目的  基于网络药理学及分子对接技术研究十味接骨方治疗骨关节炎的潜在作用靶点及机制。

方法  利用中药系统药理学数据库筛选十味接骨方的活性成分及对应靶点，并通过GeneCards、Digsee、DisGeNET数据库获取骨关节炎疾病靶点。然后将药物活性成分靶点及疾病靶点的交集录入STRING数据库，构建两者相互作用网络。采用clusterProfiler 3.8.1将所得交集靶点信息进行GO与KEGG富集分析。利用AutoDock 4.2.6软件对重要活性成分与靶点进行分子对接验证。采用细胞计数试剂盒-8及实时荧光定量多聚核苷酸链式反应技术对经十味接骨方处理后软骨细胞的细胞活力及骨关节炎关键基因的RNA表达进行检测。

结果  共得到 679个药物活性成分及2 411个作用靶点。主要活性成分为：木犀草素、乌索酸及汉黄芩素等。相关靶点主要为：蛋白激酶B（AKT1）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、血管生长因子A（VEGFA）、白细胞介素-1B（IL-1B）、肿瘤蛋白P53（TP53）、胱天蛋白酶3（CASP3）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等。富集分析结果显示十味接骨方抑制骨关节炎发生的关键通路为脂质与动脉粥样硬化信号通路。分子对接结果表明十味接骨方的主要活性成分木犀草素、乌索酸、汉黄芩素与骨关节炎关键靶点TNF、IL-6、VEGFA有较好的结合能。细胞活力及细胞增殖结果表明十味接骨方可以有效促进软骨细胞的生长增殖。基因及蛋白表达结果表明十味接骨方可以显著下调骨关节炎关键蛋白TNF、IL-6、VEGFA的表达。

结论  十味接骨方可能是通过组方中的木犀草素、乌索酸和汉黄芩素等主要活性成分调控脂质与动脉粥样硬化通路中TNF、VEGFA、IL-6等关键蛋白的表达，抑制骨关节炎的发展。

骨关节炎是一种因增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等引起的关节软骨退行性病变，其临床表现为关节疼痛、僵硬畸形和功能障碍[1-2]。据有关统计表明，目前全球约有2.5亿人患有骨关节炎，其中在北美、澳洲、日本等发达国家地区，80岁以上人群中，男性骨关节炎的发病率约为22%，女性罹患骨关节炎的概率高达30.3%，其每年因骨关节炎引发的劳动力流失所带来的经济损失占国民生产总值的1.0%~2.5%。在我国60岁及以上人群中，有骨关节炎表现的约占50%，其中30%~50%具有显著的临床表现[3]。此外，外伤及不良的生活习惯也使骨关节炎的发病近年来呈现低龄化趋势。因此，缓解骨关节炎患者的临床症状，提升治愈率是目前临床亟待解决的难题之一。

目前，骨关节炎的主要临床治疗方案包括：①物理治疗：通过理疗的方式增加局部血液循环、减轻炎症反应、改善肌肉紧张状态，以此缓解病情；②药物治疗：使用非甾体抗炎药、糖皮质激素、臭氧、利多卡因等药物缓解关节处疼痛，延缓病情发展，但仅能对症治疗，对关节的病变并无改善作用，且可能会加剧关节软骨的损伤，加重症状；③手术治疗：主要是针对保守治疗效果不佳且严重影响生活质量的患者，其主要包括：关节置换术、关节镜清理术及截骨术，虽可短期内缓解症状，但在长期疗效方面仍存在争议[4-5]。

除上述治疗方案外，随着传统中医药技术的快速发展，近年来越来越多的中药及有效活性成分被制备成各类剂型应用于骨关节炎的治疗，并取得了一定的研究成果[6-7]。十味接骨方是根据临床经典方制备的一种具有活血止痛，增加骨质生长功效的中药方剂。本方由续断、地黄、丹参、三七、牛膝、烫骨碎补、麸炒枳实、甘草、仙茅、千年健10味药材组成，处方组成稳定，内部已制定了稳定的质量标准。在前期临床研究中，十味接骨方已经被证明可缩短骨折愈后的病程，同时对于骨关节炎具有较好的治疗效果，临床反馈良好，但因组方复杂，药理学机制不明确，并未在临床得到广泛推广应用。因此本研究拟采用网络药理学及分子对接技术探究十味接骨方治疗骨关节炎的药理学机制，并佐以实验进行验证，以期为该组方的后续临床推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

