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目的 研究痛风致病的关键基因以及免疫生物标志物，挖掘潜在的靶向中药，为痛风的临床治疗提供新方向。
方法 从GEO数据库下载痛风芯片数据集，使用R软件进行差异基因的筛选，并对这些差异基因进行GO及基因通路KEGG富集分析。应用STRING数据库对差异基因进行蛋白质互作网络分析，利用Cytoscape筛选关键基因。使用ELISA方法对关键基因的蛋白表达水平进行实验验证。进一步使用xCell估计免疫细胞在痛风中的相对表达情况及相关性，最后通过Coremine Medical数据库对显著富集的免疫相关生物学过程及关键基因中药进行预测。
结果 筛选出痛风差异基因共计852个。在GO富集分析中，与免疫反应密切相关的主要生物学过程包括白细胞的趋化性、IL（白细胞介素）-2的产生以及血管生成的调控；KEGG通路主要富集于IL-17信号通路、趋化因子信号通路和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路等。筛选出TNF、IL-6、IL-1β、趋化因子配体8（CXCL8）、FOS原癌基因（FOS）和血管内皮生长因子A（VEGFA）等10个关键蛋白，实验验证关键基因蛋白表达水平与芯片数据的表达趋势一致。免疫分析显示，单核细胞、记忆B细胞、初始CD8+ T细胞和树突状细胞与痛风关系密切。中药预测发现，人参、三七、黄芩、三白草和丹参等为治疗痛风的潜在药物。
结论 本研究揭示了痛风致病的可能关键基因以及免疫机制，挖掘出潜在的靶向中药。这些关键基因和中药有望为痛风的治疗提供新的思路和方法。
痛风是一种自身炎症性疾病，由单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）晶体沉积引起，其反复发作可导致痛风性关节炎、痛风石、肾结石和痛风性肾病的形成[1]。全球范围内痛风的发病率不断增加，且痛风的发生风险随年龄的增长而增加[2]。世界各地的发病率参差不齐，美国和欧洲是痛风患病人数最多的国家[3]。痛风常伴有各种共病，研究表明，高达四分之三的痛风患者存在心血管疾病。美国国家健康与营养调查显示，70%的痛风患者患有慢性肾脏病[2]。尽管痛风是仅有的几种可治愈的风湿性疾病之一，但由于患者对药物的依从性差，痛风的治疗并不理想[4]。目前治疗痛风的常用药物主要有非甾体抗炎药、秋水仙碱、糖皮质激素等，然而这些药物都有较多的毒副作用和禁忌证，长期使用会导致胃肠道反应、皮疹，甚至可能导致肾衰竭[5]。非甾体抗炎药的超敏反应发生率为0.5%~1.9%，别嘌醇过敏发生率高达10%[6]。
现有研究多集中于痛风的临床特征和传统治疗手段，而对痛风的分子层面和免疫机制的研究相对较少。免疫生物标志物作为疾病诊断和治疗的重要工具，其在痛风研究中的应用日益受到重视，不仅有助于深入理解痛风的免疫病理机制，还能为痛风的早期诊断、疗效评估和个体化治疗提供重要信息[7]。xCell算法通过整合基因表达数据和免疫细胞标志物基因集，利用线性模型估计不同免疫细胞类型的相对丰度，从而实现对复杂组织样本中免疫细胞组成的快速而准确的分析，为免疫生物标志物的发现提供了新的视角[8]。中医药作为中国传统文化的瑰宝，其在痛风治疗中的独特优势和潜力逐渐被认识。中药的多成分、多靶点作用特点，为痛风的综合治疗提供了新的策略[9]。然而，如何科学地筛选中药，仍是一个待解决的问题。
本研究使用生物信息学方法从基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）获取痛风的基因芯片数据，寻找痛风的关键基因，并通过xCell算法对痛风的免疫细胞相对表达情况进行研究，寻找免疫标记物。通过Coremine Medical数据库，对可能靶向作用痛风的中药进行预测，为深入理解痛风的免疫学机制、寻找新的治疗靶点和推动个体化治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 基因表达数据
在美国国家医学图书馆（National Center for Biotechnology Information，NCBI）基因表达综合数据库GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，以“GOUT”为检索词检索，下载芯片数据集GSE160170，芯片数据集平台为GPL21827[10]。
1.2 数据预处理
