目的  探究白术内酯Ⅲ（AT-Ⅲ）对免疫球蛋白Ａ肾病（IgAN）大鼠肠道免疫屏障和肾脏的改善作用，并开发AT-Ⅲ纳米颗粒以期优化其保护作用。

方 法 本研究采用沸石咪唑骨架（ZIF-8）负载AT-Ⅲ制备ZIF-8@AT-Ⅲ纳米粒，通过透射电子显微镜、X射线多晶衍射仪对制备的样品进行形态结构表征。将48只大鼠随机分为正常对照组、IgAN组、IgAN+AT-Ⅲ组、IgAN+ZIF-8@AT-Ⅲ组。使用AT-Ⅲ和ZIF- 8@AT-Ⅲ分别处理IgAN大鼠，检测大鼠的肝肾功能、肾小球IgA沉淀以及肠道免疫屏障功能。

结果  成功制备了具有高载药量、稳定性、pH响应性的ZIF- 8@ AT-Ⅲ纳米粒。ZIF-8@AT-Ⅲ纳米粒平均粒径为（70.62±1.07） nm，Zeta电位为（-26.46±1.22）  mV，载药量为（19.2±1.3）%，包封率为（64.0±0.6）%，且在pH 5.5的环境中快速释放，释放量显著高于pH 7.4环境。AT-Ⅲ和ZIF-8@AT-Ⅲ可缓解肠壁结构的破坏和炎症细胞的浸润，显著下调血清中的二胺氧化酶和D-乳酸含量，上调肠黏膜组织中紧密连接蛋白1和紧密连接蛋白5的表达，改善IgAN大鼠的免疫屏障功能以及肠道通透性，抑制肾小球IgA沉积并缓解肾脏损伤。且ZIF-8@AT-Ⅲ的治疗效果优于AT-Ⅲ。

结论  AT-Ⅲ通过改善大鼠肠道免疫屏障功能以及肠道通透性减轻IgAN。ZIF-8@AT-Ⅲ是提升AT-Ⅲ对IgAN治疗效果的良好载药系统。

免疫球蛋白Ａ肾病（Immunoglobulin A nephropathy，IgAN）是一种以免疫球蛋白A在肾小球沉积为病理特征的慢性肾脏疾病，IgAN占原发性肾小球肾炎的36.9%~45.3%，是引起终末期肾衰竭最常见的原因之一[1]。大约25%~30%的IgAN患者在20~25年内需要接受肾脏替代治疗，而另外20%~40%的患者在发病后的20年内可能会进展至终末期肾病[2]。因此，开发可用于治疗IgAN的有效药物变得至关重要。白术内酯Ⅲ（atractylenolide-Ⅲ，AT-Ⅲ）是白术根提取物中的主要生物活性化合物之一，具有抗炎和抗氧化应激等多种药理作用[3]。AT-Ⅲ是多种治疗IgAN和相关肾病的传统方剂中的主要活性成分，包括防己黄芪汤和益肾化湿颗粒等[4-5]。因此，AT-Ⅲ在IgAN中是否发挥作用至关重要。研究报道，肠道黏膜屏障受损会导致免疫系统异常激活，从而对IgAN的发展产生影响[6-7]。然而，AT-Ⅲ是否通过改善大鼠肠道免疫屏障功能减轻IgAN仍需进一步阐明。纳米医学利用纳米尺度的材料和技术来改善药物的特性，增加其生物相容性和靶向能力，从而提高治疗效果[8-9]。咪唑骨架沸石（zeolite imidazole framework-8，ZIF-8）因其高孔隙率、广泛的比表面积、出色的药物承载能力以及对pH响应的特性而备受青睐，因此被视为理想的药物载体[10]。本研究以ZIF-8负载AT-Ⅲ（ZIF-8@AT-Ⅲ）来增加AT-Ⅲ的治疗效果，并探究AT-Ⅲ和ZIF-8@AT-Ⅲ是否通过改善大鼠肠道免疫屏障功能减轻IgAN。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及试剂

