目的  对生脉饮中麦冬的质量和真伪进行评价，建立测定麦冬高异黄酮A、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C 3种特征成分的超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（UPLC-MS/MS）法，为药品监管提供技术支持。

方法  采用Phenomenex Kinetex F5 C18柱（100 mm×3.0 mm，2.6 µm），以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.4 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为1 μL；采用质谱检测仪、电喷雾正离子及负离子模式、多反应监测进行测定。

结果  麦冬高异黄酮A、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C的线性范围分别为0.016 7~1.666 0、0.039 7~15.872  0、0.022  5~8.988  0  ng（r≥0.999 9），平均回收率分别为85.16%、86.95%、95.07%，RSD分别为2.65%、1.45%、1.14%（n=6）。38批样品中麦冬高异黄酮A含量相差较大，有7批检出山麦冬皂苷B或短葶山麦冬皂苷C。

结论  该方法简便、灵敏，可用于生脉饮中3种特征成分的检测，为生脉饮中麦冬的质量控制提供参考。

生脉饮处方为红参、麦冬、五味子3味药，源于《医学启源》中的生脉散[1]。麦冬性甘，具益阴、清肺、生津之效[2-4]，方中用量占50%，是滋补之上品。《中国药典（2020年版）》规定麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus（L.f.） Ker-Gawl.的干燥块根，而山麦冬为百合科植物湖北麦冬Liriope spicata（Thunb.）Lour. var. prolifera Y.T.Ma或短葶山麦冬Liriope muscari（Decne.）Baily的干燥块根[5]。2021年市场上麦冬的价格约60元/kg，而山麦冬的价格约30元/kg，远低于麦冬。又因山麦冬和麦冬功效相近，市场上存在麦冬及其制剂中掺伪山麦冬的现象[6-8]。《药品生产管理规范》规定，制剂生产必须按处方量的100%投料，说明两者不可混用。目前，《中国药典（2020年版）》生脉饮项下并未对方中的麦冬进行定量控制，仅麦冬药材薄层色谱鉴别不足以评价其质量及真伪。

有研究报道，麦冬高异黄酮A是麦冬的特征成分，而山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C分别是湖北麦冬、短葶山麦冬的特征成分[9-12]。因此，本研究拟在38个批次的生脉饮中，采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法同时测定麦冬高异黄酮A、山麦冬皂苷B和麦冬皂苷C 3种特征成分的含量，以达成对生脉饮中麦冬的品质评估。

1 材料

1.1 主要仪器

AB QTRAP4500型液相-质谱联用仪（美国SCIEX公司）；CPA225D型天平（德国梅特勒-托利多公司，d=0.01 mg）；Milli-Q Advantage A10型超纯水机（德国Merck公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品：麦冬高异黄酮A（江苏永健医药科技有限公司，批号：100670，纯度98%）；山麦冬皂苷B（批号：111907-201804，纯度100%）、短葶山麦冬皂苷C对照品（批号：200472-170110，纯度100%）、麦冬对照药材（批 号：121013-201711）、短葶山麦冬对照药材（批号：1136-200001）均购自中国食品药品检定研究院；湖北麦冬对照药材（安徽广和中药股份有限公司，批号：201025，产地：湖北）；甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯，水为纯化水。

16家生产企业38批次样品均来自2022年江苏省评价性抽验样品，检验标准均为《中国药典（2020年版）》一部[5]，规格均为10 mL/支。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件

Phenomenex Kinetex F5 C₁₈柱（100 mm× 3.0  mm，2.6 µm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0~5  min，98% A；5~6 min，98%→40%  A；6~8  min，40%→20% A；8~10 min，20%  A；10~12 min，20%→98% A；12~15 min，98%  A）；流速：0.4  mL/ min；柱温：30 ℃；进样量1 μL[13]。

2.1.2 质谱条件

采用质谱检测器，电喷雾离子源，正负离子扫描；多反应监测模式；离子源电压：5 500 V（正离子）和-4 500 V（负离子）；离子源温度：500  ℃；气帘气：35 psi；雾化气：50 psi；辅助气：50 psi；其他质谱参数见表1[10]。

