目的  采用Box-Behnken设计-响应面法优化狗脊总酚酸的提取工艺，并评价其体外抗氧化活性。

方法  以液料比、乙醇浓度和提取温度为影响因素，总酚酸提取率为评价指标，在单因素考察的基础上，运用三因素三水平的Box-Behnken设计-响应面法优化狗脊总酚酸的最佳提取工艺。测定狗脊总酚酸提取物对ABTS·+和DPPH·的清除效果。

结果  狗脊总酚酸最佳提取工艺为：乙醇浓度55%、提取温度88℃、液料比60 ∶ 1 mL/g，此条件下提取率可达8.67%。总酚酸提取物质量浓度为2 mg/ mL和1 mg/mL时，对ABTS·⁺、DPPH·的清除率分别为92.76%和88.66%。

结论  响应面优化法试验理论值与实测值较一致，得到的狗脊总酚酸提取工艺简便可行，狗脊总酚酸提取物具有良好的体外抗氧化活性

狗脊来源于蚌壳蕨科Dicksoniaceae植物金毛狗脊Cibotium barometz (L.) J. Sm.的干燥根茎，具有祛风湿、补肝肾和强腰膝的功效，可用于风湿痹痛、腰膝酸软和下肢无力等病症[1]。金毛狗脊主产于我国云南、贵州、四川南部、广西、广东、福建、台湾、海南岛、浙江、江西和湖南南部（江华县）等地[2]。狗脊含有多种活性成分，其中酚酸是狗脊发挥治疗骨质疏松[3]、抗炎[4]、肝保护[5]等药理活性的重要成分，不同产地狗脊总酚酸含量在3.72%~6.16%之间[6]。大量研究表明，植物酚酸具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌等[7-10]。本研究通过对狗脊总酚酸的提取工艺进行优化，并测定狗脊总酚酸提取物的体外抗氧化活性，对金毛狗脊的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

CPA225D分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；GX-03多功能粉碎机（浙江高鑫工贸有限公司）；HHS-6数显恒温水浴锅（绍兴市苏珀仪器）；N-1200A旋转蒸发仪和SB-1100水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；CA-1111冷却水循环系统（托普仪器有限公司）；UV-2600紫外可见分光光度计[岛津（上海）实验器材有限公司]；Centrifuge 5424小型台式高速离心机[艾本德（中国）有限公司]；Synergy H1多功能酶标仪[安捷伦科技（中国）有限公司]；Biosafer-10A真空冷冻干燥机[赛飞（中国）有限公司]。

1.1.2 主要药品与试剂

狗脊经中山大学药学院徐新军副教授鉴定为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz (L.) J. Sm.的干燥根茎，将狗脊药材洗净，晒干，除去金黄色绒毛，粉碎，过60目筛，备用；福林酚（批号：C14878641）、没食子酸（批号：C10688770， 纯度≥99%）均购于上海麦克林生化科技有限公司；无水碳酸钠（上海精化科技研究所，批号：20180610）；抗坏血酸（天津市致远化学试剂有限公司，批号：20210810）；DPPH自由基清除能力试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20230616）；总抗氧化能力（ABTS法）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：112122230515）；其余试剂均为分析纯，水为纯净水。

1.2 方法

1.2.1 供试液的制备

精密称取狗脊药材粉末适量，并加入适宜体积的乙醇溶液，回流提取一定时间后，过滤，除去滤渣，稀释后即得。

1.2.2 没食子酸标准曲线的绘制

采用福林酚比色法[11]。精密称量没食子酸适量，加蒸馏水溶解制得母液，浓度为0.862 8  mg/mL；精密量取适量没食子酸母液至量瓶中，蒸馏水定容后，得系列浓度对照品溶液；于25 mL具塞比色管内精密加入各浓度对照品溶液1 mL，并加入5 mL蒸馏水和1 mL福林酚，混匀，避光静置10 min后，加入预先配制的8%碳酸钠溶液4  mL，蒸馏水定容，作为样品组；另取1 mL蒸馏水同法操作，作为空白组。该体系在45℃避光反应60 min，于775 nm处测定吸光度（A）值。以A值为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标（C，mg/mL），绘制标准曲线，计算得线性回归方程：A=4.708 7C-0.009  9（r=0.999  5），没食子酸在0.051 8~0.172 6 mg/mL浓度范围内线性良好。

