目的  利用正交试验优选四黄烧伤膏的提取工艺，并建立四黄烧伤膏HPLC指纹图谱，为该制剂的质量评价提供参考。

方法  以四黄烧伤膏复方为模型药物，采用HPLC法建立指纹图谱，对指纹图谱共有峰峰面积进行主成分分析，以总因子得分为评价指标，采用正交试验法，对提取次数、提取时间、溶剂倍量等条件进行优化，筛选出最优提取工艺参数。

结果  在特征图谱研究中，共确定了12个共有峰。利用主成分分析法提取的2个主成分累计方差贡献率达到84.751%，计算9个样本的综合得分指标。正交试验得出的最佳提取工艺为加水10倍量，提取3次，每次2 h。

结论  该研究所建立的方法简单有效，适合四黄烧伤膏复方的提取，可以为四黄烧伤膏提取工艺优化提供参考。

四黄烧伤膏由首乌藤、合欢皮、地榆、甘草等中药组成，具有清热、解毒、燥湿的功效，临床常用来治疗烧和烫伤。方中首乌藤中的二苯乙烯苷具有抗炎、抗氧化、神经保护等作用[1]，现代研究表明，二苯乙烯苷可通过抑制小胶质细胞释放促炎因子发挥其抗炎作用，从而抑制小胶质细胞的活化减轻神经炎症反应[2]。合欢皮的主要活性成分是丁香树脂酚类化合物，具有镇静、抗焦虑等药理作用[3]。甘草的主要活性成分为甘草酸铵和甘草苷，现代药理学研究表明甘草苷具有抗菌、抗炎、解痉、镇痛、抗溃疡等作用[4-5]；甘草酸铵能显著降低特异性皮炎模型小鼠白细胞介素-33及其受体致癌抑制因子2的血清水平，抑制其在皮肤组织中的转录和蛋白表达，明显降低肥大细胞的活化程度，从而减轻瘙痒症状[6]。四黄烧伤膏为临床经验方，但制剂的提取工艺需进行研究优化。中国药典2020年版对四黄烧伤膏复方中各药材的1种或2种成分做了定量检测要求[7]，目标成分太少，作为四黄烧伤膏的质量控制方法显得不够科学和全面。

近年来，中药指纹图谱技术是一种定性兼定量的分析手段，具有较高的系统性和整体性，能够全面、准确及整体地反映药材的提取情况，已经广泛应用于中药材的质量评价及其提取工艺的优化研究中[8-11]。指纹图谱结合主成分分析（principal component analysis, PCA）既可以浓缩简化数据，又可以解决指标成分不全面的问题[12-15]。为此，本试验建立四黄烧伤膏指纹图谱分析方法，采用PCA构建评价指标，设计正交试验，优选水提工艺参数，为四黄烧伤膏的质量评价和临床应用提供技术支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695/2996液相色谱系统，包括DAD二极管阵列检测器和Empower工作站（美国沃特世公司）；XAD205DU电子分析天平（德国梅特-勒托利多公司）；DQ-250DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

甘草酸铵（批号：110731-202021）、甘草苷（批号：111610-201908）、（－）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（批号：111911-201804）和2, 3, 5, 4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批号：110844-201915）均购于中国食品药品检定研究院，纯度均＞98%；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

合欢皮、首乌藤、地榆、甘草饮片均购自安国市聚药堂药业有限公司，经河南省中医药研究院刘杰研究员鉴定，均符合中国药典2020年版一部相关项下规定[7]。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dikma DiamongsiL C₁₈色谱柱（250  mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙睛（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脱（0~8 min，14%A；8~45 min，14%~50%A；45~50 min，50%~100%A；50~55 min，100%~14%A；55~60 min，14%A）；检测波长：254 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL·min^-1，进样量：10 μL[16]。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取甘草酸铵、甘草苷、（－）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷和2, 3, 5, 4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加甲醇分别制成0.212 0，0.182 0，0.232 0，1.440 0 mg·mL^-1的对照品储备液。分别精密吸取4种成分的对照品储备液适量，至10 mL量瓶中，配制成每1 mL含甘草酸铵、甘草苷、（－）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷和2, 3, 5, 4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷分别为159.00，18.20，23.20，72.00 μg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