LEGEND MICRO21R型离心机（Thermo）；Talos F200X型透射电子显微镜（美国FEI公司）；Smart Lab型X射线衍射仪 （日本理学公司）；ZS90型纳米粒度分析仪（英国马尔文帕纳科公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；BK-200型血生化仪（山东博科生物产业有限公司）；1645050型电泳仪（Biorad）。

AT-III（MCE，货号：HY-N0203，纯 度99.91%），牛血清白蛋白（BSA，批号：2064652）、四氯化碳（CCl₄，批号：C2305311）和脂多糖（LPS，批号：C2302115）购自Macklin；紧密连接蛋白1（ZO-1）抗体（货号：21773-1-AP）、紧密连接蛋白5（Claudin-5）抗体（货号：29767-1-AP）、GAPDH抗体（货号：10494-1-AP）及山羊抗兔IgG（货号：PR30011）均购自Proteintech；二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）ELISA试剂盒（货号：AD30909）、D-乳酸（D-lactate，D-LA）ELISA试剂盒（货号：AD31732）和免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）ELISA试剂盒（货号：AD31786）购自艾迪抗；苏木素-伊红试剂盒（批号：G1120）和Masson三色染色试剂盒（货号：G1340）购自北京索莱宝试剂有限公司；二甲基亚砜（批号：M2301427）、2-甲基咪唑（批号：B2301456）、六水合硝酸锌（批号：L2211253）购自阿拉丁；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.2 动物

6周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量（200± 10） g，购自温州医科大学实验动物中心。生产许可证号：SCXK（浙）2020-0001，使用许可证号：SYXK（浙）2020-0014。自由获得饲料和饮水，保持室温22~24 ℃，相对湿度40%~60%，12 h光照和12 h黑暗的光照周期。

1.3 ZIF-8@AT-Ⅲ纳米粒的制备

将10 mg AT-Ⅲ（100 μL二甲基亚砜助溶）、330 mg 2-甲基咪唑，150 mg六水合硝酸锌溶解于5 mL超纯水中。在冰浴下，将5 mL超纯水边搅拌边缓缓倒入10 mL甲醇溶液，搅拌2 h后离心（10 699×g，15 min）去除未反应完全的试剂。然后使用甲醇离心（10 699×g，15 min）清洗，重复3次，即获得ZIF-8@AT-Ⅲ NPs。

1.4 纳米粒的表征

采用透射电子显微镜对ZIF-8、ZIF- 8@ AT-Ⅲ NPs的外观、微观结构和组成进行表征。采用X射线衍射仪观察ZIF-8、ZIF- 8@ AT-Ⅲ的晶形结构，采用纳米粒度分析仪测定ZIF-8、ZIF-8@AT-Ⅲ水合粒径和Zeta电位。取1mg ZIF-8@AT-III用10 mL甲醇溶解破坏，使AT-III释放出来，离心取上清通过HPLC测定AT-III含量，计算载药量和包封率。载药率（%）=ZIF-8@AT-Ⅲ中AT-Ⅲ质量/ZIF- 8@AT-Ⅲ质量×100%；包封率（%） =ZIF- 8@ AT-Ⅲ中AT-Ⅲ质量/AT-Ⅲ的投入质量×100%。

1.5 ZIF-8@AT-Ⅲ的药物释放

采用动态膜透析方法测定药物释放[11]。将ZIF-8@AT-III分散在不同pH（7.4和5.5）的PBS缓冲溶液中，然后置于透析袋中（截止分子量为3500 Da）。将透析袋置于含有10 mL具有相应pH PBS的释放管中，然后将透析袋置于37 ℃的水浴振荡器中，并以100 rpm/min轻轻摇动；在规定时间除去0.5 mL上清液，并补充等体积的新鲜PBS，用滤膜过滤得到不同时间点（0、1、2、4、6、8、12、18、24、48 h）的分离液。采用HPLC测定AT-III的浓度，检测条件[12]如下：色谱柱为Eclipse XDB-C₁₈（150 mm×4.6 mm，5  μm），流动相由乙腈-水（60 ∶ 40）组成，流速为1.0  mL/ min，柱温保持在30 ℃，紫外检测器波长设置为220  nm。ZIF-8@AT-Ⅲ释放率（%） =[溶液中AT-Ⅲ的质量/（ZIF-8@AT-Ⅲ复合物中AT-Ⅲ总质量）]×100%。

