目的  建立罗汉果标准汤剂超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱及多指标含量测定方法。

方法  收集15批不同产地的罗汉果药材，根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》制备罗汉果标准汤剂，计算出膏率；采用UPLC法建立15批罗汉果标准汤剂的指纹图谱并测定主要效用成分11-O-罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷V及山柰苷的含量。利用化学计量学分析评价罗汉果标准汤剂的质量并寻找可能的质量标志物。

结果  15批罗汉果标准汤剂的出膏率范围为24.79%~34.95%，指纹图谱共呈现16个共有峰，指认出其中4个成分；化学计量学分析将罗汉果标准汤剂分为两类，其中广西柳州样品为一类，广西桂林样品为一类，共筛选出7个差异性标志物，按变量重要性投影排序，峰8＞峰7＞峰5＞峰12（山柰苷）＞峰1＞峰13＞峰4；广西桂林样品山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ、罗汉果皂苷Ⅴ指标成分含量略高于广西柳州样品。

结论  本研究建立的UPLC指纹图谱方法和含量测定方法可行，可为罗汉果标准汤剂质量评价提供依据，结合化学计量学，说明山柰苷很可能成为罗汉果的质量标志物。

罗汉果为葫芦科植物罗汉果S. grosvenorii（Swingle）C. Jeffrey ex Lu et Z. Y. Zhang的干燥果实，性凉、味甘，归肺、大肠经，有清热润肺、利咽开音、滑肠通便功效[1]。罗汉果是广西的道地药材之一，主产于广西桂林市等地。现代药理研究表明，罗汉果含有葫芦烷型四环三萜类[2]、黄酮类[3]、多糖类[4]、蛋白质及氨基酸类[5]等活性成分，有抗菌、抗炎、抗氧化等作用，可用于治疗肿瘤、肝脏疾病，具有丰富的营养价值与药用价值[6-8]。

《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》提出标准汤剂的概念，即标准汤剂是选取有代表性的合格原料模仿传统方法规范制备而成的汤剂或汤剂冻干粉。因此，通过标准汤剂的桥接作用，能有效控制中药配方颗粒产品质量，确保临床用药安全[9]。因此，本研究通过建立罗汉果标准汤剂的指纹图谱并结合多指标成分含量测定，为罗汉果标准汤剂的质量评价提供依据，同时，利用化学计量学分析寻找罗汉果可能的质量标志物。

1 材料

1.1 主要仪器

H-class型Waters高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；ME204E型电子天平（精度：0.1  mg）和XRP 26型电子天平（精度：0.001 mg）购自瑞士梅特勒-托利多公司；JJ3000B型电子天平（精 度：10 mg，常熟市双杰测试仪器厂）；YRE-501型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限公司）；TRL-0.5型真空冷冻干燥机（大连双瑞科技有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品罗汉果皂苷Ⅴ（批号：111754-201703，纯度94.0%）和对照品5-羟甲基糠醛（批号：111626-202215，纯度99.5%）购自中国食品药品检定研究院；山柰苷（成都普菲德生物技术有限公司，批号：20110503，纯度99.63%）和11-O-罗汉果皂苷Ⅴ（成都乐美天生物技术有限公司，批号：DST200903-032，纯度99.39%）；乙腈和磷酸为色谱纯，乙醇和甲醇为分析纯，水为超纯水。

本研究所采用的15批罗汉果Siraitia grOsvenOrii（Swingle）C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定，均为葫芦科罗汉果的干燥果实，LHG01~LHG05（编号：L1~L5）产地为广西柳州，LHG06~LHG15（编号：L6~L15）产地为广西桂林。

2 方法与结果

2.1 罗汉果标准汤剂的制备

取罗汉果药材，按照《中国药典（2020年版）》一部罗汉果项下炮制规定[1]，及四部通则0213[10]制成罗汉果饮片。具体炮制方法：取罗汉果原药材，拣去杂质；掰成小块，共制得罗汉果饮片15批。

参考《医疗机构中药煎药室管理规范》[11]和《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》 [12]的相关要求制备罗汉果标准汤剂。具体方法：取罗汉果饮片100 g，加水煎煮两次，第1次煎煮加8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后改文火再煎煮30 min，用200目筛趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加6倍量水，武火煮沸后改文火再煎煮25 min，用200目筛趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；合并两次滤液，减压浓缩至200 mL，分装至西林瓶中，每瓶分装2 mL，真空冷冻干燥，取出，轧铝盖，即得。