称取合欢皮、首乌藤、地榆、甘草等处方量药材，共9份，置于圆底烧瓶中，分别按照L₉（3⁴）正交表进行提取，提取液浓缩并转移至1 000 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为正交试验储备液。精密吸取上述储备液25 mL，转移至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得9份正交试验供试品溶液，样品编号分别为S1~S9。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下对照品储备液适量，加甲醇稀释成不同系列质量浓度的标准溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）对质量浓度（X，μg·mL^-1）作线性回归，各成分的回归方程、相关系数和线性范围见表1。

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  表格1 各成分线性关系

  Table 1.Linear relationships of various constituents

  

2.5 精密度、重复性和稳定性试验

按照中国药典2020年版[7]方法进行考察。在精密度和稳定性试验中，甘草酸铵、甘草苷、（－）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷和2, 3, 5, 4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面积的RSD均＜2.35%，表明仪器精密度和供试品24 h稳定性良好。在重复性试验中，4种成分的平均含量为3.45，2.40，0.27，3.33 mg·g^-1，RSD均＜ 2.67%，表明方法重复性良好。

2.6 指纹图谱方法学考察

2.6.1 精密度试验

取S1号正交试验条件下的供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，连续进样6次，记录色谱图。以出峰时间居中且稳定的的8号色谱峰（甘草苷）为参照峰，计算得12个共有峰的相对保留时间RSD为0.23%~0.82%，相对峰面积RSD为1.13%~1.65%（n=6），表明该仪器精密度良好。

2.6.2 重复性试验

取S1号正交试验储备液，按照“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，共得到12个共有峰，计算得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.20%~0.69%（n=6）、1.01%~1.84%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.6.3 稳定性试验

取S1号正交试验条件下的供试品溶液，室温放置，分别在制备后0，2，6，12，24 h，按“2.1”项下条件进样，计算得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.36%~0.99%（n=5）、1.45%~1.74%（n=5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.4 加样回收率试验

精密量取已知含量的S1号供试品溶液，分别按已知含量的50%，100%和150% 3个水平加入各对照品，按照“2.3”项下方法处理样品并测定2, 3, 5, 4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、（－）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、甘草酸铵和甘草苷的含量，计算得其平均回收率分别为101.2%，99.6%，99.2%和100.8%，RSD分别为2.82%，1.99%，2.05%和2.31%（n=6），该方法准确性良好。

2.7 指纹图谱的建立

取S1~S9号正交试验供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，得到9个样品的HPLC色谱图（图1）。将色谱数据依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版），确定了12个共有峰，通过与对照品进行比对（图2），确定8号峰为甘草苷，9号峰为2, 3, 5, 4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，10号峰为（－）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，12号峰为甘草酸铵。

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  图1 不同提取条件下9个样品的HPLC指纹图谱

  Figure 1.HPLC fingerprint of nine samples with different ethanol extraction conditions

  

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  图2 混合对照品(A)和供试品(B)的HPLC色谱图

  Figure 2.HPLC chromatogram of mixed reference substance (A) and test sample (B)

  注：8. 甘草苷；9. 2, 3, 5, 4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；10. 丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷；12. 甘草酸

  

2.8 指纹图谱的PCA

2.8.1 主成分提取及累计贡献率计算

将正交试验S1~S9号供试品溶液指纹图谱中共有峰的峰面积导入SPSS 16.0软件进行PCA，提取特征值＞1的成分为主成分，获取代表原始数据的主成分及方差贡献率（表2）。结果表明，分析后共提取了两个主成分，第1主成分特征值为8.549，方差贡献率是71.243%；第2主成分特征值为1.621，方差贡献率是13.508%。两个主成分的累计方差贡献率为84.751%，说明提取的两个主成分可以反映供试品溶液指纹图谱中共有峰的大部分信息，同时也表明了前两个主成分能够代表最初的12个共有峰来分析四黄烧伤膏的含量组成。