Infinite F50酶标仪购自瑞士Tecan公司；生物安全柜和CO2细胞培养箱购自德国Thermo Scientific公司；实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（ RT-PCR）仪、1658001电泳槽和170-3930转膜槽购自美国Bio-Rad公司；XBT-1柯达医用X射线胶片购自美国Kodak公司。

1.1.2 主要药品与试剂

细胞计数试剂盒-8（CCK-8，货号： ml095229）

购自上海酶联生物科技有限公司；羊抗兔IgG（货号：G1213）和羊抗鼠IgG（货号：G1214）二抗购自武汉塞维尔生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抗体（货号：60291-1-IG）、血管生长因子A（VEGFA）抗体（货号：19003-1-AP）购自美国Proteintech公司；白细胞介素-6（IL-6）抗体（货号：ab259341）购自英国abcam公司；β-actin抗体（货号：GB11001）购自武汉塞维尔生物科技有限公司。

1.1.3 细胞

大鼠软骨细胞（货号：CP-R092）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 十味接骨方的制备

称取续断100 g、丹参40 g、地黄100 g、甘草10 g、骨碎补15 g、牛膝30 g、千年健10 g、三七10 g、仙茅10 g、枳实10 g，加水5 L将其充分浸泡，共煎煮2次，每次2 h；将2次的煎煮液合并过滤，定容至1 000 mL；将所得药液于-80 ℃冰箱中冷冻，后置于冷冻干燥机中冻干成粉末状，用于后续实验。

1.3 十味接骨方各组分活性化合物及核心靶点获取

以十味接骨方的组方药材为关键词，在中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）进行检索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18为标准筛选组方中活性化合物及靶点，然后通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）将靶点蛋白转化成相关基因。

1.4 骨关节炎相关靶点信息获取

在GeneCards（www.genecards.org/）、Digsee（http://digsee.com/）、DisGeNET（www.disgenet.org/）数据库中以“osteoarthritis”为关键词进行检索，去除重复值，得到骨关节炎疾病相关基因。

1.5 蛋白质相互作用网络的构建

取药物活性成分靶点及骨关节炎疾病靶点的交集，录入STRING数据库（https://www.string-db.org/），选取相互作用分值大于0.7的靶点基因构建相互作用网络。

1.6 基因富集分析

利用clusterProfiler 3.8.1软件，以小于0.05的校正的P值作为显著性富集的阈值将所得交集靶点信息进行GO与KEGG富集分析。其中GO分析由生物学过程、细胞组成和分子功能3个部分组成。GO与KEGG富集分析结果以-lgP值进行正序排序，并选取排序前10位的生物学过程、细胞组成、分子功能及通路信息进行制图展示。

1.7 分子对接

从PubChem化合物数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获得了活性成分的分子结构。在蛋白质结构数据库（protein data bank，PDB，http://www.rcsb.org/）中对关键靶点的蛋白构象进行筛选，其筛选标准为：①蛋白质晶体分辨率小于3；②选择有相关文献支持的蛋白质结构；③生物种属为人类。然后将所得活性成分和关键蛋白质的构象转换为PDBQT格式，去除所有水分子，添加极性氢原子[8]。利用AutoDock 4.2.6（http://autodock.scripps.edu/）软件内置的拉马克基因遗传算法进行分子对接，每次对接设置的运行次数为10，最大评价次数设置为2 500 000，其余为默认设置，而后使用PyMOL 2.3.2软件对对接结果进行可视化处理[9]。

1.8 细胞活力及细胞增殖能力检测

精密称取十味接骨方药粉，溶解于PBS中，制备成浓度为10%（w/v）的十味接骨药液；然后将大鼠软骨细胞种植于96孔板中，每孔细胞数目约为8 000个，再向96孔板中分别加入包含体积为10 μL和20 μL十味接骨药液的DMEM-F12培养基100 µL，作为实验组，以不含十味接骨药液DMEM-F12培养基培养的软骨细胞作为对照组；培养24~48 h后，分别吸除实验组和对照组培养板中的培养基，加入包含10 µL CCK-8的新鲜DMEM-F12培养基100 µL，孵育1 h后，取上清液使用酶标仪检测其在490 nm的吸光度（A）值，通过下列公式计算细胞活力值及细胞增殖率：

