目的  基于高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（HPLC-QQQ-MS/MS）、网络药理学、分子对接及实验验证研究健脾益肾方治疗肾性贫血的作用机制。

方法  采用HPLC-QQQ-MS/MS技术，测定健脾益肾方的化学成分，运用TCMIP v2.0等数据库预测健脾益肾方化学成分与肾性贫血的靶点、通路，绘制出“交集成分-交集靶点-通路”网络图，筛选出健脾益肾方治疗肾性贫血的核心靶点及核心成分，并通过分子对接和动物实验进一步验证核心靶点和成分。

结果  从健脾益肾方中共鉴定出11个化学成分，通过Draw Venn Diagram平台筛选得到81个交集靶点，提示丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α（PIK3CA）、表皮生长因子受体（EGFR）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（BCL2）、V-Ha-Ras肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）等为核心靶点，丹酚酸A、迷迭香酸、大黄酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和毛蕊异黄酮为核心成分。分子对接结果显示，网络药理学预测的核心靶点和成分可靠性较高；动物实验表明，健脾益肾方显著改善慢性肾脏病大鼠肾损伤和血常规参数，通过抑制EGFR从而治疗肾性贫血。

结论  通过成分测定和网络药理学关联分析、分子对接及实验验证，阐明健脾益肾方通过抑制EGFR治疗肾性贫血的作用机制，为其临床应用提供参考依据。

肾性贫血是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）最常见的并发症之一。CKD是指肾脏结构或功能异常，且病程超过3个月[1]。研究表明，CKD是全球预后不良的十大因素之一，在过去30年中，其患病率上升了40%[2]。肾性贫血是指各种肾脏病致肾功能下降时，肾脏促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）生成减少及血浆中一些毒性物质干扰红细胞生成并缩短其寿命而导致的贫血，其加速了CKD的进程，大大提升了患者的死亡风险[3]。肾性贫血的发病机制复杂，包括铁代谢紊乱、EPO缺乏和慢性炎症等。目前治疗肾性贫血的药物主要包括红细胞生成刺激剂（erythropoiesis-stimulating agent，ESAs）、铁剂和低氧诱导因子脯氨酰羟化酶抑制剂。但高剂量的ESAs会导致心脑血管和癫痫等疾病[4-5]；长期使用铁剂存在依从性较差、胃肠道反应发生率高等问题[6-7]；低氧诱导因子脯氨酰羟化酶抑制剂会引起心血管事件、高钾血症和惊厥等不良反应，其安全性仍需要更多的临床数据验证。因此，目前仍需要寻找更安全有效的CKD肾性贫血治疗方案。

健脾益肾方由黄芪、白术、山药、酒苁蓉、豆蔻、丹参、大黄和炙甘草8味中药组成，该方进一步研制成由广东省药品监督管理局批准的医疗机构中药制剂。健脾益肾方在临床上用于治疗CKD及肾性贫血，疗效确切，能显著改善肾功能，有效降低患者血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血清肌酐（serum creatinine，Scr）的水平[8]。本课题组的前期研究表明，健脾益肾方可通过胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）介导的缺氧诱导因子-2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）诱导EPO的表达，促进红细胞的生成[9]。此外，本课题组还发现CKD大鼠存在铁循环功能障碍，Janus激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路可纠正CKD大鼠的肾性贫血症状，能显著改善其血常规参数 [10]。而JAK2/STAT3信号通路是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）下游的重要途径[11]。

本研究通过高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（high performance liquid chromatography  tandem triple quadrupole mass spectrometry，HPLC-QQQ-MS/MS）对健脾益肾方进行化学成分分析，并在上述化合物的基础上，通过网络药理学预测健脾益肾方治疗肾性贫血的潜在靶点、信号通路和核心成分。通过分子对接对预测的核心成分及靶点进行验证，随后采用腺嘌呤诱导的CKD大鼠模型验证健脾益肾方治疗肾性贫血的作用机制，阐明健脾益肾方治疗肾性贫血和CKD的科学内涵，为其临床应用提供依据，以更好地指导中医临床实践。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 主要仪器

