目的  建立复方锌铁钙口服溶液中维生素B₂有关物质测定方法。

方法  色谱柱为Ultimate XB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为1%磷酸溶液（三乙胺调pH至3.5）-乙腈，梯度洗脱，检测波长为260 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为20 μL。

结果  该法对维生素B₂及其降解杂质光色素、光黄素均能有效分离；维生素B₂、光黄素与光色素的线性范围分别为0.119~3.594 μg/mL（r=1.000 0）、0.115~3.479 μg/mL（r=1.000  0）、0.114~3.435 μg/mL（r=0.999 9），光黄素和光色素的校正因子分别为0.7与1.0。

结论  该法专属性强、操作简便、灵敏度高、重复性好，能有效测定复方锌铁钙口服溶液中维生素B₂的降解杂质，为提升药品质量、降低用药风险提供技术支撑。

复方锌铁钙口服溶液为复方制剂，其组分为葡萄糖酸钙400 mg、葡萄糖酸亚铁100 mg、葡萄糖酸锌30 mg、维生素B₂ 3 mg，是我国特有品种，适用于骨质疏松等钙缺乏症、生长发育迟缓等锌缺乏证、妊娠、儿童发育期等引起的缺铁性贫血、口角炎等维生素B₂缺乏引起的疾病。该药受众广泛，孕妇、儿童与老年人特殊人群为主要用药群体，由于其生理机能的特殊性，药品中的毒性杂质即可能引发不良反应，危害健康，故更需严格控制其药品质量，以保障用药安全。目前国内有2家复方锌铁钙口服溶液的生产企业（A企业和B企业）。本课题组在日常检验工作中，多次发现复方锌铁钙口服溶液中维生素B₂含量偏低，进一步研究其稳定性，发现维生素B₂含量在有效期内可降低7%，其降解杂质存在安全隐患。经查询相关文献，维生素B₂具有光降解特性，降解杂质为光黄素与光色素[1-5]，但迄今关于光黄素与光色素化合物的研究报道较少。有研究采用ADMET Predictor软件预测其毒理性质，结果光黄素与光色素均具生殖毒性、肝脏毒性与致染色体变异可能性。根据A企业和B企业注册标准[6-7]考察本品中维生素B₂有关物质，结果仅B企业标准控制了有关物质，但采用其有关物质测定法检测时阴性样品产生的色谱峰较多，干扰维生素B₂降解杂质的检测，可操作性较差。经查询国内外药典，维生素B₂原料药《中国药典》[8]、欧洲药典（European Pharmacopoeia，EP）[9]和英国药典（British Pharmacopoeia，BP）[10]均控制了有关物质，《中国药典》未控制特定杂质，EP与BP控制的4个特定杂质中包括限度为0.025%的光黄素和限度为0.2%的光色素。采用现行药典维生素B₂原料药的色谱条件考察本品中维生素B₂的有关物质，光黄素与光色素的检测均存在干扰，不能有效控制本品中维生素B₂的有关物质含量，存在安全隐患。

为了进一步保障用药安全、降低用药风险，迫切需要建立有效测定本品中维生素B₂有关物质的方法。在多组分存在干扰的情况下，本文通过改进有关物质检测条件，建立一种操作简便、专属性强、灵敏度高的检测复方锌铁钙口服溶液中维生素B₂降解杂质光黄素与光色素含量的方法。

1 材料

1.1 主要仪器

LC-20AT高效液相色谱仪，包括LC LabSolutions工作站和DAD检测器（日本岛津公司）；XP205十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Version 10.4.0.5 ADMET PredictorTM软件（Simulations Plus, Inc.，USA）。

1.2 主要药品与试剂

对照品光黄素（批号：1-NVG-118-2，纯度95.14%）、光色素（批号：3VQ8G-BJ，纯度99.9%）、维生素B₂（批号：100369-201504，纯度98.2%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

