而GPX4 可以通过调控 NF-κB信号通路来实现抑制LOX和ROS的含量，减轻炎症反应[41]。相反，GPX4的缺乏，可显著诱导炎症反应产生和加重[42]。
本研究也存在一定局限性：第一，本研究依赖于TCMSP、GeneCards和FerrDb等数据库对各个化合物/靶点数据的富集能力，对于数据库未收纳的信息可能有所遗漏导致分析结果不够全面；第二，鉴于中药化学成分的复杂性，入体各化学成分可能相互作用发挥治疗作用，去除无预测靶点的活性成分可能会忽略药物相互作用关系，同时放大一些“明星”化学成分及其靶点的生物学效应，但另一方面，将效应富集到研究更透明、数据更充裕的TOP化学成分和靶点上，从化合物单体药效研究和后续药物的开发角度来说也有一定研究价值。
本研究通过网络药理学的方法，预测出栀子有效成分对应的24个核心靶点基因，可干预CIRI的铁死亡进程，可能是未来行之有效的治疗方向，后续仍需实验进一步验证。
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