2.2 标准汤剂出膏率的测定

罗汉果标准汤剂的出膏率含量以冻干粉量计，标准汤剂的出膏率（%）=冻干粉重量/制备标准汤剂所用的饮片重量×100%。15批标准汤剂的出膏率测定结果见表1，出膏率范围为24.79%~34.95%。

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  表格1 15批罗汉果标准汤剂的出膏率

  Table 1.The extraction rate of 15 batches of Siraitiae fructus standard decoction

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2.3 指纹图谱的建立

2.3.1 色谱条件

采用Waters Cortecs T3色谱柱（100 mm× 2.1  mm，1.6 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0~6 min，2%~7% A；6~17 min，7%~15% A；17~19  min，15%~19%  A；19~28 min，19%~22% A；28~35  min，22%~27% A；35~40 min，27%~90% A）；流速为0.30  mL/ min；检测波长为300 nm（0~25  min）和203 nm（25.1~40  min）；柱温为43 ℃；进样量为1  μL。

2.3.2 混合对照品溶液的制备

精密称定5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷V适量，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇制成每5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷V 浓度分别为51.614、22.914、31.656、52.230 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备

取罗汉果标准汤剂适量，研细，约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50  mL，称定重量，超声处理（功率：500 W，频率：40  kHz）45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 精密度试验

取罗汉果标准汤剂冻干粉（编号：L4），按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次，以峰15罗汉果皂苷V为参照（S）峰，计算得峰1~峰16与S峰相对保留时间的RSD范围为0.02%~0.18%（n=6），相对峰面积的RSD范围为0.32%~1.84%（n=6），均小于3.00%，表明该仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验

取罗汉果标准汤剂冻干粉（编号：L4），约0.5  g，平行6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，以峰15罗汉果皂苷V为S峰，计算得峰1~峰16与S峰相对保留时间的RSD范围为0.02%~0.28%（n=6），相对峰面积的RSD范围为0.88%~2.39%（n=6），均小于3.00%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验

取罗汉果标准汤剂供试品溶液（编号：L4），按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、13、24 h进样测定，以峰15罗汉果皂苷V为S峰，计算得峰1~峰16与S峰相对保留时间的RSD范围为0.05%~0.18%（n=7），相对峰面积的RSD范围为0.56~2.15%（n=7），均小于3.00%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.7 共有峰的确定及相似度评价

按照已建立的指纹图谱方法对15批罗汉果标准汤剂依次进行测定，记录色谱图，分别将罗汉果样品指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2014版）进行处理，以L1为参照指纹图谱，进行多点校正和峰匹配，同时生成对照指纹图谱，15批罗汉果标准汤剂指纹图谱叠加图见图1，对照指纹图谱见图2。分别计算各批样品指纹图谱和对照指纹图谱的相似度，结果见表2。15批罗汉果标准汤剂指纹图谱相似度均大于0.900，表明指纹图谱能作为共性特征用于罗汉果标准汤剂的质量控制。采用对照品比对结合紫外-可见光3D光谱分析对共有峰进行指认，结果见图3。15批罗汉果标准汤剂指纹图谱共有16个共有峰，峰2为5-羟甲基糠醛，峰12为山柰苷，峰14为11-O-罗汉果皂苷V，峰15为罗汉果皂苷V。

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  图1 15批罗汉果标准汤剂指纹图谱叠加图

  Figure 1.Fingerprint overlay diagram of 15 batches of Siraitiae fructus standard decoction

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  图2 罗汉果标准汤剂对照指纹图谱

  Figure 2.Reference fingerprint of Siraitiae fructus standard decoction

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  表格2 15批罗汉果标准汤剂相似度结果

  Table 2.Similarity results of 15 batches of Siraitiae fructus standard decoction

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  图3 罗汉果标准汤剂共有色谱峰指认

  Figure 3.Identification of common chromatographic peaks in Siraitiae fructus standard decoction