1.2.3 单因素试验

称取0.500 g狗脊粉末，依次考察液料比（20，30，40，50，60 mL/g）、乙醇浓度（30%，40%，50%，60%，70%）、提取温度（60，70，80，90，100℃）和提取时间（30，60，90，120，150 min）对狗脊总酚酸提取率的影响。按“1.2.2”项下方法检测各影响因素下提取液A值，代入标准曲线，计算总酚酸提取率（以没食子酸计），各因素试验均重复3次。

1.2.4 Box-Behnken设计-响应面法优化试验

参考文献[12-15]，在上述单因素试验的基础上，选择乙醇浓度、提取温度、液料比为主要影响因素，以狗脊总酚酸提取率为响应值，应用软件Design-Expert 13.0设计三因素三水平的Box-Behnken设计-响应面法（以下简称“响应面法”）试验，以获得狗脊总酚酸的最佳提取工艺。响应面法试验的因素水平设计见表1。

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  表格1 响应面法试验的因素与水平

  Table 1.Factors and levels of response surface methodology test

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1.2.5 抗氧化活性研究

参考文献[16-17]方法对最佳工艺提取的狗脊总酚酸提取物进行体外抗氧化活性评价。在最优工艺条件下提取狗脊总酚酸，过滤，旋蒸除去溶剂，真空冷冻干燥得到冻干粉，备用。

①ABTS·⁺自由基清除能力检测：将试剂盒中ABTS溶液与氧化剂溶液按说明书进行混合，混合液在室温、避光条件下静置12 h，作为ABTS工作母液；将母液用超纯水稀释成ABTS工作液（A_{734 nm}为0.70±0.05），将提取物配制成0.125，0.25，0.5，1.0，2.0 mg/mL系列浓度梯度溶液，在96孔板中加入10 μL狗脊提取物溶液和200 μL ABTS工作液，作为样品组；空白组中加入10 μL超纯水代替提取物溶液；对照组则加入200 μL 超纯水代替ABTS工作液；以抗坏血酸为阳性对照；加样完成后在酶标仪上震荡10 s，室温孵育6 min后，于734 nm处测定A值，每个浓度平行3次，取平均值，计算提取物溶液对ABTS·⁺自由基的清除率，清除率（%）=[1－(A_样-A_对照)/A_空白]×100%。

②DPPH·自由基清除能力检测：配制0.05，0.125，0.25，0.5，1.0 mg/mL系列浓度提取物溶液，取离心管，加入400 μL提取物溶液和600  μL DPPH工作液，作为样品组；空白组将提取物溶液更换为80%甲醇溶液；对照组则将DPPH工作液更换为80%甲醇溶液；以抗坏血酸为阳性对照；混匀，室温下避光反应30 min，以80%甲醇为参比，于517 nm处测定A值，每个浓度平行3次，取平均值，按①项下公式计算DPPH·自由基的清除率。

2 结果

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对总酚酸提取率的影响

由图1可知，随着乙醇浓度的增加，总酚酸提取率增加，在60%时达到最大值。超过60%时提取率下降，可能是乙醇浓度增大时，增加了狗脊中非水溶性成分的溶出，导致总酚酸的溶出减少，故选择乙醇浓度范围为50%~70%进行下一步研究。

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  图1 乙醇浓度对总酚酸提取率的影响 (n=3)

  Figure 1.Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total phenolic acids (n=3)

  

