目的  利用网络药理学和生物信息学方法及分子对接和分子动力学模拟技术探讨丹参抗非小细胞肺癌的作用机制。

方法  通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选丹参主要活性成分，利用SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库对活性成分进行靶标预测，利用GeneCards、DisGeNET和在线人类孟德遗传（OMIM）数据库获得肺癌相关靶点，取二者交集为丹参-肺癌靶点。在癌症基因组图谱数据库-肺腺癌&肺鳞癌（TCGA-LUAD&LUSC）以及GSE159857数据集中作差异分析获得公共的差异表达基因，与丹参-肺癌靶点取交集后鉴定出丹参抗非小细胞肺癌的核心靶点。对核心靶点进行GO和KEGG富集分析探究其参与的生物学过程和信号通路，用STRING数据库和Cytoscape 3.10.0软件构建核心靶点的互作网络。利用AutoDock Tools 1.5.6和AutoDock Vina 1.2.0软件对核心靶点进行分子对接验证，最后采用Gromacs 2022.4软件对分子对接复合物进行分子动力学模拟分析。

结果  本研究中筛选出26种丹参活性成分，并鉴定了61个丹参作用非小细胞肺癌的核心靶点。丹参活性成分通过细胞周期调控、细胞外基质重塑、氧化应激反应和代谢重编程等生物学过程以及p53、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）、单磷酸腺苷激活的蛋白激酶 （AMPK）和核因子κB（NF-κB）等信号通路治疗非小细胞肺癌，通过直接靶向细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）4、极光激酶B（AURKB）、Polo样激酶1（PLK1）、CDK1和胸苷酸合成酶（TYMS）抑制非小细胞肺癌恶性进展。其中丹参酮IIA与CDK4的结合能最强，二者之间能够形成稳定的复合物。

结论  丹参通过调控多种生物学过程、多条信号通路和多个靶点协同作用，对非小细胞肺癌产生治疗效果。

肺癌是我国乃至全球范围内最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）为最常见的病理类型，约占所有肺癌病例的80%~85%[1]。尽管近年来通过手术、化疗、放疗及靶向治疗等手段取得了一定的临床治疗进展，但由于其早期无明显症状，导致大多数患者在诊断时已处于晚期，因此NSCLC的治疗依然充满挑战。即使是靶向治疗和免疫治疗等新型治疗手段，也由于肿瘤异质性、药物耐受性、毒副作用以及免疫逃逸等问题，表现出有限的治疗效果[2]。因此，探索新的、有效的治疗策略提高患者的生存率和生活质量，是当前肺癌研究的重点。

丹参（Salvia miltiorrhiza）作为一种传统的中草药，在中医中广泛用于活血化瘀、改善血液循环等[3]。近年来的研究表明，丹参具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗血管生成等多重生物活性，尤其在心血管疾病和肿瘤治疗中展现出巨大的潜力。目前，丹参已在心血管疾病治疗领域被广泛应用并取得了良好的临床效果[4]。丹参及其主要活性成分如脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹参酚酸类，已被证实对多种恶性肿瘤具有抑制作用 [5]。其强大的抗癌效应体现在多个方面，例如，在肝细胞癌、前列腺癌、结直肠癌和NSCLC中，丹参能够显著抑制肿瘤细胞的体外增殖并诱导细胞凋亡，同时遏制了体内肿瘤的生长[6-9]；此外，丹参在对抗包括肺癌在内的部分肿瘤的侵袭、转移以及血管形成方面表现出良好的潜力[10-13]。在一项Lewis肺癌小鼠模型的研究中，丹参酮IIA与5-氟尿嘧啶联用增加了肿瘤组织中CD4+T淋巴细胞和自然杀伤细胞的比例和活性，表明丹参活性成分尚具有一定的免疫激活功能[14]。然而，丹参在抗NSCLC中的具体作用机制尚未完全阐明，亟需通过现代科学技术手段对其抗癌作用进行系统的研究。

