目的  利用高分辨液相色谱-质谱联用仪，快速准确地对红花清肝十三味丸中复杂的化学成分进行分析鉴定，旨在明确其缓解非酒精性脂肪肝的有效成分，同时结合网络药理学和分子对接，探索红花清肝十三味丸潜在的作用机制。

方法  使用甲醇和含有0.1%甲酸的水溶液作为流动相，进行梯度洗脱；采用正负离子交替扫描模式切换扫描，扫描范围m/z 110~1 200；通过与对照品、参考文献与自建数据库比对后对复方中化合物进行识别鉴定；基于液质联用数据，通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库进一步筛选活性化合物，并利用SwissTargetPrediction、GeneCards等在线数据库预测分析红花清肝十三味丸在治疗非酒精性脂肪肝可能的靶点并进行KEGG与GO的富集分析；利用蛋白质-蛋白质相互作用网络筛选核心靶点；最后运用分子对接技术验证活性化合物与靶点的潜在结合活力。

结果  从红花清肝十三味丸中共鉴定出75个化合物，其中黄酮类化合物31个，有机酸类化合物17个，鞣质类化合物9个，环烯醚萜类化合物8个，木质素类化合物3个及其他类化合物7个。利用网络药理学方法筛选出核心靶点5个：丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、表皮生长因子受体（EGFR）、人表皮生长因子受体2/酪氨酸激酶受体2（HER2/ERBB2）、磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基1（PI3KR1）及非受体酪氨酸激酶Src。KEGG富集通路主要为：PI3K-AKT信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗通路、ERBB信号通路。

结论  对红花清肝十三味的复杂化学成分进行了快速准确地分析鉴定，同时探讨其治疗非酒精性脂肪肝的可能作用机制，为红花清肝的质量控制及后续研究提供科学参考。

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种由于代谢功能障碍，导致肝脏内甘油三酯过度积累引起的一种常见的肝脏疾病[1]，与肥胖、2型糖尿病、胰岛素抵抗和高脂血症等密切相关。在蒙医理论中，将NAFLD归于“通拉嘎未消化症”[2]，认为是由于体内三根失调、巴达干增多、希拉功能紊乱等，致使肝脏中精华与糟粕的分解受到阻碍，未消化的精华在肝脏中过度堆积无法代谢，从而诱发NAFLD。由于NAFLD的致病机制复杂，而传统蒙药复方具有多成分、多靶点的特点，在调节代谢功能和改善肝脏脂肪积累方面展现出独特的治疗优势。

红花清肝十三味丸（又名古日古木-13味丸，以下简称HHQG）是收录在《中华人民共和国卫生部药品标准》中的经典蒙药方剂 [3]，具有清肝热、解毒、杀黏等多种作用，是蒙医肝胆科常用复方制剂[2]。尽管HHQG治疗NAFLD效果显著，但对其化学成分及作用机制尚未见到系统的报道。本研究通过高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱（high performance liquid chromatography-Q-Exactive mass spectrometry，HPLC-Q-Exactive MS）技术和网络药理学分析方法对HHQG中复杂化学成分及其治疗NAFLD的潜在机制进行初步探讨，为该药的药效物质基础和临床应用提供有效的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Ulti-Mate 3000型色谱仪和Q-Exactive高分辨率质谱仪（赛默飞世尔科技中国有限公司）；AP135W型高精度电子天平（日本岛津公司）；C-2L-MRE型旋转蒸发仪（上海舍岩仪器有限公司）；98-I-BN型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；KH-500DV型数控超声波清洗器（昆山禾创超声有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

绿原酸（批号：110753-202018）、芦丁（批号：100080-202012）、阿魏酸（批号：110773-201914）、栀子苷（批号：110749-201718）、川楝素（批号：111824-201804）、槲皮素（批号：10081-201810）、异鼠李素（批号：110860-202012）、木犀草素（批号：111520-202107）、去氢木香内酯（批号：111525-202313）对照品均购自中国食品药品检定研究院；原儿茶酸（批号：PU0918-0025）、芹菜素（批号：PS011063）、柯里拉京（批号：PS011824）对照品均购自成都普思生物科技股份有限公司；HHQG（内蒙古蒙药股份有限公司，批号：2021061）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 方法

1.3.1 基于HPLC-Q-Exactive MS的HHQG成分鉴定

①供试品溶液制备：将HHQG粉碎，过60目筛，称取约2.0 g至锥形瓶中，加85%甲醇10  mL，称重，超声（功率：250 W，频率：40  kHz）处理30 min，冷却至室温，85%甲醇补重，摇匀，经0.22 μm滤膜过滤，于4 ℃条件下储存、待用。

