目的  采用基于转录组数据的方法预测新的抗白色念珠菌化合物并验证其生物活性。

方法  从GEO数据库中获得氟康唑处理白色念珠菌的转录组数据筛选获得差异表达基因。采用Metascape进行KEGG和GO富集分析、String数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。差异基因采用CMap平台进行抗白色念珠菌化合物预测，测定预测化合物的最小抑菌浓度，并采用扫描电镜观察白色念珠菌形态变化，化合物与核心基因进行分子对接预测潜在的抗菌作用机制。

结果  选取GSE159545数据集进行差异基因分析，共获得448个差异表达基因，其中上调基因222个，下调基因为224个；PPI网络中度值排名前10的基因分别为TRP5、HIS4、TRP3、PGI1、HIS5、URA7、DIM1、RPL7、ILV2和GUA1；CMap排名前10的化合物中染色素A3、放线菌酮、坦罗莫司和阿霉素为已知具有抗白色念珠菌活性的化合物；生物活性实验显示，GSK-1059615具有抗白色念珠菌活性，最小抑菌浓度为32 μg/mL，GSK-1059615与色氨酸合酶、CTP合酶、60 S核糖体蛋白和乙酰羟酸合酶具有较强的结合能，是其潜在的抗菌靶点。

结 论  采用转录组数据和CMap相结合的方法预测新的抗白色念珠菌化合物抗白色念珠菌化合物发现提供了新思路和新方法。

过去的10年里，由于易感人群数量的增加，白色念珠菌引起的感染发病率显著提升。近期，世界卫生组织发布了其首个真菌病原体优先名单，念珠菌种类被列入中、高和关键优先类别 [1]。白色念珠菌是人体内常见的机会致病性真菌，常见于手术后、低免疫功能人群的院内感染。白色念珠菌临床常用的药物有多烯类抗真菌药物、棘白菌素类抗真菌药物、唑类抗真菌药物、阿唑类药物等，由于临床长期广谱高剂量使用诱发了菌株的耐药性产生，导致药物的临床治疗效果不佳 [2]，因此持续开发新的抗白色念珠菌药物具有重要的现实意义。

从头开发新的抗菌药物存在诸多困难，例如对化合物安全性、药动学的研究将极大地提高研发周期和研发经费，而从已有的药物中发现新的抗菌药物将有助于改善上述问题，该研发策略也被称为药物重定位。随着现代测序技术、生物信息学技术的发展，研究人员可以更高效地挖掘药物的新用途。CMap（connectivity map）数据库构建了一个转录组数据和化合物效应的桥梁，数据库中包含1 300种FDA批准的药物以及在研的化合物对不同细胞的7 000多份转录组数据，依据相同功效的药物具有类似的转录组数据，因此可以实现对药物重定位[3]。Li等[4]研究中，将单细胞转录组数据与CMap相结合，发现抗抑郁药物帕罗西汀可抑制了G蛋白偶联受体激酶2和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3的表达，降低了p65的磷酸化水平，恢复了Nrf2的表达，并缓解了炎症和氧化应激，发挥肾保护功能。Wang等 [5]研究将权相关性网络分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）与CMap结合发现紫杉醇可通过抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信号通路发挥抗黑色素瘤作用。为了发现新的抗白色念珠菌药物，本研究采用转录组数据与CMap相结合的方法，通过“药物重定位”，尝试从已有的药物分子库中筛选出新的抗白色念珠菌药物，并对其抗菌活性进行初步验证。

1 资料与方法

1.1 转录组数据的获取和差异表达分析

在GEO（gene expression omnibus）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中以“Candida albicans”“fluconazole”进行检索筛选转录组数据，下载相关数据导入easyGEO软件进行分析，对照组为未处理白色念珠菌，实验组为氟康唑处理7  h的白色念珠菌，以∣logFC∣≥1和P＜0.05为截断值进行筛选获得差异表达基因。将差异表达基因导入Metascape（https://metascape.org/gp/index.html）平台进行KEGG和GO富集分析[6]，String（https://string-db.org/）数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，Cytoscape软件导出PPI网络图，并进行度（degree）值分析获得核心基因。

1.2 抗白色念珠菌化合物的预测及活性验证

分别将表达上调或下调最大的150个差异基因导入CMap（https://clue.io/query）平台。比对参数：基因表达L1000，Touchstone，Individual Query，1.0。经过计算获得潜在抗白色念珠菌化合物，化合物的分值越接近-100，表明可能性越大。