8045 HPLC-QQQ-MS/MS液质联用仪（日本岛津公司）；A3S-10-10-CE型超纯水机（美国艾科浦）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山舒美公司）。

1.1.2 主要药品与试剂

健脾益肾方处方中各药味饮片由深圳市中医院药房提供，黄芪饮片（至信药业，批 号：240201）、白术饮片（慧达康药业，批号：240301Z）、山药饮片（至信药业，批 号：240102）、酒苁蓉饮片（永刚药业，批 号：A231207）、豆蔻饮片（富兴通药业，批号：230601）、丹参饮片（永刚药业，批 号：A231221）、大黄饮片（永刚药业，批号：A231128）和炙甘草饮片（永刚药业，批 号：A240109）；对照品毛蕊异黄酮（批号：wkq19011810，纯度≥98%）、丹参酮Ⅱ A（批 号：wkq16022805，纯度≥98%）、丹酚酸A（批 号：WP23050409，纯度≥98%）、迷迭香酸（批 号：WP23020112，纯度≥98%）、黄芪甲苷（批 号：wkq16042601，纯度≥98%）、芒柄花素（批号：wkq19013002，纯度≥98%）、甘草苷（批号：wkq16071504，纯度≥98%）、甘草酸（批号：wkq18011803，纯度≥98%）购自四川维克奇生物科技有限公司；对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批 号：111920-201606，纯度97.6%）、毛蕊花糖苷（批 号：111530-201914，纯度95.2%）、大黄酸（批号：110757-201607，纯度99.3%）购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈（色谱级）、甲酸（质谱级）购自德国默克公司；实验用水为超纯水，其余试剂均为分析纯；ELISA试剂盒（上海江莱生物，批号：JL15743）。

1.1.3 动物

SPF级6~8周龄雄性SD大鼠18只，体重190~210 g，由广东维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2022-0063，实验动物质量合格证号：44829700002038，本研究已获中科产业控股（深圳）有限公司动物实验伦理委员会批准（伦理审批号：20220081）。

1.1.4 数据库名称及网址

本文所用到的数据库名称及网址见表1。

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  表格1 数据库名称及网址

  Table 1.Database name and web address

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1.2 方法

1.2.1 健脾益肾方化学成分表征

①供试品溶液制备。取黄芪300 g、白术100  g、山药300 g、酒苁蓉100 g、豆蔻100 g、丹参150  g、大黄100 g、甘草60 g，加入8倍量的水，煮2次，每次1 h，合并煎液，浓缩成1 g/ mL（以生药材计）的溶液，通过喷雾干燥制备成粉末。将健脾益肾粉末置于-80 ℃冰箱储存，使用时加入超纯水溶解，超声10 min，涡旋1 min，离心取上清液。取健脾益肾粉末0.55 g，置于离心管中，加入甲醇50 mL，超声提取30 min，离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，即得。

②色谱条件。色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD（150 mm×4.6 mm, 3 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（为0~20 min，28%~40% A；20~25 min，40%~70% A；25~26 min，70%~90% A；26~36  min，90% A；36~37 min，90%~28% A）；柱温为35 ℃；流速为0.40  mL/min；进样体积为5 μL[12]。

③质谱条件。质谱采用电喷雾离子源；多反应监测模式；正负离子同时检测；检测器电压1.74  kV；离子源温度300 ℃；离子源电压4.0  kV；雾化气流量3.0 L/min；干燥气流量10.0  L/min；加热气流量10.0 L/min。

1.2.2 网络药理学分析

①靶点预测及标准化。借助TCMIP v2.0和Swiss Target Prediction 对质谱鉴定的化学成分进行靶点预测。采用OMIM、Genecards和DisGeNET平台，以“CKD anemia”“Renal anemia”为关键词，筛选疾病靶点。将得到的药物成分靶点和疾病靶点名称通过Uniport 数据库使其标准化为基因名。

②交集靶点的筛选。利用Draw Venn Diagram将成分与疾病的靶点取交集，并绘制韦恩图，得到健脾益肾方与肾性贫血的交集靶点，并筛选出交集靶点对应的交集成分。

③GO分析和KEGG。将健脾益肾方与肾性贫血的交集靶点导入DAVID数据库，进行GO功能注释和KEGG通路分析，采用微生信在线数据分析平台对结果进行可视化，结果分别以柱状图和气泡图形式呈现。

④“交集靶点-交集成分-通路”相互作用网络构建。选取上述筛选得到的交集靶点、交集成分和KEGG 富集的前20条通路，采用CytoScape 3.8.0软件构建“交集靶点-交集成分-通路”相互作用网络，并进行拓扑分析，设置靶点大小与度（degree）值成正比。在网络图中，“节点”分别代表交集靶点、交集成分、通路。“边”表示上述节点之间的关系。根据degree值的大小，筛选核心靶点和核心成分。

