目的  针对前期显色法测定过氧化氢酶活性时存在的检测限偏高、灵敏度不足及显色溶液稳定性差等问题，建立一种新的过氧化氢酶活性检测方法。

方法  Fe²⁺与SCN-不发生显色反应，而H₂O₂可氧化Fe²⁺生成Fe³⁺，Fe³⁺与SCN-进一步形成在458 nm处有最大吸收的Fe³⁺/SCN-配合物，体系的吸光度与H₂O₂浓度呈正相关；当过氧化氢酶存在时，可催化分解H₂O₂，导致吸光度随时间递减，其递减速率（^△A/t）即反映了酶的催化活性。

结果  过氧化氢酶活性有效测定范围为20~400 U/L，最低检测限为10 U/L。

结论  本研究首次在光度法中使用无机显色剂，通过配位反应构建了一种准确、稳定、抗干扰能力强的过氧化氢酶活性测定方法，适用于微量酶活性检测，具有良好的推广应用价值。

过氧化氢酶（catalase，CAT）作为一种酶类清除剂，是生物防御体系的关键酶之一[1-2]，能够催化过氧化氢（H₂O₂）分解为H₂O和O₂，从而清除体内H₂O₂，保护细胞免受其毒害。该酶在医药领域具有多种用途，涵盖药物制备与生产、临床诊断与治疗、生物制剂生产以及增强免疫力与促进健康等方面。目前关于CAT活性检测的方法较多，包括滴定法[3]、化学发光法[4]、催化荧光法[5]、紫外分光光度法[6-7]等。其中，滴定法最为常用，但检测限较高；荧光法可实现微量检测，但稳定性较差，不利于常规经济分析；紫外分光光度法仅针对底物H₂O₂，光灵敏性有限；褪色光度法[8]和显色光度法[9-13]因操作简便、成本低而广受推崇，但所用显色剂和染料多属有毒有机物，且反应过程复杂、不易彻底。目前，以无机试剂为主体、基于Fe³⁺/SCN^-配位显色反应测定CAT活性的研究仍较为少见。

硫氰酸钾（KSCN），又称硫氰化钾，是Fe³⁺的专一性探针试剂[14-18]，加入后可与Fe³⁺形成血红色配合物。在过CAT分解H₂O₂的过程中，若存在过量Fe³⁺，剩余的H₂O₂可将其部分氧化为Fe²⁺，生成的Fe³⁺/SCN^-配合物在458 nm波长处具有最大吸光度（A），且该A值与剩余H₂O₂浓度呈正相关。因此，通过酶反应前后A的差值（ΔA）即可确定酶活性。KSCN显色光度法虽然在灵敏度上不及荧光法，但其检测准确度更高，反应快速，计量关系明确，操作简便，过程安全环保，对生物样品分析的相对标准偏差低至1.63%。新方法的各项性能指标均表明，其非常适用于CAT检测试剂盒的研发。基于上述优势，本研究拟通过系统试验对该检测体系进行进一步优化与验证。

1 材料

1.1 主要仪器

UV1102 紫外-可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；PHS-3C/3E/25酸度计（上海雷磁）；FA2004N电子分析天平（上海菁海科技有限责任公司）。

1.2 主要药品与试剂

CAT（英国沃特曼，来源于牛肝脏，批号：JS301719，纯度≥3 000 U/mg）；KSCN（天津市登丰化学品有限责任公司，批号：20210301）；七水硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O，天津市天力化学试剂有限责任公司，批号：2024100801）；3% H₂O₂（山东利尔康医疗科技股份有限公司，批号：20240817）。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

CAT工作液（300 U/L）：称取1 mg CAT固体，用100 mL二次蒸馏水溶解并定容，于4℃低温保存；使用前需再次稀释100倍。

H₂O₂标准溶液（0.01 mol/L）：用微量取样器取3% H₂O₂溶液5 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀释并定容；采用高锰酸钾法进行标定，溶液于4℃低温密封保存，使用前需再次稀释。

^{_{0.01 mol/L Fe2+溶液：称取0.278 g FeSO4·7H2O，直接置于小试剂瓶中，加入100 mL水，振荡溶解后，加入1粒锌粒，可长期保存。}}