在第1主成分中，峰1、峰3~7、甘草苷、2, 3, 5, 4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、（－）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、峰11、甘草酸铵的系数较大，说明第1主成分主要反映上述11个色谱峰的信息；第2主成分主要反映色谱峰2的信息。因子载荷图见图3。

• 
  表格2 PCA解释总变量

  Table 2.The explanatory total variable of PCA

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  图3 因子载荷图

  Figure 3.Factor load diagram

  

2.8.2 综合评价

利用SPSS 16.0软件计算得两个主成分的得分，再根据其特征值及特征向量（表2），推导出主成分综合评价线性表达式Y=0.841Y1+0.159Y2（Y代表综合得分，Y1为主成分1，Y2为主成分2），综合评分结果见表3。

• 
  表格3 不同提取方法的主成分得分和综合得分

  Table 3.PrincipaL component scores and comprehensive scores of different extraction methods

  

2.9 提取工艺的正交试验优化

本研究选取提取次数（A）、提取时间（B）和加水量（C）3个因素为考察对象，以PCA的综合评分为评价指标，对四黄烧伤膏的提取工艺进行L₉（3⁴）正交试验筛选，试验因素与水平见表4，提取工艺的正交试验设计与结果见表5，方差分析结果见表6。

• 
  表格4 因素水平表

  Table 4.Factors and levels

  

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  表格5 正交设计及结果

  Table 5.Design and results of orthogonal test

  

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  表格6 方差分析结果

  Table 6.Results of variance analysis

  注：F0.05(2,2)=19.00

  

由表5直观分析可知，S3提取液综合评分最高。表6方差分析显示，提取次数对结果有显著影响（P＜0.05），影响程度顺序为提取次数＞加水量＞提取时间，虽然加水量和提取时间无显著影响，但随着提取时间和加水量增加，综合评分有升高的趋势，所以最优工艺确定为10倍量的水提取3次，每次2 h。

2.10 验证试验

依据处方比例称取上述饮片3份，进行验证试验，按优化的提取工艺制备供试品溶液，综合分析各共有峰面积得到3份供试品的平均综合得分为2.76。提取液中的甘草酸铵、甘草苷、（－）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷和2, 3, 5, 4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷质量浓度分别为142.90，92.50，9.00，102.60 mg·L^-1，RSD分别为2.66%，1.08%，2.22%，1.67%（n=6），试验证明，优化的条件稳定，具有良好的重现性。

3 讨论

四黄烧伤膏由首乌藤、合欢皮、地榆、甘草等中药组成，中国药典2020版[7]规定了2, 3, 5, 4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、（－）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、甘草酸铵和甘草苷分别是中药材首乌藤、合欢皮、甘草中的指标性成分。中药复方成分具有多成分和多靶点等特点，仅仅以指标性成分作为指标考察提取工艺，不能全面反映提取的效果。中药指纹图谱法是一种反映中药材或复方内部多种活性成分的定性或定量分析方法，具有较高的系统性和整体性，能够全面、准确、整体地反映药材的提取情况，该方法以色谱峰的相对保留时间和相对峰面积进行定性，以色谱峰面积进行定量，具有定性兼定量的特点[17- 19]。该法已广泛应用于中药材及其制剂的提取分离。

本研究设计L₉（3⁴）正交试验表，建立了相应提取条件下的指纹图谱，确定了12个共有峰，并进行PCA，共提取了两个主成分，第1主成分特征值为8.549，方差贡献率是71.243%；第2主成分特征值为1.621，方差贡献率是13.508%。两个主成分的累计方差贡献率为84.751%，说明提取的2个主成分可以反映供试品溶液指纹图谱中共有峰的大部分信息，这种简化数据、浓缩数据的统计学方法在不丢失原来色谱图主要信息的前提下，避开了变量间共线性的问题。本研究通过PCA计算出9种不同提取方法的综合得分，并以此作为评价指标，进行正交试验方法分析，得出四黄烧伤膏复方提取时使用10倍量的水提取3次、每次2 h的优化方案。

本研究建立的指纹图谱较为全面，且方法简便，通过降维处理多种活性指标来考察正交试验提取方案，可以更全面地反映提取物的成分信息，该研究结果可为四黄烧伤膏的质量控制提供试验依据。

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