1.3 预测化合物的抗菌活性验证

将化合物JNK-9L（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：J611279）、GSK-1059615（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：G427136）、GDC-0941（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：G126357）采用倍比稀释法配置为0.125~128 μg/mL浓度的溶液，白色念珠菌（广东省微生物菌种保藏中心）培养过夜后，在96孔板中分别加入100 μL的菌液和100 μL的药液，并在28  ℃恒温培养箱继续培养24 h，记录各化合物对菌株的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）值。采用扫描电镜观察JNK-9L对白色念珠菌结构的影响，正常培养基处理白色念珠菌为对照组，1/2 MIC 药物处理后的白色念珠菌为模型组，离心获得菌体，经2.5%戊二醛固定、PBS缓冲液冲洗、乙醇梯度脱水，黏样、镀金之后制备电子显微镜样品，进行扫描电镜观察并记录结果。采用牛津杯法测定细菌平板药物敏感性，将3×10⁶~5×10⁶ CFU/mL的菌液与融化的PDA混合均匀，双层倒板法均匀倒入培养皿中凝固后，在牛津杯中加入200 μL 100 μg/mL药液，32 μg/mL 两性霉素B（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：A657418）为阳性对照组，无菌水为阴性对照组。于28 ℃培养箱内培养36~48 h后，记录抑菌圈大小。

1.4 化合物与核心基因的分子对接

从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库检索并下载化合物的GSK-1059615的SDF文件，从PDB（protein data bank）数据库（http://www.rcsb.org/）下载核心基因编码蛋白的PDB文件。在Discovery Studio 2019软件中，并依次进行小分子化合物能量最小化、蛋白准备、活性位点确定和LibDockScore，并对小分子化合物和蛋白的相互作用键进行2D分析。

2 结果

2.1 差异表达基因筛选

对GEO数据库进行检索，选取GSE159545数据集进行差异基因分析共获得448个差异表达基因，其中上调基因222个，下调基因为224个（图1）。

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  图1 氟康唑处理白色念珠菌差异表达基因的筛选

  Figure 1.Screening of differentially expressed genes in Candida albicans treated with Fluconazole

  注：A. 差异表达基因火山图；B. 差异表达基因热图。

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2.2 GO和KEGG富集分析

选取Metascape数据库进行氟康唑处理白色念珠菌差异表达基因的GO和KEGG富集分析。结果显示，生物过程主要富集于小分子代谢过程（small molecule metabolic process）、有机羟基化合物代谢过程（organic hydroxy compound metabolic process）和天冬氨酸家族氨基酸代谢过程（aspartate family amino acid metabolic process）；细胞组分主要富集于核糖体前体（preribosome）、90 S核糖体前体（90  S preribosome）和过氧化物酶体（peroxisome）；分子功能主要富集于氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）、维生素结合（vitamin binding）和裂合酶活性（lyase activity）（图2A）。KEGG富集主要于次级代谢产物生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、代谢途径（metabolic pathways）、类固醇生物合成（steroid biosynthesis）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（glycine、serine and threonine metabolism）和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（phenylalanine、tyrosine and tryptophan biosynthesis）等信号通路（图2B）。

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  图2 差异表达基因的GO和KEGG富集分析

  Figure 2.GO and KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

  注：A. GO富集分析，B. KEGG富集分析。

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2.3 PPI网络构建及核心基因筛选

运用String平台构建氟康唑处理白色念珠菌差异表达基因的PPI网络，该网络共有302个节点，2 473条边。PPI网络中degree值排名前10的基因为TRP5、HIS4、TRP3、PGI1、HIS5、URA7、DIM1、RPL7、ILV2和GUA1，其中基因URA7、DIM1、RPL7和GUA1基因表达上调，TRP5、HIS4、TRP3、PGI1、HIS5和ILV2基因表达下调（图3）。

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  图3 白色念珠菌差异表达基因的PPI网络

  Figure 3.PPI network of differentially expressed genes in Candida albicans

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2.4 抗白色念珠菌化合物预测

将差异表达基因输入CMap平台，进行抗白色念珠菌化合物的预测，排名前10的化合物分别为JNK-9L、染色素A3、放线菌酮、坦罗莫司、蟾毒灵、GSK-1059615、GDC-0941、HG-5-113-01、阿霉素和渥曼青霉素。通过文献报道染色素A3、放线菌酮、坦罗莫司和阿霉素具有抗白色念珠菌活性，渥曼青霉具有抗真菌活性，蟾毒灵具有抗菌活性（表1）。

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  表格1 抗白色念珠菌化合物预测

  Table 1.Prediction of anti-Candida albicans compounds

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2.5 预测化合物的抗菌活性验证

分别测定化合物JNK-9L、GSK-1059615、GDC-0941对白色念珠菌的抗菌活性，结果显示，JNK-9L和GDC-0941无抑制活性，而GSK-1059615对白色念珠菌的MIC为32 μg/mL，抑菌圈为16 mm（图4）。通过扫描电镜观察可以发现，正常白色念珠菌形态完整，表面光滑，经GSK-1059615处理后，白色念珠菌皱缩、塌陷（图5）。

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  图4 牛津杯法测定GSK-1059615对白色念珠菌的抑菌活性