使用limma包中的normalizeBetweenArrays函数来标化GSE160170数据集，箱线图用于标化处理后的可视化。
1.3 差异基因的筛选
使用R软件（4.3.0）的limma包对痛风样本与正常对照样本进行了差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的筛选分析。采用了调整后的t检验，即经验贝叶斯t检验，识别两组样本之间表达差异显著的基因。为了在控制假发现率（false discovery rate，FDR），应用了Benjamini-Hochberg（BH）方法。最终以P ＜0.05且log2（倍数变化）＞1或log2（倍数变化） ＜-1阈值作为差异表达的筛选条件。
1.4 GO和KEGG分析
利用R软件的Cluster Profiler数据包对差异基因进行GO和KEGG富集分析[11]，并利用该包将分析得到的结果进行可视化。
1.5 蛋白互作网络构建和关键基因筛选
通过STRING数据库[12]（https://cn.string-db.org/）构建差异基因的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络图。将差异基因导入STRING数据库，并在物种中选择Homo sapiens，在构建网络时设定蛋白互作评分＞0.4作为筛选标准，以确保保留高可信度的蛋白质互作关系。接着从STRING数据库中下载了蛋白质相互作用网络的tsv格式文件，包含了基因间的相互作用关系和评分信息。随后将这些数据导入到Cytoscape 3.9软件中进行可视化分析。并利用了Cytoscape中的cytoHubba插件，以节点的度值作为筛选标准，以识别出在网络中具有重要拓扑特征的关键基因。
1.6 关键靶点蛋白的验证
1.6.1 标本获取
收集川北医学院附属医院10例符合标准的痛风患者以及9例健康对照人群的全血，在4 ℃下1 205×g离心15 min，离心后血浆分装，-80 ℃保存备用。本研究经川北医学院附属医院伦理委员会审核批准（批件号：2022ER563-1）。
1.6.2 主要试剂和仪器
ELISA试剂盒购于上海茁彩生物科技有限公司，包括脑肿瘤坏死因子Ctumor necrosis factor，TNF，货号：ZC-35733）、白细胞介素（interleukin，IL）-6（货号：ZC-32446）、IL-1β（货号：ZC-32420）、趋化因子配体8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8，货号：ZC-32449）、FOS原癌基因（FOS，货号：ZC-55299）。
离心机（型号：5804R，Eppendorf公司）；酶标仪（型号：SpectraMAXPlus384，美谷分子仪器有限公司）；优普超纯水制造系统（型号：UPH-Ⅱ-10T，成都超纯科技有限公司）；电子恒温水浴锅（型号：DZKW- 4，北京中兴伟业仪器有限公司）。
1.6.3 关键靶点蛋白水平检测
准备：ELISA试剂盒室温平衡30 min，然后从铝箔袋中取出所需板条。加标准品：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。加样：样本孔中加入待检测的关键蛋白检测样本50 μL；空白孔不加。加酶：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min。洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。显色：每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。终止：每孔加入终止液50 μL，10 min内，在450 nm波长处测定各孔的光密度值。采用R统计软件对两组的关键基因蛋白表达水平进行分析。
1.7 免疫细胞分析
xCell用于推断多种免疫和基质细胞相对表达情况[8]。将xCell应用于标准化后数据，获取痛风组织表达谱的免疫细胞评分，并比较痛风组和健康对照组的细胞类型差异，以P＜0.05为差异有统计意义。通过R中的corrplot包构建免疫细胞相关矩阵，计算Pearson相关系数并用于评估相关强度。
1.8 靶向中药预测
将痛风的关键基因导入Coremine Medical数据库（https://coremine.com/）中，筛选具有潜在效应机制的中药，并进一步对筛选的中药进行归经以及功效分析。