1.6 大鼠IgAN模型的建立和分组

将48 h只SD大鼠适应性饲养1周后按照随机数字表法分为正常对照（Control）组、IgAN组、IgAN+AT-Ⅲ组、IgAN+ZIF-8@AT-Ⅲ组，每组12只。采用LPS+BSA+CCl₄法建立IgAN模型[9-10]：每2 d灌胃1次400 mg/kg BSA（溶于2 mL蒸馏水），持续6周，每周1次皮下注射0.1  mL CCl₄和0.5  mL蓖麻油的混合溶液，持续9周，并分别在在第6周和第8周尾静脉注射0.05 mg/ kg LPS，造模时间为10周。Control组每2天灌胃0.1%稀盐酸配制酸化水，每次2  mL，持续6周；皮下注射0.6 mL生理盐水，每周1次，持续9周；于第6周和第8周尾静脉注射0.2 mL生理盐水。每组的相应药物干预在第11周开始，IgAN+AT-Ⅲ组和IgAN+ZIF-8@AT-Ⅲ组分别尾静脉注射溶解于200 μL生理盐水的AT-Ⅲ和ZIF-8@AT-Ⅲ（相当于AT-Ⅲ 3.5 mg/ kg）。每3 d注射1次，共注射3周，Control组和IgAN组等量生理盐水尾静脉注射。本动物实验经温州医科大学实验动物伦理委员会批准（批件号：xmsq2021-0500）。

1.7 大鼠血清DAO、D-LA和IgA水平检测

按照说明书描述的方法，使用ELISA法检测大鼠血清中的DAO、D-LA和IgA水平。DAO和D-LA在血清中的水平可分别反映肠道黏膜上皮细胞损伤程度和肠道黏膜通透性的变化。

1.8 血清生化指标检测

使用血生化仪检测血清中的24 h尿苷三磷酸 （UTP）、血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）指标。收集血清样本后离心并于-20 ℃，如有沉淀再次离心。收集组织上清后离心，将血清或组织上清用血生化仪检测并读取结果。

1.9 标本采集与病理分析

采集肾脏组织标本：处死各组大鼠，剪开大鼠腹腔，取出左肾置于4%多聚甲醛中保存备用，右肾冻存备用；采集结肠组织标本：处死各组大鼠后，取出距肛门8 cm处结肠组织，冲洗内容物，肠标本置于液氮中保存备用。制作肾脏和结肠石蜡标本并制备组织冰冻切片；采用HE染色观察肾脏和结肠形态学改变、Masson染色观察肾脏纤维化程度；免疫荧光染色法检测系膜区IgA沉积。

1.10 Western blot检测

将蛋白质进行定量、电泳分离、转膜、封闭后，加入一抗（Claudin-5、ZO-1和GAPDH抗体，均按1 ∶ 1 000稀释），4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，二抗IgG（稀释比例1 ∶ 5 000）室温孵育1.5 h；洗膜，显色，曝片，计算目的蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值。

1.11 统计学分析

采用Graphpad Prism 8统计软件进行统计分析和作图，数据以表示。两组之间采用独立样本t检验；多组之间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZIF-8@AT-Ⅲ的表征