因此，本文利用网络药理学方法和数据挖掘在NSCLC中构建了丹参成分-靶点-通路网络，并进一步通过分子对接和分子动力学模拟验证丹参主要活性成分与相关靶点的结合模式及其可能的生物学作用。基于网络药理学和生物信息学方法以及分子对接和分子动力学模拟技术，期望从全局和分子水平深入探讨丹参治疗NSCLC的可能机制，为丹参抗NSCLC从基础研究向临床应用的转化提供理论依据，同时为开发新的肺癌治疗策略提供参考。

1 资料与方法

1.1 丹参活性成分及靶点的筛选

使用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）筛选丹参的主要活性成分，该数据库收录了大量中药成分及其药理数据。通过查询“丹参”相关的成分，筛选出在TCMSP数据库中记录的所有化学成分，并根据药理数据进一步筛选。选定的化学成分需满足口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和药动学参数类药性（drug like，DL）≥0.18。去除TCMSP数据库中无PubChem ID以及无名称的结构式，并按照SwissADME中“druglike=high”的标准，最终得出26个活性成分。使用SwissTargetPrediCtion数据库进行靶点预测，该数据库采用基于结构相似性和机器学习的算法，预测小分子化合物的可能靶标。通过上传TCMSP数据库中下载的丹参活性成分的SMILES（Simplified Molecular Input Line Entry System）结构式或分子文件，获得相应的预测靶点列表。PharmMapper数据库采用基于分子对接的虚拟筛选方法，预测化合物与生物靶标之间的结合亲和力。将TCMSP中下载的活性成分SMILES文件提交至PharmMapper数据库，预测活性成分对应的靶点。进一步结合SwissTargetPrediction获得的靶点，得到详细的靶点信息。

1.2 NSCLC转录组测序数据来源与差异表达分析

从癌症基因组图谱数据库（the Cancer Genome Atlas Program，TCGA）下载肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）转录组测序数据集，从基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）获取包含30对配对的NSCLC肿瘤和癌旁组织的转录组测序数据集GSE（Gene Expression Omnibus）159857。使用R语言“DESeq2”包对TCGA-LUAD&LUSC和GSE 159857数据集的癌和癌旁进行差异表达分析，根据TCGA项目差异分析并结合分析结果中差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的数量，本研究阈值设置为log2（Fold Change）的绝对值＞1且错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05选取DEGs。

1.3 功能富集分析

GO分析用于探究丹参活性成分作用NSCLC的核心靶点在生物学过程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellular component，CC）方面的富集情况，KEGG富集分析用于探索核心靶点参与的相关通路，二者均使用R语言的“clusterProfiler”包完成。以校正后P值对结果进行排序（P值校正方法pAdjustMethod选择参数“BH”），取前20个最具统计学意义的条目用气泡图进行可视化。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与分析

使用STRING数据库对核心靶点进行初步分析后输出TSV格式结果文件，将结果导入到Cytoscape 3.10.0软件作进一步分析并制靶点网络图。首先利用软件中NetworkAnalysis工具，根据度（degree）值排序，并绘制成核心靶点网络图；其次，利用软件中的MCODE（Molecular Complex Detection）插件识别靶点网络中的功能模块，进而鉴定出几个具有代表性的子网络。

1.5 药物-靶点分子对接

相关靶点蛋白（受体）由蛋白结构数据库（Protein Data Bank，PDB）下载得到蛋白3D结构文件，使用PyMOL 2.5.4软件检查蛋白质结构以备对接所用。活性成分（配体）3D结构文件由PubChem数据库获取并使用OpenBabel 3.1.1软件的MMFF（Merk Molecular Force）94力场对配体结构进行优化，最终获得能量最低状态的最优分子结构。使用AutoDock Tools 1.5.6对受体进行氢化处理，对配体进行氢化和柔性化的处理。使用Grid板块设置分子对接范围参数，设定对接方式为半柔性对接，对接精度Exhaustiveness为25，对接算法为拉马克遗传算法。运行AutoDock Vina 1.2.0软件进行分子对接，得到对接结合自由能以及对接结果文件。

