目的  基于HPLC指纹图谱和网络药理学对五味消毒饮中的质量标志物（Q-marker）进行预测。

方法   建立15批五味消毒饮的指纹图谱，并对其进行峰指认和峰归属，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012年版）进行分析；通过 网络药理学对核心靶点及通路进行筛选，构建“成分-靶点-通路”网络图；以Q-marker“五原则”为核心预测五味消毒饮的质量标志物。

结果  15批五味消毒饮指纹图谱相似度大于0.95，标定13个共有峰，对其中11个特征峰进行指认，分别为新绿原酸、绿原酸、秦皮乙素、隐绿原酸、马钱子苷、断氧化马钱子苷、菊苣酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、蒙花苷；通过网络药理学分析，推测绿原酸、秦皮乙素、断氧化马钱子苷、菊苣酸、蒙花苷5个成分可能为五味消毒饮的潜在Q-marker，其可能通过调节肿瘤抑制因子p53/癌蛋白Mdm²、酪氨酸蛋白激酶SRC等多个基因以及胰腺癌、前列腺癌等多条癌症疾病通路来发挥抗肿瘤、抗癌功效；同时还对五味消毒饮可用于治疗新型冠状病毒肺炎进行预测分析。

结论  建立的五味消毒饮HPLC指纹图谱分析方法灵敏、快速且稳定；结合网络药理学筛选出具有溯源性和可预测性，且与五味消毒饮临床应用相关的5个化合物作为其潜在Q-marker，为今后五味消毒饮的进一步研究提供参考。

五味消毒饮原方出自清代吴谦所著的《医宗金鉴》[1]，且于2018年被收录入国家中医药管理局所颁布的《古代经典名方目录（第一批）》名单。全方由金银花、蒲公英、野菊花、紫花地丁、紫背天葵子5味药物组成，具有清热解毒、消散疔疮之效，常用于治疗疔毒，痈疮疖肿；物质组成主要为黄酮类、香豆素类、酚酸类以及含氮类化合物[2]；现代临床多用于治疗肿痛、丹毒和带状疱疹等多种皮肤类疾病[3]。另有研究发现，五味消毒饮及加减方在癌症细胞增殖及凋亡、癌症患者术后、患者癌性发热等方面也具有良好的治疗效果[4-5]。

中药成分结构复杂，现行质量标准大多专属性差，导致药效无法准确控制。因此刘昌孝院士提出“质量标志物（quality marke，Q-marker）”的概念以期对中药质量进行有效控制[6]。HPLC指纹图谱作为目前适用范围最广的中药质量检测方法，不仅具有操作简单、准确度和灵敏度高等特点，还可较为全面地反映中药中的化学成分，是中药质量控制和鉴别真伪的有效手段[7]。网络药理学作为一门新兴学科，通过结合各种组学、高通量筛选、网络可视化等多种技术，构建并分析“药物-靶点-通路”之间的关系网络，可有效筛选出中药及复方中的药效成分及作用靶点，揭示中药发挥药效的作用机制[8-9]。

本研究通过HPLC指纹图谱和网络药理学手段，紧密贴合可测性、溯源性、特有性、有效性和处方配伍的质量标志物预测“五原则”，对不同产地、不同批号的五味消毒饮基准样品进行Q-marker预测。建立五味消毒饮科学、系统且全面的质量控制评价体系，同时为今后五味消毒饮相关制剂质量标准提供依据，也为其他经典名方及单味中药质量评价提供参考思路。

1 材料

1.1 主要仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限有限公司）；XPE105型析天平和 AL204型万分之一电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；DK-98-II电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；101-2电热恒温鼓风干燥箱（上海天缘试验化器厂）；SJIA-10N-50A冷冻干燥机（宁波双嘉化器有限公司）；KM-500DB型超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110753-201716，纯度≥99.3%）；新绿原酸（批号：CHB170914，纯度≥98%）、隐绿原酸（批号：CHB170828，纯度≥98%）、马钱子苷（批号：CHB180108，纯度≥98%）、断氧化马钱子苷（批号：CHB170906，纯度≥98%）、异绿原酸A（批号：CHB171013，纯度≥ 98%）、异绿原酸B（批号：CHB160725，纯度≥98%）、异绿原酸C（批号：CHB160726，纯度≥98%）、蒙花苷（批 号：CHB161106，纯度≥98%）、秦皮乙素（批号：CHB170907，纯度≥98%）、菊苣酸（批号：CHB160905，纯度 ≥98%）等对照品均购自成都克洛玛生物科技有限公司；乙腈、甲酸为色谱纯；其余试剂为分析纯；水为怡宝纯净水。