0.1 mol/L KSCN溶液：称取0.971 8 g KSCN固体，加入100 mL水溶解。

0.5 mol/L硫酸（H₂SO₄）溶液：量取5 mL浓H₂SO₄，缓慢加入180 mL超纯水中，混匀均匀。

2.2 测定原理

CAT可催化分解H₂O₂。在H2SO₄介质中，当存在过量Fe²⁺时，未被分解的剩余H₂O₂会将Fe²⁺氧化生成Fe³⁺。生成的Fe³⁺与SCN^-形成配合物，该配合物在458 nm波长处具有最大吸收峰。反应方程式如下：

Fe³⁺+SCN^-→n[Fe(SCN)_n]^3-n（n=1~6时均为血红色）

酶活性通过加酶前后ΔA来确定。根据公认的定义，酶活性是指在1 min内，单位体积酶液所能分解的H₂O₂物质的量（μmol），其值可通过公式（1）计算得出：

其中，ΔA为加酶前后A差值（比色皿液层厚度为1 cm）；t为反应时间（min）；K为工作曲线方程斜率[H₂O₂表观毫摩尔吸光系数，L/（mmol·cm）]），表示1 mmol/LH₂O₂对应的A变化量；V为反应液体积（mL）；v为酶样品体积酶活性；1 000为单位转换系数。

2.3 测定方法

在10 mL比色管中，依次加入一定体积的酶液和0.20 mL 0.01 mol/L H₂O₂溶液，于25℃孵育10 min；随后加入0.10 mL 0.5 mol/L H2SO₄溶液终止酶反应；再加入1.00 mL 0.01 mol/L Fe²⁺溶液，室温反应5 min；之后加入1.00 mL 0.1 mol/L KSCN溶液，最后用蒸馏水定容至刻度。以蒸馏水作为参比溶液，使用光径为1 cm的比色皿，在458 nm波长下测定A值。

另取一支10 mL比色管，先向酶液中直接加入H2SO₄使其灭活，再加入0.20 mL 0.01 mol/L H₂O₂溶液，后续操作步骤与前文相同，测定AO。根据ΔA（AO-A）计算酶液活性。

2.4 吸收曲线分析

Fe²⁺/SCN^-混合溶液在360~700 nm波长区间内无吸收峰，表明两者不发生显色反应。然而，当存在H₂O₂时，H₂O₂将Fe²⁺氧化为Fe³⁺，Fe³⁺与SCN^-发生配位反应并显色，生成配合物[Fe（SCN）_n]^3-n，其在458 nm处出现最大吸收峰。该吸收峰的A值与H₂O₂浓度呈正相关（图1）。当H₂O₂浓度为0.02 mmol/L 时，测得A值为1.258，计算得H₂O₂的表观摩尔吸光系数超过6×10⁴L/（mol·cm）。结果表明，即使微摩尔级别的 H₂O₂也对显色反应具有显著增强作用，这为CAT活性的测定提供了便利。

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  图1 不同浓度H2O2显色反应体系吸收曲线

  Figure 1.The absorption curves of H2O2 color reaction system

  

2.5 KSCN显色反应条件优化

2.5.1 Fe2+反应浓度的影响

设定H₂O₂的反应浓度为 0.10 mmol/L，分别取 0.01 mol/L Fe²⁺溶液0.10、0.30、0.50、0.70、1.00、1.50、2.00 mL进行试验，对应Fe²⁺的反应浓度依次为 0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0  mmol/L。结果表明，当Fe²⁺浓度大于0.7 mmol/L时，H₂O₂完全反应，A值达到最大（图2）。此时Fe²⁺与H₂O₂的浓度比超过7  ∶ 1，说明Fe²⁺相对过量。当Fe²⁺浓度较低时，一方面H₂O₂过量导致生成的Fe³⁺不足，另一方面产物Fe³⁺可能引发H₂O₂的内部分解，从而使KSCN显色反应受到限制。为减少副反应引入的系统误差，最终选择Fe²⁺的反应浓度为1.0 mmol/L，此时需取 0.01 mol/L Fe²⁺溶液1.00 mL。

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  图2 反应液Fe2+浓度的影响

  Figure 2.The influence of Fe2+ concentration in reaction solution

  