1.6 分子动力学模拟

使用Gromacs 2022.4软件对CDK4蛋白与丹参酮IIA复合物进行分子动力学模拟。选择Amber14sb为蛋白力场，GAFF（General Amber Force Field）2为配体力场，选用TIP4P水模型对蛋白质配体体系添加溶剂并建立周期性边界为1.2 nm的水盒，粒子网格方法被用于计算长程静电相互作用，使用蒙特卡罗离子放置法引入适当数量钠离子和氯离子以中和整个系统的电荷。在正式模拟之前通过执行以下3步进行系统能量最小化和平衡：①使用50 000步的最速下降算法实现每个系统的能量最小化。②保持恒定的粒子数、体积和温度（310 K），对每个系统进行步长为2 fs的50 000步预平衡。③ 保持恒定的粒子数、压力（1个大气压）和温度（310 K），对整个体系进行步长为2 fs的50  000步预平衡。在系统能量最小化和平衡后，在无任何约束的情况下以步长为2 fs的时间进行100 ns的分子动力学模拟，同时每10  ps对结构坐标进行一次保存。最终分析了复合物的分子动力学模拟轨迹中的均方根偏差、均方根波动、回转半径、溶剂可及表面积以及复合物中蛋白质与配体之间相对自由能能量分布、氢键数目和0、25、50、75、100 ns 5个时刻的复合物结构对比，此外利用分子力学/广义玻尔兹曼表面积方法计算蛋白质与配体之间的平均结合自由能。

2 结果

2.1 丹参活性成分的筛选及丹参-肺癌靶点预测

在TCMSP数据库中按照OB≥30%和DL≥0.18的标准筛选出了26个丹参的主要活性成分，其中包括异欧前胡素、去氢丹参酮IIA、丹参醇A、丹参醇B、隐丹参酮、丹参酮IIA等物质（表1）。利用SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库对26个活性成分进行靶标预测，共得到556个丹参靶点。在GeneCards、DisGeNET和在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库中预测并整合得到共7 057个肺癌相关的靶点，通过对丹参靶点和肺癌靶点取交集，初步获得了390个丹参-肺癌靶点（图1）。

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  表格1 丹参主要活性成分

  Table 1.The main active components of Salvia miltiorrhiza

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  图1 丹参活性成分的筛选及丹参-肺癌靶点预测

  Figure 1.Screening of active components of Salvia miltiorrhiza and prediction of Salvia miltiorrhiza -lung cancer targets

  注：A. 丹参活性成分与肺癌公共靶点展示；B. 丹参靶点与肺癌靶点取交集韦恩图。

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2.2 丹参作用NSCLC核心靶点的鉴定

为进一步鉴定丹参作用于NSCLC的核心靶点，分别在TCGA-LUAD&LUSC转录组测序数据集以及GEO数据集GSE159857中对癌和癌旁进行了差异表达分析。其中TCGA-LUAD&LUSC数据集获得DEGs 10 276个，GSE159857数据集中获得DEGs 2 749个，两组取交集共得到1  459个共同的DEGs（图2A~C）。将这1 459个共同DEGs与前面筛选出的390个丹参-肺癌靶点进行重合，最终鉴定出61个丹参-NSCLC核心靶点（图2D）。

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  图2 丹参作用NSCLC核心靶点的鉴定

  Figure 2.Identification of core targets of Salvia miltiorrhiza against NSCLC

  注：A、B. TCGA-LUAD&LUSC数据集和GSE159857数据集的差异表达分析（癌组织vs.癌旁组织）；C. TCGA-LUAD&LUSC和GSE159857数据集DEGs取交集韦恩图；D. 丹参-肺癌靶点与两个数据集公共差异基因取交集韦恩图。