药材和饮片来源于多个产地，产地信息见表 1。经湖南省中医药研究院刘浩老师鉴定均为正品，符合《中国药典（2020年版）》等相关标准。依据古法煎煮所得的5种药材饮片干膏得率高低进行调配制得基准样品， 结果见表1。

2 方法与结果

2.1 五味消毒饮样品的制备

五味消毒饮始载于清代吴谦所著《医宗金鉴》，文中所述该方组成及服用方法为：“金银花三钱，野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子各一钱二分。水二盅，煎八分，加无灰酒半盅，再滚二、三沸时，热服。渣，如法再煎服，被盖出汗为度。” 根据国家管理中医药局所颁布的经典名方关键信息表（7首方剂）及相关考证信息确定，“一钱”约为今之3.73 g，“一盅”等于200 mL。由此确定制备方法为：称取金银花11.19 g，野菊花4.48 g，蒲公英4.48 g，紫花地丁4.48  g，紫背天葵子4.48 g，共29.11  g；上述药加水400 mL，煎至160 mL，加黄酒100 mL，再煮沸2~3次，趁热过滤，煎煮2次，合并2次滤液，采用冷冻干燥机，冷冻48 h，即得。五味消毒饮基准样品出膏率信息见表1。

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  表格1 五味消毒饮药材产地信息、出膏率及基准样品出膏率

  Table 1.The medicinal material origin information, paste rate, and reference sample paste rate of Wuwei disinfection decoction

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2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品：新绿原酸1.5 mg、绿原酸9 mg、隐绿原酸1 mg、马钱子苷2 mg、断氧化马钱子苷2 mg、异绿原酸A 2 mg、异绿原酸B 2 mg、异绿原酸C 4 mg、蒙花苷18 mg、菊苣酸1.5  mg和秦皮乙素1.5 mg，置于量瓶中，加入甲醇溶液，定容至10 mL，制成混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定“2.1”项下所制得的样品约0.5 g，加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率：500 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 色谱条件

色谱柱为Inert Sustain C₁₈柱（250 mm× 4.6  mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水，梯 度洗脱（洗脱程序见表2）；流速为1.0  mL/ min；进样量为5 μL；柱温为25 ℃；检测波长为254  nm。

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  表格2 梯度洗脱程序

  Table 2.The gradient elution program

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2.5 方法学考察

2.5.1 重复性试验

精密称取同一（编号：S1）五味消毒饮基准样品0.5 g，按照“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.4”项下色谱条件进样检测。以绿原酸为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD，结果各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.5%（n=6），相对峰面积RSD均小于5%（n=6），各图谱相似度均大于0.95，表明该方法重复性良好。

2.5.2 精密度试验

精密称取同一（编号：S1）五味消毒饮基准样品0.5 g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4”项下色谱条件连续进样6次。以绿原酸为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD，结果各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.2%（n=6），相对峰面积RSD均小于3%（n=6），各图谱相似度大于0.95，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验

精密称取同一（编号：S1）五味消毒饮基准样品0.5 g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4”项下色谱条件分别在0，2，4，6，8，l0，12，14，16，18，20，22，24 h进样检测。以绿原酸为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD，结果各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.6%（n=13），相对峰面积RSD均小于5%（n=13），各指纹图谱相似度大于0.95，表明该供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 五味消毒饮指纹图谱的建立及相似度评价

取15批五味消毒饮基准样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4”项下色谱条件进样检测，记录相关色谱图。导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）进行数据分析，选择S1为参照图谱，采用平均数法，时间宽度设置为0.1 min，进行多点校正及Mark峰匹配，生成五味消毒饮批量指纹图谱及对照图谱（R），见图1。共标定13个色谱峰，通过对照品指认出1号峰新绿原酸、4号峰绿原酸、5 号峰秦皮乙素、6号峰隐绿原酸、7号峰马钱子苷、8号峰断氧化马钱子苷、9号峰菊苣酸、10号峰异绿原酸B、11号峰异绿原酸A、12号峰异绿原酸C、13号峰蒙花苷11个特征峰。设置S1为参照图谱，计算15批五味消毒饮指纹图谱的相似度，结果S1~S15指纹图谱相似度为： 0.997、0.981、0.994、0.997、0.991、0.990、0.992、0.998、0.997、0.999、0.996、0.997、0.990、0.980、0.997，可见15批样品指纹图谱相似度均大于0.95，表明各批次样品稳定，重复性良好。