2.5.2 H2SO4浓度的影响

设定H₂O₂的反应浓度为0.10 mmol/L，操作步骤同前。本研究重点考察0.5 mol/L H2SO₄的体积对KSCN显色反应程度的影响。从图3可以看出，H₂O₂的得电子反应需在酸性环境中进行，酸性条件可有效抑制Fe³⁺的水解。结果表明，当H2SO₄浓度为5 mmol/L时，体系在458 nm 处的A值达到最大；而当H2SO₄浓度大于15 mmol/L时，A值迅速下降，这是由于酸度过高加剧了质子化效应，使SCN^-以HSCN分子形式存在，从而导致Fe³⁺的络合反应受到抑制。因此，最终将H2SO₄的反应浓度设定为5 mmol/L，此时需加入0.5  mol/L H2SO₄溶液0.10 mL。

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  图3 H2SO4浓度与A值的关系

  Figure 3.The relationship between H2SO4 concentrationand A value

  

2.5.3 反应时间的影响

设定H₂O₂的反应浓度为0.10 mmol/L，操作步骤同前。本研究进一步考察了H₂O₂与Fe²⁺反应的最佳时间。在H2SO₄介质中，H₂O₂与Fe²⁺反应迅速，从图4可以看出，反应进行2 min后A值已达到最大。为确保H₂O₂完全且彻底反应，实际反应时间最终设定为5 min。

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  图4 反应时间的影响

  Figure 4.The influence of reaction time

  

2.5.4 SCN-反应浓度的考察

在H₂O₂反应浓度为0.10 mmol/L、其他条件恒定的情况下，试验考察了SCN^-反应浓度对体系A值的影响（图5）。结果显示，显色液的A值随SCN^-浓度的增加呈线性增长；当SCN^-浓度大于0.01 mol/L 时，线性关系逐渐变差；SCN^-浓度大于0.03 mol/L 后，A值趋于稳定。为降低测量误差，最终将SCN^-的反应浓度设定为0.01  mol/L，此时需加入0.1 mol/L SCN^-溶液1.00 mL。

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  图5 SCN-反应浓度的影响

  Figure 5.The influence of SCN- reaction concentration

  

2.6 H2O2工作曲线方程

取11支10 mL刻度比色管，依次加入0.01 mol/L H₂O₂标准溶液0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL，各加入0.5 mol/L H2SO₄溶液0.10 mL及0.01 mol/L Fe²⁺溶液1.00 mL，室温反应5 min后随之加入0.1 mol/L KSCN溶液1.00 mL，用蒸馏水稀释并定容至刻度，由此反应浓度分别为0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mmol/L的H₂O₂标准系列，于458 nm波长处测定各溶液 的A值，以H₂O₂浓度（mmol/L）为横坐标、A值为纵坐标进行线性拟合，建立H₂O₂的工作曲线方程。

如图6所示，在0.01~0.20 mmol/L浓度范围内，H₂O₂浓度与显色液A值呈良好线性关系。根据工作曲线斜率计算得出H₂O₂的表观摩尔吸光系数为6.151 4 L/（mmol·cm），即反应液中H₂O₂浓度每降低1 mmol/L，A值相应减少6.151 4。对H₂O₂空白体系进行10次平行测定，标准偏差为0.012。取3倍标准偏差除以工作曲线斜率，计算得H₂O₂的检测限为0.005 mmol/L。

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  图6 显色液A值与H2O2浓度关系

  Figure 6.The relationship between A value of colorimetric solution and H2O2 concentration

  

2.7 酶分解反应条件设定

2.7.1 底物H2O2用量

图6结果显示，H₂O₂在0.01~0.20 mmol/L浓度范围内与显色液A值呈线性关系。为降低测量误差并拓宽酶活性测定范围，将底物H₂O₂的反应浓度设定为0.20 mmol/L，此时需加入0.01 mol/L H₂O₂溶液0.20 mL。

2.7.2 酶分解反应时间设定

CAT活性反映了H₂O₂的分解量及酶催化反应的时间，体现了酶促反应速率的大小，因此酶分解反应时间的设定至关重要。取300 U/L CAT标准工作液0.50 mL作为测试液，在仅改变酶分解反应时间的条件下，按试验方法测定反应液A值，并计算酶分解反应前后的ΔA。图7结果显示，A值随酶分解反应时间的延长而逐渐降低，并在25 min后趋于稳定；在反应初始阶段（0~10 min），ΔA与酶分解反应时间呈正比关系，符合酶反应动力学特征。因此，最终将酶分解反应时间设定为10 min。