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  表格1 各成分质谱参数

  Table 1.Mass spectrometric parameters of each component

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2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液

分别精密称取麦冬高异黄酮A、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C对照品，加甲醇制成每1  mL含麦冬高异黄酮A 83.30 μg、山麦冬皂苷B 99.20 μg、短葶山麦冬皂苷C 112.35 μg的对照品储备溶液。精密量取上述对照品储备溶液各0.1  mL，置同一100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成每1 mL含麦冬高异黄酮A 83.30 ng、含山麦冬皂苷B 99.20 ng、短葶山麦冬皂苷C 112.35 ng的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

精密量取本品10 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液

照生脉饮的处方去除麦冬，按生脉饮的制法制成预备溶液，再按“2.2.2”项下方法制成缺麦冬阴性样品溶液。

2.2.4 标准样品溶液及阳性样品溶液

照生脉饮的处方，分别取麦冬、湖北麦冬和短葶山麦冬，按生脉饮的制法制成预备溶液，再按“2.2.2”项下方法分别制成含麦冬的标准样品溶液、含湖北麦冬的阳性样品溶液和含短葶山麦冬的阳性样品溶液。

2.3 专属性试验

将“2.2.4”项下制备的标准样品溶液及阳性样品溶液、“2.2.1”项下制备的混合对照品溶液、“2.2.3”项下制备的阴性样品溶液分别进行检测。如图1所示，与麦冬高异黄酮A一致的离子峰仅在含麦冬标准样品中被检出，与山麦冬皂苷B一致的离子峰仅在含湖北麦冬阳性样品中被检出，与短葶山麦冬皂苷C一致的离子峰仅在含短葶山麦冬阳性样品中被检出。而阴性样品图谱中均未见与上述3种成分一致的离子峰，由此可见，麦冬高异黄酮A、山麦冬皂苷B及短葶山麦冬皂苷C分别是麦冬、湖北麦冬和短葶山麦冬的特征成分，制剂中红参、五味子和其他成分对测定结果无影响，表明该试验条件专属性良好。

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  图1 专属性MRM色谱图

  Figure 1.MRM chromatograms of specificity

  注：A. 含麦冬标准样品；B. 含短葶山麦冬阳性样品；C. 含湖北麦冬阳性样品；D. 混合对照品；E. 阴性样品；1. 短葶山麦冬皂苷C；2. 山麦冬皂苷B；3. 麦冬高异黄酮A。

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2.4 线性考察

取对照品储备液适量，用甲醇配制成系列浓度的标准溶液分别进样，以进样量（X，ng）为横坐标、峰面积A（Y）为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归。3种成分在相应的范围内线性关系良好，结果见表2。

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  表格2 3种成分线性关系考察结果

  Table 2.Results of linear relationship examination of three components

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2.5 检测限与定量限

取麦冬高异黄酮A、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C的单个对照品溶液（均约50 μg/ mL）分别逐级稀释。检测限以信噪比约为3 ∶ 1时注入仪器的量计算，定量限以信噪比约为10 ∶ 1注入仪器的量计算。得到麦冬高异黄酮A、山麦冬皂苷B及短葶山麦冬皂苷C的检测限分别为6.664×10^{- 4}、1.587×10^-3、8.990×10^-4 ng，定量限分别为1.666×10^-3、3.968×10^-3、2.247×10^-3 ng。

2.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，在“2.1”项分析条件下连续进样6次，计算得麦冬高异黄酮A、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C峰面积的RSD分别为5.27%、5.70%和4.08%（n=6），表明仪器精密度较好。

2.7 重复性试验

分别取批号220204、2205301的样品各6份，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下分析条件进样测定，计算得麦冬高异黄酮A、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C的平均含量分别为0.380 5、4.300 8、0.114 5 μg/mL，RSD分别为4.35%、3.13%、4.26%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取“2.7”项下制备所得的批号220204、2205301的供试品溶液各1份，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，计算得麦冬高异黄酮A、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C峰面积的RSD分别为4.05%、2.85%、4.42%（n=7），结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 回收率试验