2 结果
2.1 数据预处理
运用R软件limma包对数据集GSE160170进行标化处理，结果显示，12个样本基因表达基于一条水平线上（图1）。
2.2 DEGs分析
总共筛选出痛风和健康对照组的DEGs共计852个，其中上调373个，下调479个，结果可视化火山图和热图，见图2。
2.3 差异基因GO和KEGG富集分析
用R软件的Cluster Profiler包对差异基因进行GO和KEGG富集分析。GO富集中与免疫相关主要是：白细胞趋化性IL-2的产生、血管生成的调控、髓系白细胞迁移、白细胞迁移、对趋化因子的反应等（图3和图4）；最显著的5条KEGG通路主要富集于：细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、趋化因子信号通路、TNF信号通路、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用（图3和图4）。
2.4 PPI网络构建和关键基因筛选
筛选出来的DEGs导入STRING数据库进行PPI网络分析，将分析结果导入Cytoscape中进行可视化，去除独立节点，最终得到421个节点和1 668条边网络图（图5）。在cytoHubba插件中，以度值为筛选标准，选取了前10个关键基因（图 6），分别为：TNF、IL-6、IL- 1β、CXCL8、FOS、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor a，VEGFA）、组蛋白集群2H3PS（histone cluster 2h3ps，HIST2H3PS2）、前列腺素环氧合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、趋化因子配体1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）、分化簇80（cluster of differentiation 80，CD80）。
2.5 关键基因验证
采用ELISA的法对度值最高的前5个核心基因在痛风患者中的表达进行验证。与健康对照组比较，痛风患者TNF、IL-6、IL-1β、CXCL8和FOS的表达显著升高（图7），与芯片数据的表达趋势一致，进一步证实了关键基因的可靠性。
2.6 免疫细胞分析
xCell主要用于淋巴细胞、髓细胞、基质细胞和干细胞及其他细胞等64种免疫细胞和基质细胞类型富集分析。结果显示，痛风组与健康对照组有20种细胞类型有显著差异，其中痛风组初始CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD8+ Tcm、周细胞和成骨细胞评分显著降低，而单核细胞、记忆B细胞、初始CD8+ T细胞和树突状细胞在痛风中显著升高（图8）。如图9所示，在所有免疫细胞中，单核细胞与骨骼肌细胞、免疫原性细胞死亡和系膜细胞相关性最高（r=0.94），第二强的正相关是CD8+ T细胞和初始CD4+ T细胞、初始CD4+ T细胞和类别转换记忆B细胞。此外，初始CD4+ T细胞分别与成骨细胞和神经元细胞呈最强负相关。10个关键基因与免疫细胞之间的相关性结果显示，TNF、IL-6、CD80分别与记忆B细胞呈正相关，FOS、CXCL1分别与单核细胞呈正相关，CXCL1、CXCL8、PTGS2、FOS分别与CD8+ T细胞呈负相关（图10）。
2.7 干预痛风的潜在中药预测
通过Coremine Medical数据库预测具有与潜在治疗痛风的中药，共计得到126味中药，出现频率3次以上的中药被认为是高频中药，其中人参、三七、黄芩、三白草、丹参、黄芪、郁金、姜黄、鱼腥草和玉簪花等为高频中药。将中药进行归经和功效分析显示，与痛风相关中药多归为脾经、肾经、肝经、肺经（图11），功效方面多集中于活血化瘀、清热、祛风湿、行气止痛等方面（图12）。
3 讨论
本研究对痛风的基因芯片数据进行了生物信息学分析，鉴定了DEGs共计852个，其中上调373个，下调479个。GO和KEGG富集分析表明，DEGs在炎症与免疫反应有关的生物过程中明显富集。通过Cytoscape中cytoHubba插件以度值为筛选标准，选取了前10个关键基因，分别为：TNF、IL-6、IL-1β、CXCL8、FOS、VEGFA、HIST2H3PS2、PTGS2、CXCL1和CD80。