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2.3 丹参活性成分-NSCLC靶点的富集分析

为了解这61个核心靶点的生物学功能，采用GO和KEGG富集分析对其进行了功能注释。气泡图中分别展示了GO和KEGG富集分析中P 值最有意义的前20个条目（图3）。从结果上来看，GO分析的生物学过程主要富集到一些与细胞周期调控、脂质代谢和细胞外基质重塑相关的通路，KEGG富集分析结果中除了细胞周期通路，还富集到多条已被证实的与NSCLC发生发展密切相关的通路，如p53、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等信号通路。

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  图3 丹参活性成分-NSCLC靶点的GO和KEGG富集分析

  Figure 3.GO and KEGG enrichment analysis of Salvia miltiorrhiza active components-NSCLC targets

  注：A~C. GO功能注释；D. KEGG通路富集。

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2.4 丹参活性成分-NSCLC靶点网络构建与分析

将丹参作用NSCLC的61个核心靶点导入到STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，得到如图所示的PPI网络（图4A）。随后将PPI网络信息导入到Cytoscape软件作进一步分析，并以degree值大小进行排序绘制靶点网络图，其中越靠近网络中心的位置degree值越大（图4B）。Cytoscape软件中的MCODE插件是一种用于识别网络中功能相关模块的工具，适用于从生物学网络中发现密切相互作用的基因、蛋白质或其他生物学实体的子网络。这些子网络可能表示具有共同功能的基因或蛋白质群体，通常这些群体在生物学上是相关的，如参与相同的生物过程或在细胞中共同工作[15]。于是利用该插件对靶点网络作进一步分簇得到4个子网络，其分别代表了细胞周期调控、细胞外基质重构、氧化应激反应和代谢重编程相关的生物学过程（图4C~F），这与前面的富集分析结果具有一定的相似性。

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  图4 丹参活性成分-NSCLC靶点网络构建与分析

  Figure 4.Construction and analysis of Salvia miltiorrhiza active components-NSCLC targets network

  注：A、B. 丹参活性成分-NSCLC靶点的PPI网络（STRING数据库和Cytoscape软件）；C~F. 利用Cytoscape软件中MCODE插件对PPI网络作进一步分析得到4个关键子网络。

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2.5 药物-靶点分子对接

基于靶点网络的构建与分析结果，选取最重要的细胞周期调控相关子网络中的靶点与26种丹参活性成分作分子对接研究，对接结果通过热图进行可视化。如图所示（图5A），26种丹参活性成分普遍与周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）4具有强烈的结合亲和力，尤其是在NSCLC中有明确报道具有抗肿瘤作用的活性成分，如丹参酮IIA、丹参醇B和隐丹参酮等（当药物和靶点的结合能小于-5.0  kcal/mol时被认为结合活性良好）。此外，极光激酶B（aurora kinase B，AURKB）、Polo样激酶1（Polo-like kinase 1，PLK1）、CDK1和胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS）与丹参活性成分的结合亲和力也较强，表明其与CDK4均可作为丹参治疗NSCLC的关键靶点。使用PyMOL软件模拟了丹参酮IIA与关键靶点的对接模式图，其与CDK4、AURKB、PLK1、CDK1和TYMS的结合能分别为-11.1、-10.3、-10、-9.6、-9.8  kcal/ mol，结合方式依赖于多种非化学键相互作用，如氢键相互作用、烷基作用、π-Sigma共轭作用或π-π共轭作用（图5B~F）。

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  图5 丹参酮IIA与靶点蛋白的分子对接

  Figure 5.Molecular docking of Tanshinone IIA with target proteins

  注：A. 丹参活性成分与关键靶点的分子对接热图；B~F. 丹参酮IIA与CDK4、AURKB、PLK1、CDK1和TYMS蛋白的分子对接模式图。

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2.6 分子动力学模拟

由于分子对接采用的半柔性对接目前无法考虑蛋白质结构的柔性、温度、压力、溶剂效应等因素，因此为进一步证明化合物与蛋白质之间结合的程度与稳定性，本研究对丹参酮IIA与CDK4蛋白的复合物进行了100 ns的分子动力学模拟。