  注：峰2：5-羟甲基糠醛；峰12：山柰苷；峰14：11-O-罗汉果苷V；峰15：罗汉果苷V。

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2.4 基于罗汉果标准汤剂的化学计量学分析

2.4.1 主成分分析

采用SIMCA 14.1软件，以15批罗汉果标准汤剂16个共有峰的峰面积为变量进行主成分分析（principal component analysis，PCA），建立罗汉果标准汤剂指纹图谱PCA得分图，见图4。15批标准汤剂基本分为两类，其中广西柳州样品为一类（L1~L5），广西桂林样品（L6~L15）为另一类，其中L12数据异常可能与罗汉果饮片炮制及标准汤剂煎煮过程相关。

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  图4 15批罗汉果标准汤剂PCA得分图

  Figure 4.PCA score chart of 15 batches of Siraitiae fructus standard decoction

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2.4.2 正交偏最小二乘-判别分析

采用SIMCA 14.1软件，以罗汉果标准汤剂16个共有峰的峰面积为变量进行正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），结果模型R²X=0.456，R²Y=0.826，Q²=0.523，其中Q²＞0.5表明模型有效（R²X和R²Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q²表示模型的预测能力），15批罗汉果标准汤剂OPLS-DA得分图见图5。以变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）＞1.0为条件对差异成分进行筛选，共得到7个差异标志物，按VIP值排序为峰8＞峰7＞峰5＞峰12（山柰苷）＞峰1＞峰13＞峰4，见图6。

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  图5 15批罗汉果标准汤剂的OPLS-DA得分图

  Figure 5.OPLS-DA score plot of 15 batches of Siraitiae fructus standard decoction

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  图6 15批罗汉果标准汤剂指纹图谱共有峰VIP图

  Figure 6.VIP diagram of common peaks in fingerprints of 15 batches of Siraitiae fructus standard decoction

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2.5 含量测定

2.5.1 线性关系考察

取山柰苷、11-O-罗汉果皂苷V和罗汉果皂苷V对照品适量，加甲醇制成每毫升含山柰苷80.494 μg、11-O-罗汉果皂苷V 1 001.25 μg、罗汉果皂苷V 2 832.22 μg的混合对照品母液。分别精密量取混合对照品母液5、3、2、1.5、1、0.5  mL，转移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。分别取上述对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样，记录色谱峰面积，以峰面积为纵坐标（Y）、对照品浓度为横坐标（X，μg/mL）绘制标准曲线，结果见表3。山柰苷、11-O-罗汉果皂苷V和罗汉果皂苷V的相关系数均大于0.999 0，表明峰面积与对照品浓度在相应范围内线性关系良好。

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  表格3 罗汉果中3种成分线性关系考察结果

  Table 3.The results of linear relationship of three components in Siraitiae fructus

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2.5.2 精密度试验

取“2.3.2”项下混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次，记录山柰苷、11-O-罗汉果皂苷V和罗汉果皂苷V对照品峰面积，并计算得峰面积的RSD为0.10%~1.23%（n=6），均小于3.00%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验

取罗汉果标准汤剂0.5 g（编号：L4），按“2.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，罗汉果标准汤剂中山柰苷、11-O-罗汉果皂苷V和罗汉果皂苷V的平均含量分别为0.371、13.050、50.945 mg/g，RSD为0.18%~2.01%（n=6），均小于3.00%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验

取罗汉果标准汤剂0.5 g（编号：L4），按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、3、6、10、16、24 h，按“2.3.1”项下色谱条件测定，结果表明，罗汉果标准汤剂中山柰苷、11-O-罗汉果皂苷V和罗汉果皂苷V峰面积的RSD为0.26%~1.87%（n=6），均小于3.00%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的罗汉果标准汤剂0.25 g（编号：L4），共9份，分为3组，每组平行3份，按对照品与样品中待测成分含量比为0.5 ∶ 1、1 ∶ 1、1.5 ∶ 1分别加入山柰苷、11-O-罗汉果皂苷V和罗汉果皂苷V对照品，按“2.3.3”项下方法制备9份供试品溶液，并按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，结果见表4，山柰苷、11-O-罗汉果皂苷V和罗汉果皂苷V回收率的RSD均小于3.00%，表明加样回收率良好。

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  表格4 罗汉果标准汤剂中3种成分加样回收率试验结果（n=9）