复方锌铁钙口服溶液，规格：10 mL，A公司4批（批号：170301、190701、190705、190707），B公司6批（批号：151016、160519、160520、180501、180709、190603）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Ultimate XB-C₁₈柱（250 mm× 4.6  mm，5 μm），流动相为0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH至3.5）（A）-乙腈（B），梯度洗脱（梯度洗脱程序见表1），检测波长为260 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为20 μL。

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  表格1 梯度洗脱程序

  Table 1.The program of gradient elution

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2.2 溶液的配制

2.2.1 供试品溶液

取本品用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照溶液

精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 对照品溶液

精密称取维生素B₂对照品30.50 mg，置100  mL量瓶中，加稀盐酸5 mL使溶解，用水稀释至刻度，得维生素B₂对照品贮备液；精密称光黄素对照品7.62 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得光黄素对照品贮备液，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，得光黄素定位溶液；精密称取光色素对照品14.33  mg，置50 mL量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，得光色素对照品贮备液，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，得光色素定位溶液。

2.2.4 阴性样品溶液

分别按A企业和B企业的处方工艺制备缺维生素B₂的阴性样品，并按“2.2.1”项下方法制得阴性样品溶液。

2.2.5 系统适用性溶液

系统适用性溶液1：取维生素B₂对照品30  mg，置敞口器皿中，加0.5 mol/L氢氧化钠溶液1 mL使溶解，光照4 h，加冰醋酸0.5 mL，转移至100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

系统适用性溶液2：取系统适用性溶液1与A企业样品溶液等体积混合，摇匀，即得。

2.3 方法学验证

2.3.1 系统适用性试验

精密吸取系统适用性溶液2、阴性样品溶液、供试品溶液、对照溶液与各对照品定位溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，HPLC色谱图见图1。结果显示阴性样品溶液对主峰及所检杂质峰无干扰，系统适用性溶液2中维生素B₂、光黄素、苯甲酸钠（A企业防腐剂）与光色素依次出峰，保留时间分别为15.086、21.363、25.585、28.652 min，光黄素、光色素与相邻峰的分离度分别为1.9和4.0，均满足《中国药典》的要求。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatogram

  注：A. 系统适用性溶液2；B. A企业阴性样品溶液；C. B企业阴性样品溶液；D. A企业供试品溶液；E. B企业供试品溶液；F. 对照溶液；G. 光黄素对照品溶液；H. 光色素对照品溶液；1. 光黄素；2. 光色素。

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2.3.2 破坏试验

取同一批复方锌铁钙口服溶液（A企业，批号：190701）内容物适量，滤过，作为未破坏溶液；取内容物5 mL，加盐酸溶液（1→2）1  mL，60  ℃水浴加热2 h，滤过，作为酸破坏溶液；取内容物10 mL，用2 mol/L氢氧化钠溶液调至中性后继续加入2 mL，40 ℃水浴加热2  h，加冰醋酸0.5  mL，滤过，作为碱破坏溶液；取内容物10  mL加10%双氧水2 mL，室温放置2  h，滤过，作为氧化破坏溶液；取内容物10  mL，置60  ℃水浴加热2  h，摇匀，滤过，作为高温破坏溶液；取内容物10  mL，置敞口器皿中光照（4 500 Lx±500 Lx）4 h，滤过，作为光照破坏溶液。

将上述6份溶液按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图2），结果表明在光照破坏情况下光色素明显增加；各强制破坏条件下主峰与相邻峰、光黄素和光色素与相邻杂质峰均有可效分离。

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  图2 破坏试验HPLC色谱图

  Figure 2.HPLC chromatogram of degradation test

  注：A. 未破坏；B. 酸破坏；C. 碱破坏；D. 氧化破坏；E.高温破坏；F. 光照破坏；1. 光黄素；2. 光色素。

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2.3.3 线性关系考察和校正因子

分别精密量取维生素B₂贮备液、光黄素贮备液和光色素贮备液各2 mL，置同一100 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为线性贮备液；精密量取线性贮备液1 mL和3 mL分别置于50  mL量瓶中，作为线性1号和2号溶液；精密量取线性贮备液2、4、6 mL分别置于10 mL量瓶中，作为线性3~5号溶液。分别精密量取线性 1~5号溶液按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，并计算线性回归方程与校正因子，维生素B₂回归方程斜率与杂质回归方程斜率的比值即为校正因子，结果见表2。结果表明，各组分在一定浓度范围内与峰面积之间线性关系良好。