对照品溶液制备：精密称取绿原酸、芦丁、阿魏酸、异鼠李素、芹菜素、去氢木香内酯、栀子苷、川楝素、槲皮素、木犀草素、原儿茶酸和柯里拉京对照品分别置于10 mL量瓶中，加入适量甲醇溶解，定容，获得浓度分别为541、198、225、420、310、211、213、238、427、316、209、187 μg/mL的对照品储备液；取上述各储备液100 μL至10 mL量瓶中，用85%甲醇定容得混合对照品溶液，于4 ℃条件下储存、待用。

②色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱（150 mm×4.6  mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~3  min，5% A；3~8  min，5%→30% A；8~18  min，30%→50%  A；18~30 min，50%→75%  A；30~35  min，75%~95%  A；35~40  min，95% A）；流速：0.8 mL/min；柱温：35 ℃，进样量：5 μL。

质谱条件：采用电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），于正、负离子模式下进行检测，全质量扫描分辨率为70 000，二级质谱分辨率为17 500，扫描范围为m/z 110~1 200，碰撞能量为30 eV，喷雾电压为3.50 kV（+）和4.0 kV（-），离子传输管温度300 ℃（+）和400 ℃（-），辅助气温度350 ℃，辅助气体积流量30 L/min[4-6]。

③成分数据库建立及化合物鉴定。基于PubMed、CNKI、中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）数据库对HHQG全方及各单味药材进行检索，建立包括化合物名称、分子式、精确相对分子量等信息的本地数据库[4-17]。随后，取供试品溶液及对照品溶液进样，获得正、负离子模式下总离子流图，使用Xcalibur 3.0软件对总离子流图进行处理，以自建数据库为基础，并以一级质谱偏差在1×10-5以内为原则，对HHQG成分进行辨识分析，阐明HHQG所含具体化学成分。

④潜在活性化合物筛选。在药物研发中，ADME（吸收、分布、代谢、排泄）参数的筛选是评估化合物成药性的重要环节[18]。药物相似性（drug-likeness，DL）是基于化合物的结构和药理学特性的计算得分，用于评估其作为药物的潜力，DL低于0.18的化合物往往表现出较差的药物相似性和成药潜力[19]；口服生物利用度（oral bioavailability，OB）指药物通过口服途径进入全身循环的比例，口服药物的OB值在30%及以上，表明其能够在人体中达到有效浓度[20]。故此将液质鉴定出的化合物导入TCMSP在线数据库，设置DL≥0.18、OB≥30%为条件，筛选HHQG活性化合物。

1.3.2 基于活性化合物的网络药理学分析

①构建“活性化合物-潜在治疗靶点”相互作用网络。在PubChem网站查询并下载活性化合物的SDF格式文件，导入PharmMapper网站，以拟合分数＞0.9作为条件筛选各活性化合物作用靶点，合并去重，获得HHQG作用靶点；以“non-alcoholic fatty liver disease”为关键词，在GeneCards、人类孟德尔遗传在线数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、PharmGKB、比较毒理学数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）、DrugBank 5个在线数据库对NAFLD进行疾病靶点搜索，合并去重，获得疾病靶点；将活性化合物作用靶点与NAFLD疾病靶点导入Venny 2.1在线软件作图工具平台绘制韦恩图，获得HHQG治疗NAFLD的潜在靶点；将活性化合物及其治疗NAFLD潜在靶点导入Cytoscape 3.9.0软件，构建“活性化合物-潜在治疗靶点”相互作用网络。

②潜在治疗靶点GO功能和KEGG通路富集分析。采用注释、可视化和集成发现数据库（The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，DAVID）对HHQG潜在治疗NAFLD靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析，并借助R 2.4.1语言包对富集结果进行可视化分析。

③蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及核心靶点筛选。将获得的潜在治疗靶点导入STRING数据库，物种项选择“homo sapiens”，设定“minimum required interaction score”为0.992，去除孤立节点，生成蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图；下载PPI网络的TSV格式文件，导入Cytoscape软件，利用CytoNCA计算交集PPI的网络拓扑学特征属性值并对结果进行筛选，两次打分后获得核心靶点。