1.2.3 分子对接验证

基于“交集成分-交集靶点-通路”相互作用网络，选取网络中degree值排名前5的核心靶点与核心成分进行分子对接验证。分别在PDB 数据库、PubChem 数据库下载核心靶点的蛋白晶体结构和核心成分的3D结构，将其分别导入CB-Dock2平台进行分析处理，并使用PyMol 2.4软件进行可视化分析。

1.2.4 实验验证

将SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和给药组，每组6只。正常对照组：不进行干预处理；模型组：使用含0.75%腺嘌呤的饲料喂养大鼠4周，以建立腺嘌呤诱导的CKD模型；给药组：用含0.75%腺嘌呤的饲料喂养4周，第3周起开始以灌胃的方式给予健脾益肾方（3.92 g/kg）进行干预[10, 13]。给药结束后，使用20%乌拉坦溶液对大鼠进行麻醉，通过腹主动脉取血，收集血液用于血常规分析和ELISA检测，同时摘取大鼠的肾脏。大鼠肾脏组织在10%中性福尔马林溶液中固定48 h后，经过常规脱水和石蜡包埋，切片后进行Masson和PAS染色。

根据网络药理学预测的核心靶点及分子对接的情况，结合文献检索，使用ELISA试剂盒检测大鼠血清的EGFR的表达。往预先包被有大鼠EGFR抗体的微孔中，依次加入待测样品或不同浓度标准品，随后向各孔内添加生物素标记的检测抗体及HRP酶结合物，经过温育和洗涤后，使用TMB作为底物进行显色反应，利用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，计算样品浓度。

2 结果

2.1 化合物的鉴定

本研究利用HPLC-QQQ-MS/MS技术，采用正、负离子扫描模式采集数据，总离子色谱图见图１，通过高分辨质谱数据分析、结合课题组前期研究 [12]对健脾益肾方成分进行快速、全面的定性分析，初步鉴定出健脾益肾方中11种化学成分。

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  图1 健脾益肾方总离子色谱图

  Figure 1.Total ion chromatography of Jianpi Yishen formula

  注：1. 毛蕊花糖苷；2. 毛蕊异黄酮葡萄糖苷；3. 甘草苷；4. 迷迭香酸；5. 丹酚酸A；6. 毛蕊异黄酮；7. 芒柄花素；8. 黄芪甲苷；9. 甘草酸；10. 大黄酸；11. 丹参酮ⅡA。

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2.2 网络药理学分析

2.2.1 健脾益肾方化学成分治疗肾性贫血交集靶点

本研究通过数据库筛选共获得健脾益肾方化学成分相关靶点475个，肾性贫血相关靶点866个。将健脾益肾方化学成分作用靶点和肾性贫血相关靶点导入Draw Venn Diagram在线作图网站绘制韦恩图，筛选出健脾益肾方治疗肾性贫血靶点81个（图2）。

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  图2 健脾益肾方成分与肾性贫血交集靶点的韦恩图

  Figure 2.Venn diagram of intersection targets of Jianpi Yishen formula constituents and renal anemia

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2.2.2 GO功能分析

应用DAVID数据库对健脾益肾方治疗肾性贫血的交集靶点进行GO富集分析，借助微生信在线数据分析平台对结果可视化。结果显示，健脾益肾方在治疗肾性贫血的生物过程（biological process，BP）中主要富集到基因表达的负调控、凋亡过程的负调控、对异物的反应、磷酸化、对脂多糖的反应等；细胞组分（cellular component，CC）富集到质膜、细胞质基质、细胞外外泌体、细胞外空间、细胞外区等；分子功能（molecular function，MF）主要富集于相同蛋白质结合、ATP结合、蛋白质同源二聚化活性、蛋白激酶活性、酶结合等生物学过程（图3）。

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  图3 交集靶点的GO功能富集分析

  Figure 3.Analysis of GO function enrichment of intersection targets

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2.2.3 KEGG信号通路富集分析

对上述交集靶点的KEGG通路富集分析如图4所示。其中81个交集靶点主要与EGFR、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） /蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、糖基化终产物（advanced glycation end products，AGE）/糖基化终产物受体（receptor for AGE，RAGE）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）等多条信号通路相关。