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  表格2 各组分的线性回归方程、相关系数及线性范围

  Table 2.The linear regression equations, correlation coefficients, and linear ranges of each component

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2.3.4 定量限与检测限

取光黄素和光色素对照品溶液进行逐级稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比约为10 ∶ 1时的溶液浓度作为定量限，计算得光黄素和光色素的定量限分别为46、80  ng/ mL；以信噪比约为3 ∶ 1时的溶液浓度作为检测限，计算得光黄素与光色素检测限分别为17、26 ng/mL。

2.3.5 精密度试验

精密量取供试品溶液（A企业，批号：160520）20 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算得光色素峰面积的RSD为0.32%（n=6），光黄素均未检出，表明该仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验

取同一样品（A企业，批号：160520），按“2.2”项下方法平行配制6份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，按加校正因子自身对照法计算光黄素与光色素的含量，结果光黄素均未检出，光色素平均含量为2.8%，RSD为0.68%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验

取室温避光保存的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得维生素B₂和光色素峰面积的RSD分别为0.64%、0.35%（n=7），表明供试品溶液在室温避光条件下24 h内稳定性良好。

2.3.8 耐用性试验

考察不同色谱仪、色谱柱、柱温、流速等色谱条件的影响，分别取样品溶液与对照溶液按“2.1”项下色谱条件下进样测定，结果见表3。结果表明光黄素与光色素与相邻杂质峰的分离度均符合要求，表明方法耐用性良好。

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  表格3 耐用性试验结果表

  Table 3.Results of durability test

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2.4 样品测定

分别取A企业和B企业共10批复方锌铁钙口服溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液和对照溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，按加校正因子自身对照法计算光黄素和光色素的含量，结果见表4。根据样品测定结果，参考《中国药典（2020年版）》四部[8]维生素B₂片有关物质单杂限度，建议控制光色素限度为1.5%。

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  表格4 样品测定结果表（%）

  Table 4.Determination results of the samples (%)

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3 讨论

3.1 色谱条件的优化

在现行药典与文献[11]基础上，通过优化HPLC流动相pH与检测波长，解决了复方锌铁钙口服溶液中维生素B₂降解杂质光黄素与光色素的分离、检测问题。流动相筛选：以0.05%、0.1%、0.2%磷酸溶液为水相，分别用三乙胺调节pH至4.5、4.0、3.5、3.0进行梯度洗脱。结果表明，0.1%磷酸溶液（pH 3.5）-乙腈进行梯度洗脱，系统适用性溶液2中光黄素与光色素峰形对称，与相邻峰分离度均大于1.5。检测波长选择：光黄素与光色素在265 nm/222 nm、260 nm/219 nm处分别有最大吸收。结合杂质的光谱行为与样品测定结果，选取光色素最大吸收波长260 nm为检测波长，以保障杂质检测灵敏度。

3.2 潜在风险需重视

尽管现行标准[8, 12]与文献[13]尚未对葡萄糖酸亚铁中的紫外吸收杂质提出明确控制要求，但本研究发现此类杂质的存在可能隐含潜在风险。通过考察原辅料，发现对阴性样品中3~4 min处色谱峰主要来源于葡萄糖酸亚铁原料药，推测其与合成工艺中副产物或未完全除尽的中间体相关，不同厂家/批次原料药中该杂质响应值差异显著，提示现有生产工艺稳定性不足。建议企业将紫外吸收杂质纳入葡萄糖酸亚铁原料药质量研究项目，并通过优化结晶纯化步骤或订入中间体质控指标，降低终制剂质量风险。

3.3 小结

本文建立测定复方锌铁钙口服溶液有关物质的HPLC方法，解决了复方制剂中维生素B₂降解产物的检测难题，具有高专属性、灵敏度和实用性，为药品全生命周期质量控制提供了关键技术支撑。

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