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  图1 15批五味消毒饮指纹图谱及对照图谱

  Figure 1.The fingerprints of 15 batches of Wuwei disinfection decoction and control atlas

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2.7 共有峰指认及峰归属研究

依据供试品溶液制备方法，制备单味药材溶液、各阴性样品溶液及五味消毒饮供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件依次进样检测，将单味药、阴性样品溶液和供试品溶液进行比对，对五味消毒饮进行峰归属，见图2。可见五味消毒饮指纹图谱共有峰中，共指认出13个色谱峰，经对照品指认出11个特征峰，指认率达84.6%，具体见表3。

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  图2 五味消毒饮样品色谱峰归属

  Figure 2.The assignment of chromatographic peaks of Wuwei disinfection decoction

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  表格3 色谱峰指认及归属

  Table 3.Identification and attribution of chromatographic peaks

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2.8 基于成分-靶点-通路的网络药理学分析

2.8.1 基于可预测性和溯源性化合物筛选

金银花作为五味消毒饮中的君药，主要含有有机酸类、环烯醚萜类、黄酮类等多种化合物[10]。其中有机酸主要为绿原酸类化合物，绿原酸是金银花发挥抗炎抑菌功效的重要成分[11]。新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C均为绿原酸的同分异构体，由于不饱和键和酚羟基的存在，使其结构易分解；但药理作用相似，主要具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等多种药理作用[12]。同时绿原酸也在蒲公英[13]、紫花地丁[14]、野菊花[15]中存在。断氧化马钱子苷属于环烯醚萜类化合物，该类化合物具有清热解毒、抗炎镇痛等药理作用[16]。野菊花主要含有有机酸、黄酮类化合物[15]，蒙花苷为一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[17]。紫花地丁主要含有有机酸类、香豆素类、黄酮类化合物[14]，秦皮乙素作为主要的香豆素类成分具有抑菌、抗炎、抗肿瘤、调节免疫等作用[18]。蒲公英主要含有酚类、黄酮类化合物，其中菊苣酸作为酚类化合物具有抗炎、抗肿瘤等药理作用[13]。紫背天葵子主要含有生物碱类、酚类化合物，临床上可用于治疗肿瘤、肾病等疾病[19]。

《中国药典（2020年版）》中绿原酸、断氧化马钱子苷为金银花指纹图谱检测指标，同时绿原酸也是金银花含量测定指标成分；秦皮乙素则是紫花地丁含量测定指标成分；菊苣酸为蒲公英含量测定指标成分；蒙花苷为野菊花含量测定指标成分。因此基于文献研究及指纹图谱溯源性和可测性，暂选择绿原酸、秦皮乙素、断氧化马钱子苷、菊苣酸和蒙花苷5个活性化学成分作为候选化合物。

2.8.2 五味消毒饮主要化学成分靶点预测

从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索五味消毒饮5个主要活性化学成分的Canonical SMILES号，再进入SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）物种选择“Homo sapiens”进行靶点预测，去除重复靶点后，共得到靶点335个。

2.8.3 蛋白质互作网络构建

将筛选得到的335个靶点导入STRING数据库（https://cn.string-db.org/），于Organisms选项中选择“Homo sapiens”，蛋白交互评分值“high confidence＞0.9”，并隐藏无联系节点，其余参数不变，得到248个靶蛋白的蛋白质互作网络（protein-protein interaction networks，PPI）图（图 3）。将PPI图以TSV文件下载，导入Cytoscape 3.7.2软件中，利用其中的“Network Analyzer”功能对结果进行拓扑属性分析，计算选取接近中心性、介数中心性和度值3个拓扑参数均大于中位数且度值＞20的靶点作为核心靶点，最终得到26个核心靶点，结果见表4。