2.1.2 液料比对总酚酸提取率的影响

由图2可知， 随着液料比的增大，总酚酸提取率不断增加，当液料比大于40 ∶ 1 mL/g时，总酚酸提取率增加缓慢，但是提取溶剂过多会造成浪费，故选择液料比范围为40 ∶ 1~60 ∶ 1  mL/g进行下一步研究。

• 
  图2 液料比对总酚酸提取率的影响 (n=3)

  Figure 2.Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of total phenolic acids (n=3)

  

2.1.3 提取温度对总酚酸提取率的影响

由图3可知，随着温度的升高，总酚酸提取率也不断升高，温度升高加快了狗脊中酚酸类物质的溶出。当温度为90℃时，总酚酸提取率达到了最大值，当温度继续升高时，提取率稍有下降，可能是某些酚酸类物质在高温时不稳定[18]，温度过高时部分会分解，故选择提取温度范围为80~100℃进行下一步研究。

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  图3 提取温度对总酚酸提取率的影响 (n=3)

  Figure 3.Effect of extraction temperature on the extraction rate of total phenolic acids (n=3)

  

2.1.4 提取时间对总酚酸提取率的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，总酚酸提取率逐步增加，当提取时间超过60 min时，提取率随着时间的延长变化不明显，且回流时间过长会导致部分酚酸分解，故选择提取时间为60 min。

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  图4 提取时间对总酚酸提取率的影响 (n=3)

  Figure 4.Effect of extraction time on the extraction rate of total phenolic acids (n=3)

  

2.2 响应面法优化

2.2.1 响应面设计对狗脊总酚酸提取率的影响

根据上述单因素试验结果选取液料比、乙醇浓度、提取温度3个因素进行后续工艺优化，以狗脊总酚酸提取率为响应值，设计三因素三水平的响应面分析试验，结果见表2。对得到的响应面结果进行二次回归响应分析，建立多元二次响应面回归模型，得到狗脊总酚酸提取率（Y）对液料比（A）、乙醇浓度（B）、提取温度（C）的二次多项回归方程为Y=8.41+0.287 5A -0.257 5B+0.132 5C+0.042 5AB+0.007 5AC-0.007 5BC+0.068 7A²-0.326 2B²+0.013 7C²，该模型的方差分析结果见表3。由结果可知，模型P ＜0.01，该模型差异显著；失拟项P=0.822 6＞0.05，差异无统计学意义，说明该模型的拟合较好。该模型相关系数R²=0.946 6＞0.9，表示该回归模型拟合度较好。变异系数（coefficient of variation, CV）=1.45%＜5%，表明模型稳定性良好。

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  表格2 狗脊总酚酸提取工艺响应面试验设计结果 (n=3)

  Table 2.Design-response surface experiment results of extraction process of total phenolic acids from Cibotii rhizoma (n=3)

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  表格3 狗脊总酚酸提取工艺的响应面模型方差分析

  Table 3.Analysis of variance of response surface model of total phenolic acids from Cibotii rhizoma

  注：*表示差异显著P＜0.05，**表示差异极显著P＜0.01。

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根据回归方程得到响应曲面图和等高线图（图5~图7），由等高线及响应面图可知相关因素两两交互对狗脊总酚酸提取率的影响，曲面坡度与等高线形状对交互作用强弱具有直接决定影响[19]，曲面坡度陡峭，等高线呈椭圆则表示两个因素有较强的交互作用，反之则较弱。结合表3，可知各因素对狗脊总酚酸提取率的影响大小顺序为：A液料比＞B乙醇浓度＞C提取温度。

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  图5 液料比和乙醇浓度的二维等高线和三维响应面图

  Figure 5.2D contour and 3D response surface diagram of liquid-solid ratio and ethanol concentration

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  图6 液料比和提取温度的二维等高线和三维响应面图

  Figure 6.2D contour and 3D response surface diagram of liquid-solid ratio and extraction temperature