成功制备了ZIF-8@AT-Ⅲ纳米粒。ZIF-8（图1A）以及ZIF-8@AT-Ⅲ（图1B）的透射电镜图显示合成的ZIF-8晶体形状规则、晶粒大小分布均匀、颗粒略有团聚现象。粒度分析仪结果表明ZIF-8平均粒径为（66.86±1.47） nm，多分散系数（PDI）为0.42±0.07，负载药物后平均粒径为（70.62±1.07）nm，PDI为0.37±0.06（图2A和B），以及连续7 d两种纳米颗粒的平均粒径无显著变化（图2C）。Zeta电位分析仪检测结果显示ZIF-8的Zeta电位为（-22.78±0.33）mV，载药后纳米粒的Zeta电位为（-26.46±1.22） mV，由此证明ZIF-8材料成功负载AT-Ⅲ（图3）。

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  图1 ZIF-8（A）和ZIF-8@AT-III（B）的透射电子显微镜图

  Figure 1.Transmission electron microscopy image of ZIF-8 (A) and ZIF-8@AT-III (B)

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  图2 ZIF-8和ZIF-8@AT-III的粒径分布图

  Figure 2.Particle size distribution of ZIF-8 and ZIF-8@AT-III

  注：A. ZIF-8的粒径分布；B. ZIF-8@AT-III的粒径分布；C. 连续7 d的粒径变化。

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  图3 ZIF-8和ZIF-8@AT-III的Zeta电位图

  Figure 3.Zeta potential of ZIF-8 and ZIF-8@AT-III

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ZIF-8@AT-Ⅲ纳米粒的载药率为（19.2± 1.3）%，包封率为（64.0±0.6）%。由图4可知X射线衍射图显示合成样品的特征衍射峰与文献 [11]中报道的一致，即（011），（002），（112），（022），（013），（222）。采用本研究方法可以得到高结晶度的ZIF-8材料，加载药物后晶体结构不改变。药物释放曲线显示ZIF-8负载AT-Ⅲ的释放行为具有明显的pH响应性。在pH 5.5和pH 7.4 环境下AT-Ⅲ在前10 h释放速率较快，10 h后释放速率逐渐变小，并且在pH 5.5环境下累计释放量显著高于pH 7.4条件下释放量，表明酸性条件更有利于AT-Ⅲ的释放（图5）。

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  图4 ZIF-8和ZIF-8@AT-III的X射线衍射图

  Figure 4.X-ray diffraction pattern of ZIF-8 and ZIF-8@AT-III

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  图5 ZIF-8和ZIF-8@AT-III的累计释放曲线

  Figure 5.Cumulative release curve of ZIF-8 and ZIF-8@AT-III

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2.2 ZIF-8@AT-Ⅲ对IgAN模型大鼠肝肾功能的影响

与Control组相比，IgAN组大鼠24 h UTP、SCr和BUN均显著升高；与IgAN组相比，AT-Ⅲ或ZIF-8@AT-Ⅲ组中24 h UTP、SCr和BUN的含量均显著降低（P＜0.05），并且ZIF-8@AT-Ⅲ组中含量的降低更为显著（图6A~C）。此外，4组大鼠血清中ALT和AST的表达水平差异无统计学意义（P ＞0.05）（图6D和E）。结果表明，AT-Ⅲ或ZIF- 8@AT-Ⅲ治疗对IgAN大鼠的肝功能未产生明显的损伤。

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  图6 肝肾功能的血生化指标（n=6）

  Figure 6.Blood biochemical indexes of liver and kidney functions (n=6)

  注：aP<0.05；bP<0.01。

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2.3 ZIF-8@AT-Ⅲ抑制肾小球IgA沉积并改善肾脏损伤

免疫荧光染色结果显示，Control组观察到很少的IgA沉积，IgAN组大鼠肾小球系膜区IgA沉积增加；而AT-Ⅲ和ZIF-8@AT-Ⅲ组IgA沉积显著减少（图7A）。ELISA结果显示，与Control组相比，IgAN组大鼠血清IgA的含量显著升高（P ＜0.05）；而与IgAN组相比，AT-Ⅲ和ZIF-8@ AT-Ⅲ组血清中IgA的含量显著降低（P＜0.05），并且ZIF- 8@AT-Ⅲ组的IgA含量显著低于AT-Ⅲ组（图7B）。Masson染色显示，与Control组相比，IgAN大鼠肾小球中胶原纤维的沉积增加；与IgAN组相比，AT-Ⅲ组和ZIF- 8@AT-Ⅲ组胶原纤维的沉积减少（图 7C）。HE染色结果显示，相较于Control组，IgAN组肾小管基底膜增厚、系膜增生明显；与IgAN组相比，AT-Ⅲ组和ZIF-8@AT-Ⅲ组系膜区未见增生（图7C）。