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  图3 成分靶点PPI网络图

  Figure 3.The PPI network diagram of component targets

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  表格4 核心靶点的拓扑学性质

  Table 4.The topological properties of core targets

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2.8.4 GO功能富集分析及KEGG通路功能富集分析

利用David 数据库（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）对所获得的核心基因进行GO功能富集分析和KEGG通路功能富集分析。GO分析及KEGG分析均选取P＜0.01且错误发现率＜0.01为具有统计学意义。GO功能分析共得到110个条目，其中生物过程（biological process，BP）占64条，细胞组成（cell composition，CC）占14条，分子功能（molecular function，MF）占 32条。选取显著性前20条目进行展示，结果见图4，其主要涉及蛋白质磷酸化、胞质溶胶、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、泛素蛋白连接酶结合等过程。KEGG分析共得到115条显著通路，选取与五味消毒饮显著相关的前20条通路进行展示（图5），主要涉及癌症肿瘤、病毒感染、乙型肝炎、内分泌抵抗等。

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  图4 五味消毒饮GO分析富集图

  Figure 4.The GO enrichment chart of Wuwei disinfection decoction

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  图5 五味消毒饮KEGG通路富集分析

  Figure 5.The KEGG pathway enrichment analysis of Wuwei disinfection decoction

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2.8.5 “成分-靶点-通路”网络图构建

将从五味消毒饮样品中筛选得到的5个化合物、26个核心靶点及排名前20条的信号通路运用Cytoscape 3.7.2软件构建出“成分-靶点-通路”网络图（图6）。由图可知，化合物通过作用多个靶点进而在不同信号通路上发挥作用。

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  图6 “成分-靶点-通路”网络图

  Figure 6.Figure 6 .The "component-target-pathway" network diagram of Wuwei disinfection decoction

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2.8.6 Q-marker分析及网络药理学分析

五味消毒饮具有抗炎、抑菌、调节免疫等多重药理活性[20-21]。此外，该方在癌症、肿瘤方面也具有一定的治疗作用，其作用机制可能与诱导癌症细胞凋亡有关[4,21]。研究发现，主要活性成分绿原酸[22]及秦皮乙素[23]可通过阻滞肿瘤细胞生长、增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等过程发挥抗肿瘤作用；断氧化马钱子苷经体外实验证实具有广谱抗肿瘤活性[24]；菊苣酸[25]在体内和体外实验中均被证实对胃癌细胞具有良好的抑制效果；蒙花苷 [26]可通过调控κB抑制因子激酶（IKK）/核因子κB（NF-κB）信号通路来抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭。通过本实验中网络药理学结果分析推测，上述5个化学成分可能作用于多个癌症基因靶点发挥抗肿瘤作用。其中包括TP53，TP53体细胞突变是人类癌症最常见的突变之一，且TP53突变几乎发生在所有类型的癌症中[27]。SRC作为最古老的癌症基因之一，与细胞增殖、血管生成和骨代谢等调控途径密切相关，而SRC阻断药可抑制调控途径进而抑制肿瘤的形成，其中酪氨酸蛋白激酶LYN、LCK、FYN均属于该基因家族（SFK）[28]。CCNA2在结肠癌中组织发现具有高表达性，CCNA2的下调可通过阻碍细胞周期进程和诱导细胞凋亡来显著抑制结直肠癌细胞生长[29]。CDK1在肝癌组织中具有高表达性，且影响患者愈后[30]。在GO富集分析中发现五味消毒饮对蛋白质丝氨酸 /苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白质磷酸化、表皮生长因子受体等多条信号通路途径具有调节意义。对KEGG通路富集结果分析可知：五味消毒饮中这5个化学成分主要在肿瘤癌症、内分泌、炎症等通路中起调节作用。对前20条通路结果进行分析，ErbB信号通路失调是使正常细胞获得肿瘤干细胞致瘤性和干性等特性的重要原因[31]；通路结果涉及胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等多类癌症。

综上所述，五味消毒饮对肿瘤生长起到干预效果，其原因可能与下调多个肿瘤靶点、抑制多条肿瘤通路相关；与临床治疗多种癌症报道较为一致，符合有效原则，证明指纹图谱所选择的指标成分具有合理性。网络药理从理论上证明其有效性，将指纹图谱和网络药理两者联用对五味消毒饮进行Q-marker预测分析，以Q-marker“五原则”为核心推测出：绿原酸、秦皮乙素、断氧化马钱子苷、菊苣酸和蒙花苷可作为五味消毒饮的潜在Q-marker。