④分子对接验证HHQG中的关键成分与核心靶点的结合能力。在蛋白质结构数据库（protein data bank，PDB）及AlphaFold数据库中查找核心靶点蛋白，利用PyMOL 1.8.7移除所有配体、水分子和共晶体分子，添加氢原子，随后设置对接活性口袋包裹整个蛋白结构；下载关键小分子化合物三维结构，使用AutoDock Tools 1.5.7将小分子以及核心靶点蛋白转换为PDBQT格式；利用AutoDock Vina 1.2.0进行分子对接分析并计算结合能，结合能小于-5 kcal/ mol认为化合物与靶蛋白结合稳定，选择结合能最低且符合生物学意义的构象使用Discovery Studio进行可视化展示。

2 结果

2.1 基于HPLC-Q-Exactive MS的HHQG成分鉴定结果

共鉴定出75个化学成分，包括黄酮类31个，有机酸类17个，鞣质类9个，环烯醚萜类8个，木质素类3个，其他类7个，其中有12个化学成分通过与对照品比对得到进一步的确认，结果见表1和图1A~C；共筛选出HHQG潜在活性成分13个，具体见图1D。

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  表格1 HHQG化学成分鉴定

  Table 1.Identification of chemical components of HHQG

  注：*为与对照品比对。

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  图1 HHQG化学成分鉴定与活性化合物筛选

  Figure 1.Chemical component identification and active compound screening of HHQG

  注：A. 正离子模式；B. 负离子模式；C. 化合物分类；D. TCMSP活性化合物筛选。

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2.2 网络药理学结果

2.2.1 治疗靶点获取及“活性化合物-潜在治疗靶点”网络构建

将13个候选活性化合物导入PharmMapper在线网站，共获得329个作用靶点；利用关键词“non-alcoholic fatty liver disease”在5个在线数据库进行疾病靶点搜索，GeneCards数据库获得4 158个靶点、OMIM数据库获得82个靶点、PharmGKB数据库获得46个靶点、CTD数据库获得87个靶点、DrugBank数据库获得5个靶点，将各数据库的靶点数据绘制韦恩图（图2A），汇总去重后获得40 207个疾病靶点；将活性化合物靶点与疾病靶点取交集，获得207个潜在治疗靶点（图2B）；使用Cytoscape 3.9.0软件，构建13个活性化学成分与207个交集靶点的网络图（图 3），每个化合物连接的靶点数量作为权重，度数越高，代表化合物的形状越大。

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  图2 潜在治疗靶点获取

  Figure 2.Acquisition of potential therapeutic targets

  注：A. NAFLD疾病靶点；B. HHQG治疗NAFLD潜在靶点。

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  图3 “活性化合物-潜在治疗靶点”网络图

  Figure 3.Network diagram of "active compounds-potential therapeutic targets"

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2.2.2 潜在治疗靶点GO功能和KEGG通路富集分析

使用DAVID 6.8.0数据库对获得的207个交集靶点进行GO和KEGG通路富集分析，设置过滤条件P＜0.05。GO功能富集得到生物过程（biological process，BP）条目2 305个，细胞组成（cellular component，CC）条目109个，分子功能（molecular function，MF）条目245个，分别选取BP、CC、MF前10条通路进行可视化处理（图4A）。BP主要涉及激酶活性的调控、酪氨酸磷酸化修饰、对异种生物刺激的反应等；交集基因编码的蛋白大多定位于膜筏、膜微区、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物等位置；MF主要涉及调节跨膜激酶及受体活性、调节丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性、调节类固醇羟化酶活性等。KEGG结果根据P值与Count值排序后选取排名前30位的条目绘制柱状图（图 4B），结果明显富集到磷酸肌醇3激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（phosphoinositide 3-kinases-serine/threonine kinase，PI3K-AKT）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂抵抗与酪氨酸激酶受体（human epidermal growth factor receptor，ERBB）等重要的信号通路。结果表明HHQG中的潜在活性化学成分可能通过调节细胞膜上的EGFR与ERBB等酪氨酸激酶受体活性，影响下游PI3K-AKT等信号通路，调节细胞周期、细胞代谢和氧化应激等，从而发挥抗NAFLD的作用。

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  图4 潜在治疗靶点GO与KEGG富集分析结果

  Figure 4.GO and KEGG enrichment analysis results of potential therapeutic targets

  注：A. GO分析；B. KEGG富集分析。

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2.2.3 核心靶点筛选

将交集靶点上传至STRING数据库，绘制PPI网络图，结果包括207个节点，125条相互作用连线，去除孤立节点后，导出PPI网络图（图5）。

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  图5 PPI网络图

  Figure 5.PPI network diagram

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使用Cytoscape软件以连接度、介度、紧密度3项经两次评分后筛选出5个核心靶点：AKT1、EGFR、ERBB2/人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、PI3K调节亚基1（PI3K regulatory subunit 1，PI3KR1）以及非受体酪氨酸激酶Src（图 6）。提示这些靶点可能是HHQG治疗NAFLD的潜在关键靶点。