  Figure 4.Determination of the antibacterial activity of GSK-1059615 against Candida albicans using the Oxford cup method

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  图5 化合物对白色念珠菌形态的影响

  Figure 5.The effect of compounds on the morphology of Candida albicans

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2.6 GSK-1059615与核心基因的分子对接研究

选取化合物GSK-1059615与核心基因进行分子对接研究，结果发现GSK-1059615与色氨酸合酶、CTP合酶、60 S核糖体蛋白和乙酰羟酸合酶具有较强的结合能，LibDock分数均大于90，是GSK-1059615潜在的杀菌靶点（表2）。进一步通过分子与靶点的互作分析显示GSK-1059615能与靶点蛋白结合产生多个化合键，与靶点蛋白结合紧密（图6）。

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  表格2 GSK-1059615与核心基因的分子对接研究

  Table 2.Molecular docking study of GSK-1059615 with core genes

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  图6 GSK-1059615与靶点蛋白色氨酸、CTP合酶、60 S核糖体蛋白和乙酰羟酸合酶的分子对接

  Figure 6.Molecular docking of GSK-1059615 with target proteins Tryptophan synthase, CTP synthase, 60  S ribosomal protein, and Acetohydroxyacid synthase

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3 讨论

本研究通过转录组数据和CMap分析预测了多个潜在的抗白色念珠菌化合物，其中染色素A3、放线菌酮、坦罗莫司和阿霉素均为已知的具有抗白色念珠菌活性的化合物，表明本研究的的方法具有较高的可行性。JNK-9L、GSK-1059615、GDC-0941和HG-5-113-01等化合物未见抗真菌活性的报道，本研究最终选择了JNK-9L、GSK-1059615、GDC-0941进行抗白色念珠菌活性验证，结果显示GSK-1059615具有较好的抗白色念珠菌活性，MIC为32 μg/mL，而通过扫描电子显微镜结果显示GSK-1059615白色念珠菌形态发生显著变化，最终皱缩死亡。

GSK-1059615的化学式为(Z)-5-((4-(pyridin-4-yl)quinolin-6-yl)methylene)thiazolidine-2,4-dione，其分子式为 C18H11N3O2S，分子量为 333.36。GSK-1059615是一种针对的抑制剂，具有显著的抗癌活性，如在胃癌研究中，GSK-1059615可以显著抑制AGS细胞和人原代胃癌细胞的生长、存活、增殖和细胞周期进程，阻断PI3K-AKT-mTOR级联激活，下调胃癌细胞中microRNA-9表达[17]，在头颈部鳞状细胞癌中研究，GSK1059615靶向PI3K-AKT-mTOR通路通过程序性坏死通路杀死肿瘤细胞，并可与环孢素A发挥协同抗肿瘤作用[18]。

为了探索GSK-1059615的潜在抗白色念珠菌机制，研究将GSK-1059615与PPI网络中的核心基因进行分子对接研究，结果显示GSK-1059615与色氨酸、CTP合酶、60 S核糖体蛋白和乙酰羟酸合酶具有较强的结合能，LibDock分数均大于90，是GSK-1059615潜在的杀菌靶点。色氨酸是一个经典的抗菌靶点，色氨酸生物合成途径是细菌生长所必需的，美国国家癌症研究所针对该靶点进行虚拟筛选发现了28种潜力化合物，最终发现了3-amino-3-imino-2-phenyldiazenylpropanamide具有显著的抗菌活性 [19]。CTP合酶参与嘧啶代谢，克唑替尼可通过靶向CTP合成酶，导致ATP结合能力丧失，破坏嘧啶代谢中的CTP生产，从而发挥抗菌作用[20]。乙酰羟酸合酶是参与支链氨基酸生物合成途径的一个酶，Wu等 [16]的研究中设计了68种新型的乙氧基磺酰脲类乙酰羟酸合酶抑制剂，其中化合物sodium ((4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)carbamoyl)((2-(ethoxycarbonyl)phenoxy) sulfonyl)amide对白色念珠的MIC可达到2.5 mg/L[16]。GSK-1059615可能通过影响上述靶点发挥抗菌作用。

抗菌实验显示GSK-1059615的抗真菌活性不如两性霉素B，这可能限制其在临床上的直接应用，然而，其抗癌作用表明可能具有多靶点作用，这在治疗某些特定的真菌感染时可能具有独特的优势，尤其是在应对多重耐药菌株时。此外GSK-1059615的抗癌活性，表明其对正常细胞具有一定的细胞毒性风险，因此，未来的研究需要进一步评估其安全性和毒性，特别是在用于真菌感染治疗时。

综上所述，发现新型抗白色念珠菌药物意义重大，本研究采用转录组数据和CMap相结合的方法预测新的抗白色念珠菌化合物，并发现了一个新的具有抗白色念珠菌化合物GSK-1059615，本研究为抗白色念珠菌化合物发现提供了新思路和新方法。

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