细胞活力（%）=实验组A值/对照组A值×100%

细胞增殖率（%）=（24或48 h各组A值/培养4 h后各组A值-1）×100%

1.9 关键基因mRNA表达检测

按“1.8”项下方法制备十味接骨药液；将大鼠软骨细胞种植于96孔板中，每孔细胞数目约为8 000个，再向96孔板中加入包含体积20  μL十味接骨药液的DMEM-F12培养基100 µL，作为实验组，以不含十味接骨药液的DMEM-F12培养基处理的软骨细胞作为对照组；培养48 h后加入1 mL Trizol试剂至细胞液中，裂解10 min；加入200 μL氯仿，室温放置5 min后1 610×g离心15 min；取上层水相，加入500 μL异丙醇，混匀后室温静置10 min，得到RNA；最后通过两步法将所得RNA逆转录为cDNA，采用RT-PCR检测软骨细胞中TNF-α、IL-6及VEGFA的mRNA表达。

1.10 关键基因蛋白表达检测

按“1.9”项下方法操作，分为实验组和对照组；培养48 h后，收集细胞，用PBS缓冲液漂洗2~3次，再用蛋白提取液抽提总蛋白质，并采用BCA法检测总蛋白浓度；将处理好的蛋白样品加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中，开始电泳，浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为130 V，待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶，于脱色摇床上振荡封闭1 h；封闭后的PVDF膜加入一抗IL-6（稀释比例为1 ∶ 1000）、TNF-α（稀释比例为1 ∶ 40 000）和VEGFA（稀释比例为1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；洗涤后，加入二抗羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG（稀释比例均为1 ∶ 2 000），室温孵育2 h；滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面侧，进行发光检测。

1.11 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行数据的统计分析，统计图均采用GraphPad Prism5软件制作。实验数据均以表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 十味接骨方活性成分及靶点筛选

以十味接骨方各组分药物名称为关键词在TCMSP数据库中进行检索，获得679个药物活性成分及2 411个作用靶点（表1）。去除重复值，在 UniProt数据库筛选剔除非人源靶点后，共得到274个药物成分作用靶点和10个重复活性成分（表2）。

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  表格1 十味接骨方治疗骨关节炎部分有效成分信息

  Table 1.Information on partial effective ingredients of Shiwei Jiegu formulation in the treatment of osteoarthritis

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  表格2 十味接骨方部分活性成分信息

  Table 2.Partial active ingredient information of Shiwei Jiegu formulation

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2.2 十味接骨方治疗骨关节炎作用靶点获取

在GeneCards、Digsee、DisGeNET数据库以“osteoarthritis”为关键词进行检索，去除重复值，得到骨关节炎相关蛋白1 979个，然后将十味接骨方有效成分靶点及骨关节炎疾病靶点取交集，结果显示共有114个蛋白为两者共有（图1）。

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  图1 十味接骨方有效成分靶点与骨关节炎靶点交集

  Figure 1.Intersection of effective ingredient targets and osteoarthritis targets in Shiwei Jiegu formulation

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2.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建

将“2.2”项下所得的114个共有蛋白信息录入STRING数据库，分析主要靶点之间的关联度，构建了各靶点之间的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络（图2）。结果显示，上述114个重复蛋白之间共有165个节点，1 252条边，平均节点度为35，各靶点之间具有较强的相关性，其置信度得分≥0.7分。其中，磷酸化蛋白激酶（AKT1）、TNF、IL-6、VEGFA、IL-1B、肿瘤蛋白53（TP53）、胱天蛋白酶3（CASP3）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等节点度值较高（表3），其可能为十味接骨方抑制骨关节炎发生的关键靶点。

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  图2 靶点蛋白PPI网络

  Figure 2.Target protein PPI network

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  表格3 木犀草素、乌索酸、汉黄芩素与TNF、VEGFA、IL-6分子对接结合能（kcal/ mol）

  Table 3.Molecular docking binding energies of luteolin, ursolic acid, and wogonin with TNF, VEGFA and IL-6 (kcal/ mol)

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2.4 基因及通路富集分析

为了进一步探究十味接骨方抑制骨关节炎相关机制，利用clusterProfiler 3.8.1软件对“2.2” 项下所得的114个共有基因进行KEGG通路及GO基因富集分析。KEGG通路富集结果显示（图3A），脂质与动脉粥样硬化、晚期糖基化终产物及其受体（AGE-RAGE）信号通路在糖尿病并发症中的作用、流体剪切应力与动脉粥样硬化以及TNF通路富集得分较高，与十味接骨方抑制骨关节炎存在显著的相关性。