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  图7 检测各组大鼠IgA沉积和肾脏组织病理变化（n=3）

  Figure 7.Detections of IgA deposition and renal histopathological changes in each group (n=3)

  注：A. 采用免疫荧光法检测肾组织中的IgA沉积；B. 采用ELISA检测大鼠血清中的IgA；C. 采用Masson染色和HE染色方法检测肾组织的病理变化；aP<0.05；bP<0.01。

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2.4 ZIF-8@AT-Ⅲ改善IgAN大鼠肠道免疫屏障功能以及肠道通透性

HE染色结果显示，Control组大鼠结肠组织结构完整且未见炎症细胞浸润；IgAN组大鼠肠壁结构严重破坏，腺体变形甚至消失，杯状细胞丢失，可见大量炎症细胞浸润；AT-Ⅲ或ZIF- 8@AT-Ⅲ治疗组大鼠的上述病理损伤有所改善（图8A）。ELISA结果显示，与Control组相比，IgAN组大鼠血清中DAO和D-LA水平升高（P ＜0.05），表明肠道通透性增加；与IgAN组相比，AT-Ⅲ或ZIF-8@AT-Ⅲ组血清的DAO和D-LA水平显著降低（P＜0.05），并且ZIF-8@AT-Ⅲ组中DAO和D-LA水平的降低较AT-Ⅲ组更为显著（图8B和C）。Western blot检测结果显示，与Control组相比，IgAN组大鼠肠黏膜组织中ZO-1和Claudin-5水平降低（P ＜0.05），这表明肠道屏障受损和肠道通透性增加；与IgAN组相比，AT-Ⅲ或ZIF- 8@ AT-Ⅲ组ZO-1和Claudin-5水平均有不同程度的增加（P ＜0.05）（图8D~F）。

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  图8 各组大鼠的肠道免疫屏障功能和肠道通透性（n=3）

  Figure 8.The intestinal immune barrier function and intestinal permeability of rats in each group (n=3)

  注：A. 采用HE染色方法检测结肠组织的完整性和结构，蓝色箭头代表杯状细胞，红色箭头代表腺体变形，黑色箭头代表炎症细胞浸润；B和C. 采用ELISA检测血清中DAO和D-LA的水平；D~F. 采用Western blot方法分析大鼠肠黏膜组织中ZO-1和Claudin-5的水平；aP<0.05；bP<0.01。

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3 讨论

肠道黏膜屏障的损伤已被报道与IgAN的发展有关，其损伤可能导致免疫系统激活，包括增殖诱导配体和白细胞介素-6、Toll样受体9、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α和诱导型一氧化氮合酶在内的炎性因子被激活分泌[12-14]，这种异常免疫活动可导致Gd-IgA1（一种特定的IgA1亚类）的分子结构发生变异[15]。这种异常的Gd- IgA1在免疫系统中被认为是抗原，引发免疫反应，导致免疫复合物在肾脏中沉积，最终导致IgAN的发生 [16]。在本研究中，与Control组相比，IgAN组大鼠的IgA在肾小球系膜区沉积，其次，24 h UTP、SCr和BUN均显著升高，提示IgAN大鼠造模成功。已有临床研究针对肠道相关淋巴组织进行靶向治疗来干预IgAN患者的进展 [17]。肠道通透性与紧密连接蛋白（包括ZO-1和Claudin-5）的表达密切相关[18]，而肠道通透性增加常伴随着肠道黏膜屏障的损伤[19]。本研究中，与Control大鼠相比，IgAN大鼠的肠壁结构严重破坏，ZO-1和Claudin-5的表达减少，DAO和D-LA水平升高，肠道通透性增加。说明肠道免疫屏障和通透性与IgAN的发生有关，这与之前的研究结果一致。