结果显示，CDK4蛋白与丹参酮IIA复合物的均方根偏差曲线波动范围全程均在1 nm以内，且经过5 ns的轻微波动后达到平稳，说明以均方根偏差角度分析CDK4蛋白与丹参酮IIA形成的复合物的稳定性高（图6A）。CDK4蛋白与丹参酮IIA复合物的均方根波动曲线波动在1  nm范围内，无较大波动，说明丹参酮IIA的加入对CDK4蛋白中氨基酸残基的稳定性影响甚微，形成的复合物稳定良好（图6B）。此外，CDK4蛋白与丹参酮IIA复合物的回转半径曲线波动在2.0 nm范围左右，全程平稳无较大波动，这表明CDK4蛋白与丹参酮IIA形成了紧密而稳定的复合物（图6C）。溶剂可及表面积是研究蛋白结构折叠与稳定性的因素之一，具有稳定结构的蛋白质往往具有更稳定的溶剂可及表面积曲线。图中CDK4蛋白与丹参酮IIA复合物的溶剂可及表面积曲线波动全程稳定，波动范围分别在140  nm²左右且无较大波动，说明复合物具有较好的稳定性（图6D）。同理，在自由能分布图中CDK4蛋白与丹参酮IIA复合物形成了单一的最小能量团簇，且能量团簇分布集中，说明CDK4蛋白与丹参酮IIA之间形成的复合物稳定性良好（图6F）。在复合物体系稳定后，本研究计算了CDK4蛋白与丹参酮IIA的结合自由能。图中可见CDK4蛋白与丹参酮IIA的平均结合自由能为-36.57  kcal/mol，说明CDK4蛋白与丹参酮IIA的结合程度强烈，进一步验证了分子对接结果（图6G）。

为了研究复合物结合位点的氢键性质，本研究计算了配体与蛋白之间起稳定作用的主要作用键氢键的数目。如图6E所示，CDK4与丹参酮IIA之间形成的氢键数量全程稳定在1个左右，氢键数量较少，由分子对接可视化结果可知，CDK4蛋白与丹参酮IIA之间主要以疏水相互作用（烷基作用、共轭作用）结合。

通过识别参与结合氨基酸残基的贡献度，研究发现，丹参酮IIA与CDK4蛋白中多个氨基酸残基形成相互结合，其中IILE-12、VAL-20、LEU- 147、PHE-93与丹参酮IIA形成了很好的结合，结合能分别为-2.35、-2.00、-1.82、- 1.66  kcal/ mol，说明在整个分子动力学模拟运动过程中IILE-12、VAL-20、LEU-147、PHE-93在丹参酮IIA与CDK4蛋白的结合中起主要作用（图6H）。同时与分子对接可视化结果中的氨基酸结合位点相对应，说明模拟前后丹参酮IIA与CDK4蛋白的结合位置未发生较大变化，复合物稳定性高。最后，研究对比了分子动力学模拟5个时刻复合物构象，丹参酮IIA在0、25、50、75、100 ns 5个时刻与CDK4蛋白的结合位置未发生较大变化，进一步证实了二者之间的结合稳定性（图6I）。

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  图6 丹参酮IIA与CDK4蛋白结合的分子动力学模拟