此外，GO基因富集分析中生物过程富集分析结果显示（图3B），对脂多糖的响应、对细菌来源分子的响应、活性氧代谢过程、外源性凋亡信号通路以及凋亡信号通路的负调控等富集得分较高。另外，细胞成分的改变主要集中于膜筏、膜微区、膜区、囊腔以及细胞质囊腔等（图3C）。对于分子功能，细胞因子受体结合、细胞因子活性、DNA-结合转录因子结合、血红素结合以及核受体活性的改变可能与十味接骨方抑制骨关节炎有关（图3D）。

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  图3 富集分析

  Figure 3.Enrichment analysis

  注：A. KEGG通路富集；B. GO基因生物过程富集；C. GO细胞成份富集；D. GO分子功能富集。

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综上所述，根据富集得分排序，十味接骨方抑制骨关节可能与脂质与动脉粥样硬化通路有关，这与文献所报道的骨关节炎可能的发生机制相符[10]。

2.5 分子对接

为了进一步验证十味接骨方中有效成分与骨关节炎相关的脂质与动脉粥样硬化通路中的关键靶点基因之间亲和力，将两者进行了分子对接分析。首先选取了与十味接骨方治疗骨关节炎相关的脂质与动脉粥样硬化通路中的关联度较高的3个靶点蛋白：TNF、VEGFA以及IL-6；然后利用AutoDock 4.2.6软件将其分别与十味接骨方中的主要活性成分进行分子对接。结果显示，木犀草素 、乌索酸、汉黄芩素这3个主要成分可与TNF、IL-6、VEGFA通过氢键和强静电相互作用相结合（图4），结合能均小于-5 kcal mol（表4）， 结合高度稳定，表明十味接骨方中的主要活性成分与骨关节炎相关的脂质与动脉粥样硬化通路中的关键蛋白具有较好的结合活性。

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  图4 木犀草素、乌索酸、汉黄芩素与TNF（A）、VEGFA（B）、IL-6（C）的分子对接

  Figure 4.Molecular docking of luteolin, ursolic acid, and wogonin with TNF (A), VEGFA (B) and IL-6 (C)

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  表格4 木犀草素、乌索酸、汉黄芩素与TNF、VEGFA、IL-6分子对接结合能（kcal/ mol）

  Table 4.Molecular docking binding energies of luteolin, ursolic acid, and wogonin with TNF, VEGFA and IL-6 (kcal/ mol)

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2.6 十味接骨方促软骨增殖功能评价

为了进一步验证网络药理及分子对接的结果，将十味接骨方与大鼠软骨细胞共孵育。24~48 h后，对大鼠软骨细胞的细胞活力进行了检测。结果显示24~48 h内经十味接骨方（10  μL和20 μL）处理的大鼠软骨细胞的细胞活力保持在95%以上（图5），显著高于对照组（P＜0.05）。

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  图5 大鼠软骨细胞经十味接骨方共孵育24 h（A）和48 h（B）的细胞活力（n=3）

  Figure 5.Cell viability of rat chondrocytes co-incubated with Shiwei Jiegu formulation for 24 h (A) and 48 h (B) (n=3)

  注：aP<0.05。

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此外，十味接骨方在24~48 h内可显著促进大鼠软骨细胞增殖（图6），其增殖率均达到20%以上，显著高于对照组（P＜0.05）。综上所述，十味接骨方显著改变了软骨细胞的细胞行为，使其增殖加快，这可能是十味接骨方可以抑制骨关节炎发生的关键因素之一。

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  图6 大鼠软骨细胞经十味接骨方共孵育24 h（A）和48 h（B）的细胞活力（n=3）

  Figure 6.Cell viability of rat chondrocytes co-incubated with Shiwei Jiegu formulation for 24 h (A) and 48 h (B) (n=3)

  注：aP<0.05。

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2.7 十味接骨方调控骨关节炎发生相关蛋白的mRNA表达

网络药理及分子对接结果表明十味接骨合剂与骨关节炎发生相关蛋白TNF-α、IL-6及VEGFA有较好的结合。为了进一步探究十味接骨方对骨关节炎发生相关基因表达的影响，检测了十味接骨方处理的大鼠软骨细胞中TNF-α、IL-6及VEGFA的mRNA及蛋白表达，结果显示实验组大鼠软骨细胞中TNF-α、IL-6及VEGFA的mRNA及蛋白表达均显著低于对照组（P ＜0.05），与网络药理及分子对接结果一致。具体见图7和图8。

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  图7 大鼠软骨细胞经十味接骨方共孵育24 h后TNF-α、IL-6及VEGFA的相对mRNA表达（n=3）