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  图6 核心靶点筛选

  Figure 6.Core targets screening

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2.4 活性化学成分与核心靶点的分子对接可视化分析

将5个核心靶点与相应的活性小分子化合物进行分子对接（表2）。结合能越小说明成分与靶点结合越容易。在本次研究中，所有活性化学成分与核心靶点的结合能均低于-5  kcal/ mol，表明配体与受体蛋白结合稳定，方剂中多个活性化合物与核心靶点具有良好的亲和力以及潜在的药效活性。为进一步可视化展示对接结果，筛选HHQG中关键化合物，基于表2绘制网络图，采用力引导布局（图7）。木犀草素（OB为36.16%，DL为0.25）、异鼠李素（OB为49.60%，DL为0.31）、金合欢素（OB为34.97%，DL为0.24）、槲皮素（OB为46.43%，DL为0.28）、鞣花酸（OB为43.06%，DL为0.43）为HHQG治疗NAFLD的关键化合物。由于部分靶点能与多种小分子化合物结合，本研究筛选了与每个核心靶点结合能最低的关键小分子进行可视化展示，具体见图8。

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  表格2 分子对接结合能数据

  Table 2.Molecular docking binding energy

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  图7 核心靶点与对应活性化合物网络图

  Figure 7.Network diagram of core targets and corresponding active compounds

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图8展示了化合物与核心蛋白的结合模式，包括三维结构、结合位点和相互作用分析。左侧分别为核心蛋白的三维结构（红色代表α螺旋，蓝色代表β折叠，绿色代表无规则卷曲），其对应的活性化合物以黑色线条形式展示并嵌入蛋白质的结合位点；中间图为化合物与蛋白结合位点的放大图；右侧图展示了化合物与核心蛋白的2D相互作用图，其中氢键作为强相互作用力参与维持蛋白质的二级结构和三级结构，增强配体与受体的结合亲和力，从而影响信号传导和生物活性：槲皮素与AKT1蛋白的ASP-190、LYS-297、GLU-298、THR-197形成氢键；木犀草素与EGFR蛋白的ARG-803、LYS-879形成氢键；鞣花酸与ERBB2蛋白的GLU-770形成氢键；金合欢素与PI3KR1蛋白的GLN-988形成氢键，与THR-315、PRO-943形成碳氢键；木犀草素与PI3KR1蛋白的ASP-813、LYS-812、THR-915形成氢键；鞣花酸与Src蛋白的GLN-528、LYS-203形成氢键；槲皮素与Src蛋白的GLN-528、LYS-203、ARG-155、SER-177、GLU-178形成氢键。分子对接结果显示，鞣花酸、槲皮素等关键化合物能够与多个核心靶点形成较为稳定的结合，具有多靶点作用的潜力，HHQG在治疗NAFLD时，可能通过同时调控多个信号通路发挥协同效应。

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  图8 活性化学成分与核心靶点分子对接可视化

  Figure 8.Visualization of molecular docking between active chemical constituents and core targets

  注：A. AKT1-槲皮素；B. EGFR-木犀草素；C. ERBB2-鞣花酸；D. PI3KR1-金合欢素；E. PI3KR1-木犀草素；F. Src-鞣花酸；G. Src-槲皮素。

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3 讨论

HHQG是传统蒙药，该方经历代蒙医发展与完善，最终确定由红花、丁香、莲子、麦冬、木香、诃子、川楝子、栀子、紫檀香、人工麝香、水牛角浓缩粉、人工牛黄、银朱13味药材组成，具有清肝、解毒、调理肝脏等功效。现代研究表明，HHQG在治疗NAFLD方面具有显著疗效，研究选取NAFLD患者100例，给予HHQG后发现治疗组可明显改善NAFLD与肝纤维化症状[21- 22]。但由于其成分复杂，对于其物质基础及作用机制研究较少。本文基于高分辨液质技术高效的分离能力和强大的结构辨识能力，通过部分对照品对比、参考文献及二级质谱碎片信息共鉴定和推测出HHQG中的75个化合物[23]，其中黄酮类化合物31个，有机酸类化合物17个，鞣质类化合物9个，环烯醚萜类化合物8个，木质素类化合物3个及其他类化合物7个，为后续药效研究提供物质基础数据；之后以DL≥0.18和OB≥30%为标准筛选出13个具有潜在药效活性的小分子化合物，进行网络药理学分析[24]，进一步筛选HHQG治疗NAFLD的5个核心作用靶点（AKT1、EGFR、ERBB2、PI3KR1、Src）、5个关键化合物（木犀草素、异鼠李素、金合欢素、槲皮素、鞣花酸）及3条重要信号通路（PI3K-AKT信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、ERBB 信号通路），以探讨其治疗NAFLD可能的作用机制。