TNF-α是一个促炎细胞因子，在体内可以引起炎症细胞的活化和炎性介质的释放[13]。在痛风中，尿酸结晶沉积在关节和软组织中会引发炎症反应[14]。TNF-α与晶体诱发的关节炎的严重程度密切相关，其在痛风患者中的表达水平可以作为疾病活动性的一个指标[15]。一项研究表明TNF-α基因启动子区域的多态性-863C/A有助于痛风性关节炎的发展，这表明遗传因素在其发病机制中起作用[16]。动物模型研究也表明，TNF-α的表达增加与痛风小鼠模型中的炎症反应有关[17]。临床研究显示了抗TNF-α疗法在治疗痛风性关节炎中的潜力[18]。在KEGG富集分析中，TNF信号通路的显著富集进一步支持了TNF-α为痛风治疗的潜在靶点。IL-6为一种多效性细胞因子，广泛参与炎症和自身免疫性疾病的发病过程[19]。在痛风中，IL-6的产生可能由尿酸盐结晶激活的滑膜细胞和单核细胞触发，是先天免疫反应的一个关键组成部分[20]。IL-6的活性不仅在痛风的炎症过程中发挥着核心作用，而且其水平的变化与痛风患者的炎症标志物C反应蛋白和血沉密切相关。此外，IL-6水平的升高与痛风石的形成和关节畸形的存在有关，进一步揭示了IL-6可作为评估痛风疾病严重程度和预后的潜在生物标志物[21]。 IL-6在痛风以外的其他疾病中也显示出其生物学重要性。如在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等疾病中，IL-6同样发挥着关键作用[22-23]。因此，对IL-6生物学功能的研究不仅对痛风有重要意义，也对广泛的自身免疫性疾病的免疫稳态和发病机制具有较大影响[24]。IL-1β在痛风的发病机制中起着核心作用，对中性粒细胞的招募至关重要，且IL-1β能增强MSU引发的中性粒细胞胞外陷阱形成，进而进一步加重炎症[25]。IL-1β抑制疗法，即通过药物阻断IL-1β的作用，已被证明可有效地减轻痛风患者的炎症症状[26-27]。研究表明，miR-223能通过抑制IL-1β和 TNF-α的产生对痛风炎症发展的进行负反馈调节[15] 。miR-223的这种调节作用为痛风的治疗提供了新的靶点，有助于开发更为精准和有效的治疗策略。CXCL8也称为IL-8。研究发现，与健康对照相比，急性痛风性关节炎和临界间痛风患者的 CXCL8 平均水平更高。在痛风患者中，IL-8的高水平不仅与疾病的急性发作有关，还与患者合并糖尿病的发病风险独立相关。此外，IL-8也是肥胖患者和终末期肾病患者一个预示心血管疾病临床结果的独立预测因子[28]。值得注意的是，长期使用别嘌醇会降低痛风患者的 CXCL8 水平[29]。这一结果表明，IL-8的水平变化可能与痛风的治疗效果有关，为临床治疗提供了潜在的生物标志物。
研究表明，免疫因素参与了痛风的发展，MSU晶体诱导的炎症是先天免疫的范例[30]。本研究结果发现，单核细胞、记忆B细胞、初始CD8+ T细胞和树突状细胞水平在痛风患者中显著增加，这些免疫细胞的活化与痛风慢性炎症的发生发展密切相关。MSU是一种可诱导天然免疫记忆的代谢物，可通过改变代谢和表观遗传修饰，激活单核细胞以增强其促炎反应，并且可以通过诱导趋化因子配体2，改变循环中单核细胞的数量，从而为慢性炎症奠定了基础[31]。值得注意的是，记忆B细胞、初始CD8+ T细胞和树突状细胞在痛风中的作用尚未得到充分研究，而这些免疫细胞在其他风湿性疾病中已有较多的研究证据[32]。如记忆B细胞在原发性干燥综合征中的水平与疾病持续时间和活动度相关[33]。此外树突状细胞在类风湿关节炎的关节破坏中起关键作用，而小檗碱能通过诱导树突状细胞凋亡来减轻炎症和免疫损伤从而降低关节损害[34]。相关性分析显示，TNF和IL-6与记忆B细胞数量正相关。记忆B细胞分为未转换（CD27+IgD+）和转换（CD27+IgD-）两个亚群[35]。转换的记忆B细胞通常被认为起源于生发中心，是具有长寿命和丰富抗原经验的经典记忆B细胞。目前关于未转换记忆B细胞在人类健康和疾病中的功能的报道有限。这两个亚群在响应TLR配体时，与初始B细胞相比，能产生更高水平的细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α [36]。RNA测序显示，与健康对照组的转换记忆B细胞相比，脾亢患者未转换的记忆 B 细胞中的IL-6基因表达量高出两倍，这表明未转换的记忆B细胞比转换的记忆B细胞更容易产生这种细胞因子 [37]。在新型冠状病毒感染患者中也观察到，记忆B细胞促进炎细胞因子IL-6和TNF-α分泌；未转换记忆B细胞是IL-6的主要产生者，而转换记忆B细胞是TNF-α的主要产生者。这些研究表明，记忆B细胞在对炎症环境有贡献[38]。尽管有研究指出新型冠状病毒感染会显著增加痛风患者的发作频率和尿酸水平，但是否与记忆B细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α有关还不清楚，目前也尚未发现其他研究揭示痛风中记忆B细胞与TNF、IL-6之间存在正相关的直接证据[39]。因此，需要更多的基础实验来探究痛风患者免疫细胞的详细功能，以期揭示痛风病理过程的完整机制。