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  图7 提取温度和乙醇浓度的二维等高线和三维响应面图

  Figure 7.2D contour and 3D response surface diagram of ethanol concentration and extraction temperature

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2.2.2 最佳工艺条件的预测和验证

采用Design expert 13.0 软件，通过Quadratic模型，预测得出狗脊总酚酸的最佳提取工艺，模型预测的最佳提取条件为：液料比为57.56 ∶ 1 mL/g，乙醇浓度为56.86%，提取温度为88.55℃。考虑实际操作，确定狗脊总酚酸的最佳提取工艺条件为：液料比为60 ∶ 1 mL/g，乙醇浓度为55%，提取温度为88℃。在该条件下经过3次验证试验得到的狗脊总酚酸含量为8.67%，与预测值8.69%一致，表明该工艺合理，模型可靠。

2.3 抗氧化活性测定

^{2.3.1 狗脊总酚酸提取物清除ABTS·+自由基作用}

从图8可以看出，狗脊总酚酸提取物具有清除ABTS·⁺自由基的能力，其清除能力随着浓度增加而提高，在浓度为2 mg/mL时的清除率达92.76%。在相同质量浓度下，狗脊总酚酸提取物的清除能力弱于抗坏血酸。

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  图8 狗脊总酚酸提取物对ABTS·+自由基的清除能力

  Figure 8.ABTS·+ free radicals scavenging ability of total phenolic acids extract from Cibotii rhizom

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2.3.2 狗脊总酚酸提取物清除DPPH·自由基作用

从图9可以看出，狗脊总酚酸提取物具有清除DPPH·自由基的能力，清除能力随着浓度增加而逐渐提升，浓度为0.25 mg/mL时清除率达到85.07%，浓度大于0.25 mg/mL时，狗脊总酚酸提取物的清除率接近抗坏血酸的清除率，在1.0 mg/mL时的清除率为88.66%。

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  图9 狗脊总酚酸提取物对DPPH·自由基的清除能力

  Figure 9.DPPH· free radical scavenging ability of total phenolic acids extract from Cibotii rhizoma

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3 讨论

狗脊中的酚酸是狗脊发挥药理活性的重要成分，具有较高的研究价值。本文通过单因素试验结合Box-Behnken设计响应面法评价狗脊中总酚酸的提取，优化得到的最佳提取工艺为：液料比为60 ∶ 1 mL/g，乙醇浓度为55%，提取温度为88℃。狗脊总酚酸实际得率与预测值一致，说明该提取工艺可用于狗脊总酚酸的提取。响应面法通过非线性数学模型连续对各个水平进行综合设计，相较于正交设计，响应面法能够找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值[20]，其用于提取总酚酸的模型预测能力和数据处理能力高、结果直观准确，该方法考虑了各因素之间的相互影响，结果接近于真实情况，可行性高。在抗氧化实验中，狗脊总酚酸对DPPH·自由基和ABTS·⁺自由基均具有良好的清除能力，且在相同浓度下，狗脊总酚酸对DPPH·自由基的清除能力强于对ABTS·⁺自由基的清除能力。狗脊可作为天然抗氧化剂，其机制可能是通过螯合金属离子和清除自由基等途径来抑制氧化。

目前市场上的狗脊药材均来源于野生资源，但近年来野生资源数量在不断减少[2]，因此有必要加强对狗脊资源利用的研究。本实验初步探索了狗脊总酚酸的提取工艺及抗氧化性，但只考察了其对DPPH·自由基和ABTS·⁺自由基的清除能力，不能对狗脊总酚酸的抗氧化能力作出全面地评价，故狗脊总酚酸抗氧化作用机制仍需进一步研究。另外后续还需进一步优化液料比以适用于大规模生产。进一步加强狗脊中活性成分提取工艺及作用机制的研究，对其应用潜力进行充分挖掘，可为金毛狗脊资源的充分利用与广泛开发提供参考。

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