取同一批已知含量的样品（批号：21260210），每份取样量5 mL，加入一定量的对照品储备液，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，并按“2.1”项下分析条件进样测定，计算得麦冬高异黄酮A、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C的平均回收率分别为85.16%、86.95%、95.07%，RSD分别为2.65%、1.45%、1.14%（n=6），结果表明以上3种成分的回收率良好。

2.10 含量测定

38批样品按拟定的方法进样测定，结果见表3和表4。由表3可知，编号为1、3、4、7的4 批样品既检出了麦冬高异黄酮A，又检出了短葶山麦冬皂苷C，说明是麦冬和短葶山麦冬混合投料；编号为2、5的2批样品仅检出了短葶山麦冬皂苷C，说明是用短葶山麦冬的伪品投料；编号为6的批次既检出了麦冬高异黄酮A，又检出了山麦冬皂苷B，说明是麦冬和湖北麦冬混合投料。

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  表格3 掺伪投料批次的各成分含量测定结果（μg/mL, n=4）

  Table 3.Determination results of each component in the batches of adulterated feed（μg/mL, n=4）

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2.11 聚类分析

对表4批次的含量测定结果用SPSS 22.0软件中Hierarchical Cluster进行聚类分析，结果见图 2。从图可以看出，类间距离为10时，32批样品分成2类：S1~S10、S12~S17、S19~S27、S29（厂家A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、L、M）共26批聚为一类，S11、S18、S28、S30~S32（厂家F、K、N、O）共6批聚为一类，说明2类样品中麦冬高异黄酮A的含量存在显著差异。其中厂家F、N的样品均分别聚为两类，说明这2个厂家未对麦冬质量进行有效控制。大部分厂家麦冬高异黄酮A的含量聚为一类，说明大部分厂家所用的麦冬区别不大，且麦冬高异黄酮A的含量并不高。由此可酌情制定麦冬高异黄酮A的含量范围，以对麦冬进行质量控制。

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  表格4 合规投料批次的含量测定结果（μg/ml, n=4）

  Table 4.Determination results in the batches of compliant feed (μg/ml, n=4)

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  图2 32批样品聚类分析树状图

  Figure 2.Dendrograms of hierarchical cluster analysis for 32 batches

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3 讨论

3.1 样品提取条件的选择

本试验比较了乙醇、正丁醇、乙腈、甲醇作为提取溶剂对试验结果的影响，结果表明用甲醇作为溶剂，提取效率较好，3个特征成分响应值较高，故最终选择甲醇用于提取。此外考察了甲醇与样品溶液的提取比例（2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2），结果发现这3种比例的提取效率无明显差异。但提取比例为1 ∶ 2时，所得上清液中的糖分过高，易导致进样针污染，甚至堵塞；而提取比例为2  ∶  1时，增加了甲醇使用量，提高了成本，综合考虑，最后选择提取比例为1 ∶ 1。

3.2 系统耐用性考察

本研究通过比较Thermo Hypersil GOLD C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，2.6 µm）、Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）与Phenomenex Kinetex F5 C₁₈柱（100 mm×3.0 mm，2.6 µm）对化合物的分离情况，发现Phenomenex Kinetex F5 C₁₈柱峰形良好，分离效果佳。另外，本试验考察了流动相中不同的甲酸浓度（0.05%、0.1%、0.2%）、不同的柱温（25、30、35 ℃）对特征离子峰分离效果的影响。结果发现，在测定条件发生上述变化时，结果未受明显影响，说明方法耐用性良好。故最终确定的“2.1”项下分析条件，特征离子峰分离效果最好、峰形最佳。

3.3 结果分析

麦冬在生脉饮方中用量占一半，但生脉饮的现行质量标准中并未对麦冬的特征性成分进行定量控制，存在监管空白。市场上常存在含麦冬的制剂中用山麦冬部分甚至全部掺伪的现象，影响药品的质量。

本研究建立了高效、灵敏的UPLC-MS/MS方法，考察了16个生产厂家38批生脉饮中麦冬及其掺伪品的3种特征成分的含量，结果表明不同厂家生产的生脉饮中麦冬的特征成分麦冬高异黄酮A含量差别较大，部分厂家存在用山麦冬掺伪的现象。建议企业严格把控麦冬的质量，同时亟待制定相关检测标准规范麦冬的投料。

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