痛风属于中医“痹证”范畴，病名源自朱丹溪的《格致余论·痛风论》：“彼痛风者，大率因血受热，已有沸腾，其后或涉冷水，或立湿地，或扇取凉，或卧当风，寒凉外搏，热血得寒，污浊凝涩，所以作痛”[40]。中医治疗痛风临床疗效确切，治疗方法多样，包括中药汤剂、针灸、推拿、中药外敷等[6]。Meta分析研究显示，中药可有效降低痛风患者的尿酸、C反应蛋白和红细胞沉降率，并且在不良反应率方面也优于单纯的西药治疗[41]。本研究通过Coremine Medical数据库，筛选出人参、三七、黄芩、三白草、丹参、黄芪、郁金、姜黄、鱼腥草和玉簪花与痛风的关系最密切。研究表明，人参及其主要活性成分人参皂苷具有多种生物活性，包括抗炎和抗氧化作用，并提供肾脏保护人参及其化合物参与了许多生物活性，如减少炎症和保护肾脏损伤[42]。Zhang等[43]认为人参皂苷可通过降低高尿酸血症小鼠的肾功能紊乱和增加尿酸排泄量来降低尿酸水平。最近的研究表明，人参不仅可以通过抑制黄嘌呤氧化酶活性和促进大鼠尿酸排泄来改善高尿酸血症，还可降低了血清和肾脏中的IL-1β水平，减轻了肾脏的炎症浸润。因此，Sung 等[44] 也认为人参是高尿酸血症和痛风的潜在中药。
三七皂苷是三七的主要活性成分[45]，三七皂苷能显著降低氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞炎症中TNF-α和IL-1β的表达[46]。而在MSU诱导的血管内皮细胞凋亡模型中，三七皂苷能通过显著抑制急性炎症因子ICAM-1的表达发挥出细胞保护作用[47]。在尿酸诱导的急性痛风性关炎大鼠模型中，三七提取物能抑制关节滑膜液中IL-1β、TNF-α和IL-1α的表达，并且能够缓解大鼠踝关节肿胀度程度，进而改善步态跛行症状[48]。别嘌醇可通过抑制黄嘌呤氧化酶减少尿酸的生成。Li等 [49]通过对黄芩分析，成功提取到黄芩苷和汉黄芩素这两种具有强烈抑制黄嘌呤氧化酶活性化合物，这有助于预防或治疗痛风。另一方面，黄芩通过减少中性粒细胞的募集和促炎因子的表达以及增加前列腺素D2的水平来减少MSU晶体诱导的炎症[50]。本研究还发现了一些既往几乎未被用于痛风治疗的中药，如三白草、郁金、鱼腥草和玉簪花。这些发现不仅拓宽了痛风治疗的选择，也为中药在疾病治疗中提供了新的方向。中药具有悠久历史和丰富临床经验，作为我国独特的卫生资源潜力巨大，一直以来在疾病治疗中扮演着重要角色[51-52]。此次预测出具有治疗痛风潜力的中药，对于对现有治疗不满意或耐受性不佳的患者可能具有重要意义。针对这一发现，未来的研究可以从以下几个方面展开：首先，开展临床试验验证中药治疗痛风的安全性和有效性，评估治疗效果、剂量等关键参数；其次，深入研究中药作用机制，揭示其在痛风治疗中的作用途径和分子机制；再次，研究中药与常规药物的相互作用，评估联合应用对痛风治疗的影响。最后，探索更多具有潜力的中药组方，为痛风治疗提供更多选择。
综上所述，本研究借助生物信息学方法对痛风相关芯片数据进行深入分析与探索，识别出若干可能与痛风发病机制密切相关的关键基因，并分析了痛风可能的免疫机制，预测出了人参、三七、黄芩等传统中药可能对治疗痛风具有潜在疗效，为痛风的临床治疗提供了新方向。本文也存在一定的局限性：首先，潜在的干扰因素或数据误差对痛风的发病机制及免疫机制的准确解读构成了挑战，这些未被识别的因素有可能误导关键基因的鉴定，导致对痛风病理过程的错误评估；其次，未对免疫细胞进行验证，可能导致对免疫机制的理解不够全面和准确；最后，尽管发现了一些潜在的治疗痛风的中药，但中药的复杂性意味着其疗效和安全性需要通过更多的研究来确立。未来的研究应更深入研究痛风的分子和细胞机制，特别是探索基因和免疫途径之间的相互作用。并开展长期随访研究，以评估中药治疗痛风的长期效果和安全性。鼓励跨学科合作，结合生物信息学、遗传学、免疫学和临床医学等领域的专家，共同推进痛风的研究。
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