  Figure 6.Molecular dynamics simulation of Tanshinone IIA binding to CDK4 protein

  注：A~D. CDK4蛋白与丹参酮IIA复合物的均方根偏差、均方根波动、回转半径、溶剂可及表面积曲线；E. CDK4蛋白与丹参酮IIA复合物结合位点的氢键性质分析；F. CDK4蛋白与丹参酮IIA复合物的自由能分布图；G. CDK4蛋白与丹参酮IIA的平均结合自由能（VDWAALS、EEL、EGB、ESURF、GGAS、GSOLV、TOTAL分别代表范德华力、静电能、极性溶剂化能、非极性溶剂化能、分子力学项、溶剂化能项和平均结合自由能）；H. CDK4蛋白中参与丹参酮IIA结合的氨基酸残基能量贡献；I. 分子动力学模拟结果（0、25、50、75、100 ns 5个时刻的结构对比，图中红绿蓝黄橙分子结构分别对应5个时刻的丹参酮IIA小分子结构）。

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3 讨论

在现代医疗体系中，关于中草药相关成分治疗恶性肿瘤的应用可追溯到20世纪70年代，紫杉醇作为从紫杉树中提取的天然产物开始被纳入到临床治疗中，并逐渐成为治疗乳腺癌、卵巢癌等常见恶性肿瘤的核心药物之一[16-17]。此外，从长春花中提取出的一种生物碱被命名为长春新碱，目前已广泛用于治疗各种类型的白血病和淋巴瘤。近20年来，随着科学技术的进步，尤其是分子生物学、细胞生物学的发展，越来越多中草药成分的抗肿瘤机制通过现代医学手段得到了验证，包括青蒿素及其衍生物、黄芪多糖、雷公藤内酯醇以及丹参酮等成分[18]。肺癌作为世界第一大肿瘤，自然成为中草药活性成分抗肿瘤研究的重中之重。

丹参在中医临床中常被用于活血化瘀和改善血液循环治疗，近年来研究发现其在抗肿瘤方面也具有潜在的疗效。丹参酮和丹参酚酸是丹参中两类主要的活性成分，在抗肿瘤的机制上具有较大的重叠性，包括抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移以及血管生成，诱导肿瘤细胞凋亡，其特有的抗炎和抗氧化作用赋予其在增强恶性肿瘤放化疗敏感性的同时又显著降低了治疗引发的毒副反应 [4]。截至目前，丹参活性成分逆转肿瘤恶性进展和放化疗抵抗已在多个瘤种中被证实，其中不乏关于NSCLC的研究。有研究报道丹参酮I通过白细胞介素-8、Ras丝裂原活化蛋白激酶和Rac1信号通路在体内体外表现出抗NSCLC作用[19]。中山大学团队在A549肺癌模型中揭示了丹参酮IIA通过靶向血管内皮细胞生长因子受体2的蛋白激酶结构域遏制肿瘤血管生成[10]。丹参酮IIA和丹参酚酸A作为两种不同类型的丹参活性成分，二者均能够显著增强肺癌细胞对铂类化疗药的敏感性，且均是由磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路介导[20-21]。可见，丹参活性成分抗NSCLC效应体现在多个方面，其作用机制又相当复杂。因此本课题组基于网络药理学和生物信息学方法以及分子对接和分子动力学模拟技术，通过整合现有的药理学数据、分子靶点信息和网络分析，揭示了丹参可能通过多种生物学过程、多条信号通路和多靶点协同作用，对NSCLC产生治疗效果。