  Table 4.Test results of recovery rates of three components in Siraitiae fructus standard decoction (n=9)

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2.5.6 样品测定

分别取15批罗汉果标准汤剂0.5 g，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，平行2份，并按“2.3.1”项下色谱条件测定，采用外标法计算山柰苷、11-O-罗汉果皂苷V和罗汉果皂苷V含量，结果见表5。广西柳州样品山柰苷含量（0.391  mg/ g）略低于广西桂林样品（0.536  mg/ g），11-O-罗汉果皂 苷V含量（9.962  mg/g）略低于广西桂林样品（10.198  mg/ g），罗汉果皂苷V含量（44.135  mg/ g）略低于广西桂林样品（46.055  mg/g），结果表明广西柳州和广西桂林产地的罗汉果标准汤剂质量存在一定差异，其中广西桂林标准汤剂3个指标成分含量略高于广西柳州样品。

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  表格5 15批罗汉果标准汤剂中3种成分含量测定结果（mg/g，n=2）

  Table 5.Content determination results of three components in 15 batches of Siraitiae fructus standard decoction (mg/g, n=2)

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3 讨论

3.1 罗汉果饮片炮制

饮片是标准汤剂制备的直接原料，而《中国药典（2020年版）》罗汉果药材项下无饮片项。因此，根据《中国药典（2020年版）》四部饮片炮制通则的要求，除去杂质即可，另外，根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中“研究表征标准汤剂用汤剂的制备”项下建议“逢壳必捣，逢籽必破”的传统用药习惯，将罗汉果药材用时破壳处理得罗汉果饮片[12]。

3.2 罗汉果标准汤剂制备

标准汤剂是选取有代表性的合格原料模仿传统方法规范制备而成的汤剂或汤剂冻干粉，标准汤剂的质量直接影响中药配方颗粒的质量。基于此，本课题组以特征图谱总峰面积和罗汉果皂苷V含量为评价指标，对煎煮器具、罗汉果饮片用量、捣碎程度考察、加水量、浸泡时间、煎煮时间、固液分离条件进行了单因素考察，最终确定了罗汉果标准汤剂的制备方法。

3.3 特征图谱

本研究利用UPLC建立了15批标准汤剂的特征图谱，结果表明，其特征图谱共呈现16个共有峰，其相似度＞0.900，表明来自广西产地罗汉果原料制备的15批标准汤剂质量较为一致。

3.4 化学计量学分析

本研究利用PCA罗汉果标准汤剂的质量，结果表明，广西柳州样品聚为一类，广西桂林产地样品聚为一类，表现出产地相关性，以VIP＞1为筛选条件，筛选出峰8、峰7、峰5、峰12（山柰苷）、峰1、峰13、峰4共7个活性成分。山柰苷是一种具有降糖作用的强效抗氧化剂，有多种药理作用[13-15]，其水解后可得到黄酮类原型成分山柰酚，山柰酚又称为百蕊草素，在多种中药内广泛存在，具有抗过敏、抗肿瘤、镇痛、抗氧化、抗焦虑等多种药理作用[16]，该结果表明山柰苷很可能成为控制罗汉果质量的质量标志物。

3.5 多指标成分含量测定

罗汉果富含多种效用成分，多指标成分含量测定对中药的质量控制有着重要的意义，结合前期罗汉果药材研究结果[17]及PCA分析结果共选择山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ、罗汉果皂苷Ⅴ作为罗汉果标准汤剂的含量测定指标。结果表明，广西柳州与广西桂林罗汉果标准汤剂质量存在一定差异，广西桂林标准汤剂山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ、罗汉果皂苷Ⅴ指标成分含量略高于广西柳州样品，该结果表明，广西桂林药材质量略优于广西柳州药材，可能与产地地理因素及加工方式有关，具体原因有待进一步研究。

综上所述，罗汉果作为首批药食两用的中草药，制成配方颗粒剂型是必然趋势，其质量标准体系的建立极为重要。本研究建立了罗汉果标准汤剂的指纹图谱，并测定了罗汉果中3种效用成分的含量，其中黄酮类成分山柰苷可能成为罗汉果的质量标志物，为罗汉果原料药材及配方颗粒质量评价提供参考。

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