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  图4 交集靶点的KEGG富集分析

  Figure 4.Analysis of KEGG pathway enrichment of intersection targets

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2.2.4 “交集成分-交集靶点-通路”相互作用网络构建

“交集成分-交集靶点-通路”相互作用网络如图5所示。网络共包含111个节点（81个核心靶点，10个核心成分，前20条KEGG通路）和456条边。

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  图5 “交集成分-交集靶点-通路”网络图

  Figure 5."Core components-key targets-significant pathways" connection network

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其中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、磷酸肌醇-3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）、EGFR、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma-2，BCL2）、V-Ha-Ras肉瘤病毒癌基因同源物（harvey rat sarcoma viral oncogene homolog，HRAS）等靶点蛋白相互作用频率高。“交集成分-交集靶点-通路”网络中degree值排名前5的核心成分包括：丹酚酸A、迷迭香酸、大黄酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和毛蕊异黄酮。

2.3 分子对接结果

对“交集成分-交集靶点-通路”网络中degree值排名前5的核心成分丹酚酸A、迷迭香酸、大黄酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和毛蕊异黄酮与degree值排名前5的核心靶点AKT1、PIK3CA、EGFR、BCL2、HRAS进行25次对接。结合能 ＜-5  kcal/mol认为该成分与靶点具有良好的结合活性[13]，结合能越低，说明结合活性越好。如图6所示，核心成分与核心靶点均有较好的结合活性，提示网络药理预测的核心靶点及核心成分具有较高的可靠性。将结合活性最强的前6个成分靶点的对接结果利用PyMol 2.4进行可视化，如图7所示。

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  图6 分子对接评分热图

  Figure 6.Heatmap of the molecular docking score

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  图7 分子对接示意图

  Figure 7.Schematic representation of the molecular docking

  注：A. EGFR（8A27）-毛蕊异黄酮葡萄糖苷；B. EGFR（8A27）-迷迭香酸；C. EGFR（8A27）-丹酚酸A；D. HRAS（2CE2）-迷迭香酸；E. HRAS（2CE2）-丹酚酸A；F. PIK3CA（7L1C）-毛蕊异黄酮葡萄糖苷。

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2.4 实验验证

图8的PAS染色显示，与正常对照组相比，CKD大鼠肾脏表现出肾小球肥大、肾小管上皮细胞萎缩和脱落；与模型组相比，健脾益肾方给药组显著减轻肾脏损伤。Masson染色显示，CKD大鼠肾脏的纤维化面积较正常大鼠明显增大；与模型组相比，健脾益肾方给药组显著减少CKD大鼠肾脏的纤维化面积。以上结果表明，健脾益肾方对CKD大鼠具有肾保护作用。

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  图8 健脾益肾方对CKD大鼠肾脏损伤的影响

  Figure 8.Effects of Jianpi Yishen formula on kidney function in CDK rats

  注：A. PAS染色；B. Masson染色。

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此外，实验结果显示，与正常对照组相比，模型组显著降低血液中红细胞（red blood cell，RBC）、血红蛋白（hemoglobin，HGB）和红细胞压积（hematocrit，HCT）水平（P＜0.05），表明CKD大鼠具有贫血并发症；与模型组相比，健脾益肾方给药组明显提高CKD大鼠的红细胞、血红蛋白和红细胞压积水平（P＜0.01）（图9）。以上结果表明，健脾益肾方可纠正CKD大鼠贫血的状态。

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  图9 健脾益肾方对CKD大鼠贫血的影响（n=6）

  Figure 9.Effect of Jianpi Yishen formula on anemia in CKD rats (n=6)

  注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.01。

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根据分子对接的结果，结合查阅的相关文献，本研究选择EGFR核心靶点进行验证。结合说明书，采用试剂盒检测大鼠血清的EGFR（图10）。结果表明，与正常对照组相比，CKD大鼠的EGFR水平显著增加（P＜0.01），健脾益肾方给药组显著降低EGFR的表达（P＜0.05）。

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  图10 大鼠血清EGFR水平（n=6）

  Figure 10.Serum EGFR level in CKD rats (n=6)