由功能富集分析和靶点网络构建得知，丹参活性成分作用NSCLC主要依赖于细胞周期调控、细胞外基质重塑、氧化应激反应和代谢重编程4个方面，其中一些与肿瘤恶性进展密切相关的信号通路（如p53、PARP、AMPK和NF-κB等）发挥了关键作用。细胞周期调控机制改变是肿瘤发生发展的核心机制之一，NSCLC细胞通常表现出细胞周期失调控，这种失调不仅导致肿瘤细胞的无限增殖，还使其对化疗和放疗的耐受性增加，是NSCLC治疗中的重要挑战[22]。研究发现，丹参酮IIA在A549细胞中通过下调细胞周期蛋白（cyclin）D1使细胞周期阻滞于G0/G1期[23]。细胞外基质不仅为细胞提供支持，还在细胞信号传导、增殖和迁移中起着重要作用，NSCLC的发生和发展常常伴随着细胞外基质的重塑，包括基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinas，MMP）和其他降解酶的表达增强[24]。而丹参酮IIA和丹参酚酸均能够有效地抑制NSCLC细胞外基质相关蛋白MMP-2以及黏附蛋白的表达，进而阻断肿瘤细胞的转移途径[25- 26]。此外，丹参酮IIA对NSCLC肿瘤血管生成的抑制效应同样是其调控细胞外基质重塑的重要体现 [10]。NSCLC细胞通常具备较强的抗氧化应激和清除活性氧的能力，以维持细胞内氧化还原平衡，保护细胞免受氧化损伤，进而促进肿瘤生长、转移和耐药 [27]。丹参酮和丹参酚酸通过诱导肺癌细胞氧化应激产生大量难以被清除的活性氧从而达到抗肿瘤效果[28-29]。代谢重编程是肿瘤细胞特有的代谢现象，其中最具代表性的改变是“瓦伯格效应”，即肿瘤细胞在充足氧气的情况下依然主要通过有氧糖酵解产生能量，而非通过氧化磷酸化，代谢重编程帮助NSCLC细胞获得快速增殖所需的能量和代谢中间产物[30]。研究表明，丹参活性成分显著干扰了NSCLC细胞的有氧糖酵解，突出了丹参作用与葡萄糖代谢之间的重要联系[31]。本研究发现，丹参尚有可能通过干扰脂代谢途径抑制NSCLC的恶性进展，包括脂蛋白的转运和定位、类固醇代谢以及脂溶性维生素的代谢过程。然而，这些结果仅仅是利用生物信息学方法作出的较为宽泛的预测，尽管在富集分析时采用Benjamini-Hochberg（FDR）校正严格控制了假阳性率，但以此获得的功能注释结果仍缺乏足够的稳健性，且难以聚焦核心机制。因此本研究使用Cytoscape构建了“成分-靶点-通路”多层网络，旨在识别核心靶点和通路，模块化分析进一步弥补了结果的可靠性。总的来说，这些方法的运用始终受限于较为单一的生物学维度和有限的数据库覆盖，故而需要从多组学角度（如单细胞转录组、蛋白质组）和多数据库联合分析进行交叉验证，同时还需要开展一些必要的实验对关键节点（靶点和通路）加以验证。