  Figure 7.Relative mRNA expression of TNF-α, IL-6 and VEGFA in rat chondrocytes after co-incubation with Shiwei Jiegu formulation for 24 hours (n=3)

  注：aP<0.05。

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  图8 软骨细胞经十味接骨方共孵育24 h后 IL-6、TNF-α及VEGFA的蛋白表达（n=3）

  Figure 8.Protein expression of TNF-α, IL-6 and VEGFA in rat chondrocytes after co-incubation with Shiwei Jiegu formulation for 24 hours (n=3)

  注：aP<0.05。

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3 讨论

骨关节炎是一种关节软骨退行性病变，发病机制并不明确，其发生与增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常及关节畸形等有关[11]。目前临床骨关节炎的治疗主要是以可缓解疼痛及延缓病情发展的非甾体抗炎药、糖皮质激素、臭氧和利多卡因为主[12-13]，对关节的病变并无明显改善作用，且可能会加重症状[14-15]。

除了常规西药外，传统中医药对于骨关节炎的治疗也具有独到的见解。在中医学领域，骨关节炎属于“痹症”，发生机制除外邪侵袭之外，还与脏腑功能是否正常、气血脉络是否通畅有关，治疗的关键在于因人制宜、对症治疗、调和阴阳、扶正祛邪和通痹止痛[16]。现代医家结合古人经验，采用具有活血化瘀、通络止痛等功效的药物治疗骨关节炎，取得了较好的临床治疗效果[17-18]，但在骨关节炎的治疗领域，中药组方的使用占比并不高，这可能与中药组方复杂、毒副作用评估手段欠缺、功效机制并不明确有关。因此，通过现代化药理学技术阐明中药组方治疗骨关节炎的潜在机制可能是推动中医药应用于骨关节炎治疗的有效途径。

十味接骨方是根据临床经典方研制的一种具有活血止痛、增加骨质生长功效的中药方剂。在长期的临床使用中，十味接骨方被证明可用于骨关节炎的治疗，但药理学机制并不明确。本研究采用网络药理学及分子对接技术探究了十味接骨方治疗骨关节炎的药理学机制，以期为推动中医药在骨关节炎治疗中的合理应用提供理论依据。

通过基因及通路富集分析发现，十味接骨方可能是通过调控脂质与动脉粥样硬化通路等抑制骨关节炎的发生和发展。这与文献[19]所报道的骨关节炎的发生机制相符。通过网络药理学研究发现，十味接骨方的主要成分木犀草素、汉黄芩素均为黄酮类化合物，具有降低血脂、抑制血栓的功效，可用于动脉粥样硬化的治疗。此外，分子对接结果显示十味接骨方中的木犀草素、汉黄芩素和乌索酸与通路富集筛选所得出的骨关节炎发生相关的脂质与动脉粥样硬化通路中的关键靶点 TNF、VEGFA、IL-6具有较强的结合活性。为了验证网络药理学及分子对接的结果，将十味接骨方与大鼠软骨细胞共孵育，在相关时间点对细胞活力及关键靶点的表达进行了检测。结果表明，十味接骨方可促进软骨细胞的增殖，且可显著下调骨关节炎关键靶点 TNF、VEGFA、IL-6的表达，这与网络药理及分子对接结果一致。结合网络药理学及实验结果，可初步认为十味接骨方可通过调控脂质与动脉粥样硬化通路中的关键靶基因的表达，抑制骨关节炎的发展。

本研究利用网络药理学及分子对接技术，对十味接骨方治疗骨关节炎的潜在机制进行了探究，并进行了相关实验对所得结果进行了验证。实验结果表明，十味接骨方可能是通过组方中的木犀草素、乌索酸和汉黄芩素等主要活性成分调控脂质与动脉粥样硬化通路中TNF、VEGFA、IL-6等关键蛋白的表达，抑制骨关节炎的发生发展。本研究为探究中药组方治疗骨关节炎的分子机制提供了参考，并为推动中药组方在骨关节炎治疗中的合理应用提供了理论依据。在后续的研究中，一方面将通过现代分子生物学技术探寻十味接骨方抑制骨关节炎相关通路中上下游基因的关联性，深入阐明其治疗机制；另一方面，在以十味接骨方为整体研究的同时，也将以十味接骨方中的主要活性成分木犀草素、汉黄芩素和乌索酸为研究目标，探究其与骨关节炎发展的关联性，争取为十味接骨方组方配比的进一步精简优化奠定理论基础。

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