  注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05。

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3 讨论

网络药理学是一个多学科研究体系，通过整合大量信息提出新的发现，融合了计算和实验方法。HPLC-QQQ-MS/MS与其他分析技术相比，具有灵敏度高、分辨率高、检测限低、分析快速等优点，能够对化合物进行高效地分离和筛选[14]，从而识别中药复杂体系中的各类成分及其化学结构。因此，本研究采用HPLC-QQQ-MS/MS对健脾益肾方的化学成分进行表征，将检测到的化合物用于网络药理学的分析，根据该成分的结构式检索对应的靶点，将传统的“单靶点、单个药”的研究模式转变为“多靶点、多组分”的研究模式，更好地适应中药方剂“多靶点、多通路、多环节”的特点，使结果更可靠、更有说服力。

健脾益肾方重用黄芪益气健脾、升阳固表为君；山药、白术健脾补肾，以助肾脏气化为臣；酒苁蓉温肾扶阳、润肠通便，豆蔻温中化湿行气共为佐药，助膀胱气化，利水消肿；丹参、大黄活血祛瘀为使，可开启脾胃升降之枢，通腑泻浊，清解血分之毒；炙甘草调和诸药。诸药合用，攻补兼施，共奏健脾益肾、活血化浊之功，用于脾肾气虚，兼有湿浊、水气和瘀毒。研究表明，黄芪的黄酮类成分具有保肝、调节免疫系统、抗炎、抗感染、抗心肌缺血和消除自由基等药理作用[15]；从黄芪中提取的毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素和芒柄花苷的新型组合，可以激活EPO转录的调节因子并缓解环磷酰胺诱导的贫血[16]；崔运浩发现黄芪甲苷、毛蕊异黄酮及其配伍能上调EPO的表达，促进化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞的增殖[17]；毛蕊异黄酮和丹参酮Ⅱ A配伍具有促血管生成的作用，可提高缺血损伤肾小球内皮细胞的迁移能力[18]。白术能改善CKD大鼠的骨骼肌萎缩，减轻氧化应激和自噬[19]。研究发现，大黄酸能改善微循环，降低机体的内毒素水平，减少炎性细胞因子的产生[20]。迷迭香酸通过提高氧化酶活性、增强清除自由基能力等发挥抗心肌缺血损伤的作用[21]；小鼠腹腔注射迷迭香酸可减轻脑缺血再灌注损伤[22]。丹参已被广泛用于治疗心血管疾病[23-24]，其中丹参素具有改善心血管功能的作用[25]；丹酚酸Ａ、丹参酮Ⅰ以及两者联合具有促进缺血下肢血管正常化、降低血管渗漏、增强血管灌注等作用[26]；丹酚酸A可通过抗氧化作用延缓慢性肾衰竭大鼠肾损伤[27]。

临床研究发现，健脾益肾方不仅能显著改善慢性肾功能衰竭营养不良患者的营养状况，且在口服氯沙坦基础上加服健脾益肾方比单服氯沙坦的疗效更为显著，能明显降低Scr及BUN的水平[8]；杨曙东等[28]发现，健脾益肾方能显著提高慢性肾功能衰竭营养不良患者血清中的血清白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白、血清胆固醇浓度，缓解临床症状。实验方面，Liu等[13, 29]发现，健脾益肾方可通过调节色氨酸代谢和芳基烃受体信号通路改善肾功能损伤和纤维化以及通过激活SIRT3、调节线粒体动力学和抗氧化作用增强培哚普利对CKD的抑制作用。此外，有研究表明健脾益肾方可通过抑制炎症反应和细胞凋亡，缓解核因子E2相关因子2信号通路激活所介导的肾氧化损伤[30]。

肾性贫血作为CKD的严重并发症之一，本课题组前期研究表明，健脾益肾方具有双向免疫调节作用，在不同条件下可调节RAW 264.7细胞的促炎细胞因子水平及通过激活HEK293T细胞内人表皮生长因子受体介导的转录活性，促进EPO的表达，具备一定的造血功能[31]；此外，本研究发现CKD大鼠存在铁循环功能障碍，健脾益肾方可通过抑制JAK2/STAT3信号通路，改善铁代谢紊乱，从而治疗CKD和肾性贫血[10]。而JAK2/STAT3信号通路是EGFR下游的重要途径。本研究表明，健脾益肾方能显著降低肾性贫血大鼠EGFR的表达，与课题组前期研究的改善铁代谢紊乱的作用机制相契合，表明健脾益肾方通过抑制EGFR诱导的JAK2/STAT3通路，降低铁调素的表达，促进铁的动员和利用，有利于血红蛋白的合成，为健脾益肾方在临床上的应用提供了科学依据。

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