本研究在靶点网络分析的基础上选取与细胞周期调控相关的子网络作进一步分子对接分析，结果显示丹参活性成分与CDK4、AURKB、PLK1、CDK1和TYMS具有更强的结合亲和力。CDK4与CDK1为细胞周期调控中的两种重要激酶，其通过与不同的cyclin结合，调控细胞周期的各个阶段。CDK4是G1期的关键调控因子之一，通常与cyclin D结合形成活性复合物。从而推动细胞周期从G1期向S期过渡[32]。在NSCLC中，CDK4的过度激活或cyclin D的过量表达是导致细胞周期失控的关键因素，CDK4/6抑制剂（如帕博西利、瑞贝西利和阿比西利）已经成为治疗包括NSCLC在内多种肿瘤的重要靶向药物[33]。丹参已被证实能够显著下调肺癌细胞cyclin D1表达[23, 34]，本研究通过分子对接确定其活性成分能够直接靶向CDK4，并利用分子动力学模拟证实了丹参酮IIA与CDK4结合的稳定性，这些证据提示丹参诱导NSCLC细胞G0/G1期阻滞依赖于对CDK4/ cyclin D1复合物的直接调控，丹参相关成分与CDK4/6抑制剂的协同作用或许有望成为探索新的联合治疗方案的重要依据。CDK1主要调控细胞周期的G2/M过渡，其与cyclin B结合形成CDK1/cyclin B复合物，激活一系列磷酸化事件，最终推动细胞进入有丝分裂（M期）[35]。CDK1在肺癌中的高表达常常预示患者预后不良 [36]，可见丹参能够在多个细胞周期检查点进行定点阻断，从而有效抑制肿瘤细胞的分裂和增殖过程。AURKB和PLK1是细胞有丝分裂过程中的重要调节因子，二者在功能上具有一定的相似性，均有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。其在恶性肿瘤中主要通过调控细胞周期进程发挥促癌作用，相关研究表明抑制AURKB或PLK1在一定程度上增强了NSCLC对EGFR抑制剂和放射治疗的敏感性 [37-40]。此外，二者在肺癌细胞DNA损伤修复过程中也扮演着重要角色 [41- 42]，靶向这两个分子的治疗策略，将有望为NSCLC的治疗提供新的突破。TYMS主要参与机体嘧啶代谢和一碳单位代谢及相关途径，特别是在NSCLC中，其表达水平与肿瘤的增殖、恶性程度、耐药性以及预后密切相关 [43]。以上这些靶点在NSCLC中的促癌作用已经得到了充分证实，其通过各自的机制维持肿瘤细胞的恶性生物学行为，使临床治疗充满挑战性，丹参活性成分对其独特的靶向抑制将有望改善这种局面。鉴于分子对接和分子动力学模拟技术本质上具有计算模型简化与生物系统的复杂性之间的矛盾，故而本研究中存在着难以避免的局限性。例如，在分子对接时丹参酮与靶蛋白的结合可能因疏水口袋的柔性未被充分采样，导致预测的结合位点偏离实际，从而降低了分子对接的精准度；而在分子动力学模拟过程中丹参活性成分与靶点的结合可能涉及缓慢的构象调整，常规的模拟难以捕捉完整过程，这也是导致分子动力学模拟的时间尺度限制的重要原因之一[44]。通过多方法整合（如增强采样、多尺度建模）、实验验证和人工智能技术辅助，可在一定程度上突破现有瓶颈。然而，这些技术仍需与湿实验紧密结合，尤其在天然产物（如丹参）的多靶点机制研究中，需谨慎解释计算结果，避免过度依赖单一预测结果。

综上所述，丹参作为一种天然植物药物，在抗NSCLC方面具有显著的研究价值。本文利用网络药理学和生物信息学方法以及分子对接和分子动力学模拟技术分别从全局和分子水平对丹参抗NSCLC的作用机制展开了深入探讨，结合系统的文献回顾，揭示了丹参相关成分在NSCLC细胞周期调控、细胞外基质重塑、氧化应激反应和代谢重编程等重要生物学过程中的关键作用，确定了其对NSCLC恶性进展和治疗抵抗诸多靶点的抑制效应。丹参通过多种机制和多个靶点介导的抗肿瘤活性为开发NSCLC综合治疗策略提供了新的思路，也极大地鼓舞了中医药治疗恶性肿瘤的临床应用价值。然而，基于网络药理学筛选的靶点和通路可能存在未被实验验证的噪声信号，且丹参活性成分在体内的真实结合模式可能受代谢产物、血浆蛋白结合等因素影响，而当前模拟仅针对原型化合物。因此整合多组学数据（如单细胞转录组、蛋白质组）筛选更可靠的靶点以及研究丹参成分代谢产物（如丹参酮IIA磺酸钠）的结合特性将会是后续探索的重要方向。另一方面，尽管丹参在抗NSCLC方面显示出广泛的研究潜力，但其临床应用仍处于初步阶段。目前的研究主要集中在丹参及其成分的体外和动物模型中的疗效评估，丹参成分的生物利用度、组织分布及潜在毒性尚缺乏全面评估。未来的研究需要更多的临床试验数据来验证丹参在NSCLC治疗中的效果和安全性，尤其是在联合治疗中的作用有待进一步证实。因此，完成动物模型药效与毒性验证，开展单中心I/II期临床试验探索安全性与初步疗效，基于生物标志物的多中心III期试验明确临床获益的三阶段临床转化路径的实践至关重要。

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