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  图7 酶分解反应时间考察

  Figure 7.The investigation of enzyme decomposition reaction time

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2.8 CAT检测范围和检测限

在0.01~0.20 mmol/L浓度范围内，H₂O₂浓度与显色液A值呈线性关系，其检测限为0.005 mmol/L。按酶活性计算公式计算，若酶分解反应时间设定为10 min，待测酶液取样体积为0.50 mL，则CAT活性的检测范围为20~400 U/L，方法检测限为10 U/L。

2.9 精密度试验

取标示活性为300 U/L的过氧化氢酶工作液0.50 mL作为测试液，按“2.3”项下方法进行测定，平行操作6次，计算得该CAT工作液活性的实际测定值为260.9 U/L，与标示值基本一致，RSD为0.32%（n=6），结果表明基于KSCN显色光度法测定CAT活性具有较高的可信度。

2.10 干扰试验

在优化的测定条件下，通过考察常见共存离子及有机物的干扰效应，评估了本方法在生物样品CAT检测中的适用性。取300 U/L CAT工作液0.50 mL作为测试液，反应液中底物H₂O₂浓度设定为0.2 mmol/L，通过添加不同剂量的干扰物质（相对于H₂O₂的量），进行酶活性回收率试验。结果如表1所示，常见共存离子（如Ca²⁺、Br^-、CO₃^2-、Cl^-、Na⁺、PO₄^3-）对CAT测定无干扰，测定结果的相对误差均不超过5%，表明该方法具有良好的选择性。同时，试验证实其他生物酶（如3 000 U/L葡萄糖氧化酶、3 000 U/L淀粉酶等）对CAT活性测定亦无明显影响。生物组织样品中可能存在的谷胱甘肽虽可还原H₂O₂，但其含量通常极低，该干扰可通过设置酶灭活空白进行消除。

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  表格1 设定干扰物质条件下CAT活性测定回收试验

  Table 1.The recovery test for CAT activity determination under interference substance conditions

  

2.11 样品分析与方法比较

取鲫鱼活体肝脏组织，称重后加入pH 7.0 的磷酸盐缓冲液，匀浆并定容至 0.1 g/L，随后12.577 5×g离心30 min。取上清液分装于多个1  mL塑料离心管中，经速冻处理后保存，使用前解冻。

分别采用显色法、碘量法（通过间接碘量法测定加酶前后H₂O₂的减少量）[3]和高锰酸钾法（以高锰酸钾为标准溶液测定加酶前后H₂O₂的减少量）[3]定量测定鲫鱼肝脏样品中的酶活性（采用显色法测定时，需将解冻样品用超纯水稀释10倍，每次取0.50 mL进行测定）。结果显示，显色法、碘量法和高锰酸钾法测得的酶活性分别为：（3 254±52）、（3 316±112）、（3 208±157）U/L，RSD分别为1.63%、2.57%和3.32%（n=6）。3种方法测定结果基本一致，显色法精密度更小。

3 讨论

本文依据CAT分解H₂O₂，强酸环境下过剩H₂O₂与Fe²⁺发生反应生成Fe³⁺，Fe³⁺/SCN^-配合物在458 nm处有最大吸收的现象建立了一种测定CAT活性的新方法。CAT活性的检测范围为20~400 U/L，方法检测限为10 U/L；方法的选择性好，抗干扰能力强。常见共存离子（如Ca²⁺、Br^-、CO₃^2-、Cl^-、Na⁺、PO₄^3-）对CAT测定无干扰，测定结果的相对误差均不超过5%，其他生物酶（如3  000  U/L葡萄糖氧化酶、3 000 U/L淀粉酶等）对CAT活性测定亦无明显影响；与碘量法、高锰酸钾法作比较，测定结果基本一致，新方法表现出更好的精密度；试剂稳定且易保存，测试成本低，SCN^-/Fe²⁺不反应，SCN^-、Fe²⁺、H₂SO₄三者可混合处。本方法上述优势可为后续CAT试剂盒的研发提供可能。

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