含有AT-Ⅲ的多种中药方剂在治疗IgAN和相关肾脏疾病方面具有良好治疗作用。例如，防己黄芪汤中含有多种活性成分，包括AT-Ⅲ，可用于治疗肾炎和糖尿病肾病[4, 20]。益肾化湿颗粒主要用于治疗肾病综合征和慢性肾小球肾炎等疾病，其功效成分包括AT-Ⅲ[5]。本研究中探讨了AT-Ⅲ对肾功能的影响，AT-Ⅲ能显著降低因IgAN诱导的24 h UTP、SCr和BUN含量的增加，且对ALT和AST无明显影响，表明其可恢复肾功能且不引起明显的肝损伤。本研究还进一步探讨了AT-Ⅲ对IgAN的缓解作用，结果表明AT-Ⅲ减少IgAN大鼠肾小球IgA沉积，减轻肾脏病理损伤。由于肠道免疫屏障和肠道通透性的调节对IgAN具有一定的调控作用 [21]，推测AT-Ⅲ对IgAN的保护作用可能一部分归因于维护肠道免疫屏障功能。据报道，AT-Ⅲ通过调节Janus激酶2/信号转导转录激活因子3信号通路减轻溃疡性结肠炎模型小鼠肠道损伤[22]。另一项研究发现，AT-Ⅲ通过调节自噬水平清除过氧化物减轻小鼠溃疡性结肠炎 [3]。可见AT-Ⅲ对溃疡性结肠炎具有重要的药用价值。本研究还探讨了AT-Ⅲ对肠道免疫屏障的影响，结果表明，AT-Ⅲ缓解了肠壁组织的损伤，增加了ZO-1和Claudin-5的表达，降低IgAN大鼠肠道的高通透性。综上可发现AT-Ⅲ能够恢复IgAN大鼠免疫屏障的损伤以及缓解肾脏损伤，表明AT-Ⅲ可能同时作用于肠道和肾脏来缓解IgAN。

AT-Ⅲ在IgAN大鼠中的作用已经被证实，然而AT-Ⅲ的低水溶性限制了其治疗作用的发挥。纳米医学已被广泛用于药物的靶向递送，能有效增加药物溶解度和生物相容性[23]。为克服AT-Ⅲ的低水溶性限制其治疗作用，Wang等 [24]制备了装载了p38α MAPK和p65 siRNA的表面电荷依赖性肾小球靶向脂质体纳米颗粒，有效缓解了IgAN的症状。本研究选择ZIF-8作为理想的药物载体，用于有效地传递AT-Ⅲ。由于IgAN的肾脏组织和肠道组织微环境表现为弱酸性 [25- 26]，而ZIF-8是一种具有酸响应性的框架材料，能够发挥靶向释放的效果[27]。药物释放试验的结果证明，ZIF-8@AT-Ⅲ纳米粒的释放具有酸响应特性，能够在弱酸性环境下快速和大量释放，而在中性或弱碱性环境下少量释放，酸性环境能够增加AT-Ⅲ的靶向性以及减少临床上的使用剂量。最后，体内研究的结果显示，ZIF-8@AT-Ⅲ的治疗效果显著优于AT-Ⅲ。然而后续需要更多的深入研究和临床验证，以确定其临床应用的可行性和安全性。

综上所述，AT-Ⅲ通过改善IgAN大鼠肠道免疫屏障功能以及肠道通透性减少了IgAN大鼠肾小球IgA沉积并缓解肾脏损伤。此外本课题组还成功制备了具有适宜粒径的ZIF-8@AT-Ⅲ纳米粒，具备高载药量和包封率，良好的稳定性和靶向释放特性，产生优于单纯AT-Ⅲ的治疗效果，有望成为治疗IgAN的新策略。

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