2.8.7 五味消毒饮治疗新型冠状病毒预测分析

在五味消毒饮网络药理学分析中，发现多个靶点与病毒、炎症相关，进而对五味消毒饮可用于治疗新型冠状病毒进行预测分析。新型冠状病毒（SARS-CoV-2）为新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的病原体，SARS-CoV-2可作用于绝大部分类型细胞中促炎细胞的应激发育，其中包括炎性小体形成、氧化应激等主要过程[32]。五味消毒饮被证实具有良好的抗炎及调节免疫作 用 [20]，金银花、野菊花、蒲公英、紫花地丁所含的槲皮素、木犀草素、山奈酚等化合物，作为多个对于COVID-19有治疗效果的中药及复方的核心共有成分[10,15]，可与新型冠状病毒3CLpro、ACE2、S蛋白等关键蛋白结合，抑制病毒进入细胞及在体内增殖[33]。网络药理学结果显示，五味消毒饮的多个核心靶点与炎症密切相关，AKT1是急性炎症反应发生的必要条件之一，其可通过改变血管细胞通透性而影响水肿、白细胞外渗等炎症现象的发生[34]；Src家族激酶磷酸化和活化则会引起中性粒细胞炎症[35]；新冠结构蛋白S蛋白可激活NF-κB通路触发炎症[36]，TP53不仅可抑制人体组织中的多种炎症且对NF-κB通路有良好的抑制效果[37]。因此五味消毒饮可能通过作用于这些炎症有关的基因靶点发挥抗炎作用，从而缓解COVID-19的临床症状。通过对KEGG富集分析发现ErbB信号通路、Th17细胞分化通路、TNF信号通路、MAPK 信号通路等多条信号通路可能通过改善炎症、调节免疫、抑制病毒复制来对COVID-19起到治疗作用[38-39]。综上，基于成分-靶点-通路层面分析推测，五味消毒饮可能通过抗炎和调节免疫对COVID-19产生治疗作用。

3 讨论

中药复方成分复杂，产地差异较大，本实验根据不同产地和不同批号之间药材的出膏率，对五味消毒饮进行合理组方。同时在HPLC指纹图谱试验中，对有机相、水相、色谱柱、溶剂用量、提取方式等多方面进行考察，以期确定最适宜的色谱条件及供试品制备方法。最终筛选出13个共有峰，并对其中11个特征峰利用对照品进行峰指认。经与各单味药阴性指纹图谱对比发现，色谱峰主要来源于金银花，证实金银花作为五味消毒饮的君药，发挥着主要的药效作用。但由于五味消毒饮的5个药物均为清热药，清热药主要含黄酮类、有机酸类、酚类化合物[40]，导致五味消毒饮中的某些药物化学成分略有重合，影响分离度。

对中药质量的控制是保证中药有效性和安全性的基石，对中医药事业的发展至关重要。本文基于Q-Marker“五原则”，先采用HPLC指纹图谱法对五味消毒饮色谱峰进行峰指认，体现了化合物的可测性。其次，五味消毒饮全方均为清热药，清热解毒法作为中医的常用抗癌疗法之一，对各类肿瘤疾病均表现出较强的治疗作用 [41]。因此从有效性原则，利用网络药理学对五味消毒饮中的绿原酸、秦皮乙素、断氧化马钱子苷、菊苣酸和蒙花苷进行靶点预测和通路富集分析；结果显示这5个化合物主要涉及TP53、SRC、CCNA2、CDK1等26个核心靶点，通路富集结果主要涉及膀胱癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等多类肿瘤。由于网络药理学结果显示五味消毒饮具有良好的抗炎及抗病毒的药理作用，进而对五味消毒饮可用于治疗COVID-19进行合理预测分析。但关于五味消毒饮治疗COVID-19的药理作用，仅从理论层面进行分析，仍需通过相关药理学实验进行验证。

综上所述，本实验基于中药化学和中药药理学，从可测性、有效性、溯源性多层面将绿原酸、秦皮乙素、断氧化马钱子苷、菊苣酸和蒙花苷5个化学成分筛选成为五味消毒饮的潜在Q-marker，为五味消毒饮的质量标准建立及后续研究提供参考。

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