现代药理学常使用“二次打击”学说来揭示NAFLD的发病机制，而其中“一次打击”的核心问题是胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）[25]。IR是指细胞对胰岛素的敏感性降低，导致葡萄糖摄取减少和血糖升高，机体游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）增多。FFA在转运蛋白的协助下进入到肝脏，通过线粒体的β氧化、α氧化以及内质网的ω氧化等途径进行分解，当肝脏中FFA的输入持续增加时，这些FFA不再被运输到线粒体中进行分解，而在肝细胞内累积，进而导致肝细胞的脂肪变性[26]。此外，FFA的分解过程中还会产生大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），成为“二次打击”即氧化应激的关键物质，ROS可以通过激活FAS系统进而促进细胞凋亡，而死亡的细胞又会吸引炎症细胞，释放炎症因子，进一步加剧肝脏的炎症和损伤[27]，在脂肪肝发展为脂肪肝炎及纤维化过程中发挥重要作用。

本研究网络药理学所筛选出的5个核心蛋白中，EGFR与ERBB2（HER2）均属于ERBB受体家族的酪氨酸激酶受体，当这些受体被小分子配体激活后，会发生二聚化和自磷酸化，启动下游包括PI3K-AKT在内的多条信号通路[28]；Src为非受体型酪氨酸激酶，可通过磷酸化并激活PI3K，PI3K激活后，生成磷脂酰肌醇-3,4,5三磷酸，进一步招募并激活AKT。AKT是位于糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）上游的一个重要调控靶点，肝细胞内磷酸化的AKT可促使GSK-3磷酸化，进而合成肝糖原。有研究发现，与正常小鼠相比，AKT2基因敲除小鼠的肝脏表现出了对胰岛素的敏感性减弱的现象，进一步证实了AKT是维持正常糖代谢的重要蛋白激酶[29]。同时，活化的AKT可以抑制多种促凋亡蛋白[如B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）相关细胞死亡因子（Bcl-2 associated death promoter，Bad）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）]的功能，激活抗凋亡蛋白（如Bcl-2和Bcl-XL），从而促进细胞存活。有研究发现，木犀草素能够通过激活PI3K/AKT信号通路，从而促进细胞存活和减轻炎症反应[30]；槲皮素与异鼠李素可以通激活PI3K/AKT通路改善胰岛素信号传导，减少胰岛素抵抗，降低肝脏脂肪积累[31]。HHQG现有质量控制化合物为栀子中栀子苷、红花中羟基红花黄色素A、丁香中丁香酚[32]。本研究分析发现，HHQG中木犀草素、异鼠李素等黄酮类化合物应为日后该药质量控制的重要的化合物。综上，HHQG可能通过调控PI3K-AKT信号传导通路，激活下游与葡萄糖代谢相关酶活性，增强胰岛素介导的葡萄糖摄取和代谢，进而改善胰岛素的敏感性，降低IR[33]，影响脂肪酸的合成和氧化，抑制肝脏脂肪积聚，同时减少肝脏炎症反应并促进肝细胞生存，减轻由长期炎症可能引起的肝纤维化[34]。

HHQG作为多成分的蒙药方剂，其多靶点、多途径的作用机制，使其在复杂的病理环境中具备独特的治疗优势。包旭等[35]发现HHQG可显著降低小鼠肝损伤区域肿瘤坏死因子-α的表达量，减轻肝损伤后发生的炎症；卢任玲等[36]研究发现HHQG可能通过抑制c-Jun氨基末端激酶/c-Jun信号通路的活化，调节下游凋亡基因和蛋白的表达来抑制肝细胞的凋亡。本研究综合HHQG“活性化学成分-潜在治疗靶点”网络与“二次打击”学说，揭示其在降低IR与缓解氧化应激的潜在机制，为NAFLD的临床治疗提供了新的思路和潜在的药物靶点，同时也为HHQG的质量控制提供了科学依据。未来进一步深入研究HHQG中关键化合物与靶点的作用方式，将为NAFLD的临床治疗提供更为有效的干预策略和药物开发方向。

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