目的 基于高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-Q-Exactive-MS)对壮西六味散化学成分进行快速分析和鉴定。
方法 采用Shim-pack GIST C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-0.1%甲酸水,梯度洗脱,流速为0.35 mL/min,柱温为35℃,进样量为10 μL,质谱采用电喷雾离子源,正、负离子扫描,扫描范围为m/z 110~1 200。
结果 结合质谱数据和文献信息,在壮西六味散中鉴别出65个成分,包括16个生物碱类成分、11个黄酮类成分、14个有机酸类成分、6个色酮类成分、7个倍半萜类成分、4个脂肪酸类成分、3个氨基酸类成分、2个鞣质类成分、1个酚酸类成分、1个苯丙素类成分。
结论 HPLC-Q-Exactive-MS 法能快速鉴别壮西六味散中的化学成分,为壮西六味散的药效物质研究奠定基础。
蒙药壮西六味散收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册),由荜茇、木香、土木香、红花、白豆蔻及寒水石(制)6味药材组成[1],具有祛“巴达干”病、止吐的功效,蒙医临床常用于脾胃不和、积滞内停所致的胃脘腹胀、胃痛胀满、吐酸水、“巴达干宝日”等症的治疗[2-3]。虽然该方剂在临床应用多年,疗效得到了充分确证,然而其发挥功效的物质基础仍有待阐明。高分辨液质联用技术因具备高效的分离能力及强大的结构解析能力,在传统复方定性鉴别过程中具备明显优势[4-5]。鉴于此,本研究拟采用高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-Q-Exactive-MS)技术对壮西六味散进行了快速、全面地定性分析,旨在为壮西六味散物质基础挖掘、血清移行成分表征及作用机理阐明等提供数据支撑。
1 材料
1.1 主要仪器
AP135W型十万分之一电子天平(日本岛津公司);HPLC-Q-Exactive型高效液相色谱-质谱联用系统仪[美国赛默飞世尔科技(中国)有限公司];BSA224S万分之一天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];DS-7510DTH型数控超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司)。
1.2 主要药品与试剂
壮西六味散(内蒙古蒙药股份有限公司,批号:2203024);木香烃内酯(批号:111524-202312,纯度≥99.6%)、去氢木香内酯(批号:111525-202313,纯度≥99.8%)、胡椒碱(批号:110775-202107,纯度≥98.2%)、原儿茶酸(批号:110809-202207,纯度≥97.5%)、木犀草素(批号:111520-202107,纯度≥99.3%)、木犀草苷(批号:111720-202111,纯度≥96.6%)、金丝桃苷(批号:111521-202310,纯度≥98.7%)、芦丁(批号:100080-202012,纯度≥98.5%)购自中国食品药品检定研究院;甲醇、乙腈为色谱纯;甲酸为分析纯;水为屈臣氏蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
精密称取原儿茶酸、木香烃内酯、去氢木香内酯、胡椒碱、芦丁、木犀草素、木犀草苷、金丝桃苷适量,分别置于10 mL量瓶中,加甲醇适量、超声(功率:200 W,频率:60 kHz),定容,制备质量浓度分别为534.00,498.00,517.00,511.00,522.00,528.00,546.00,478.00 μg/mL的单一对照品贮备液;分别精密量取上述各贮备液10 μL于同一10 mL量瓶中,得质量浓度分别为534.00,498.00,517.00,511.00,522.00,528.00,546.00,478.00 ng/mL的混合对照品溶液,于4 ℃保存,用于下一步LC/MS分析。
2.2 供试品溶液的制备
取壮西六味散,研磨,过筛,精密称取约1.0 g至50 mL锥形瓶中,加90%甲醇水溶液5 mL,称重、封口,超声(功率:200 W,频率:60 kHz)提取30 min,冷却至室温,再次称重,90%甲醇水溶液补足重量,摇匀,经0.22 μm滤膜过滤,即得供试品溶液,于4 ℃保存,用于下一步LC/MS分析。
2.3 分析条件
2.3.1 色谱条件
色谱柱:Shim-pack GIST C18柱(150 mm× 4.6 mm,5 μm),流动相:甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱(0~8 min,5%A;8~12 min,5%~18%A;12~15 min,18%~30%A;15~20 min,30%~45%A;20~25 min,45%~60%A;25~28 min,60%~75%A;28~ 35 min,75%~95%A;35~40 min,95%A);流速:0.35 mL/min,柱温:35 ℃,进样量:10 μL。
2.3.2 质谱条件
采用电喷雾离子源;检测方式:Full MS/dd-MS2;Full MS分辨率:70 000;dd-MS2分辨率:17 500;扫描范围:m/z 110~1 200;喷雾电压:3.80 kV(+)和3.20 kV(-);碰撞能量:30 eV;碰撞气:高纯氩气;离子传输管温度:300 ℃(+)和400℃(-);辅助气:氮气;辅助气体积流量:30 L/min;辅助气温度:350 ℃。
2.4 数据库建立与分析
采用PubMed、CNKI、万方等数据库对壮西六味散全方及各味药材所含成分的名称、分子式、离子化模式、多级质谱碎片进行收集整理,利用Thermo Xcalibur 3.0软件对壮西六味散供试品溶液和混合对照品溶液在正、负离子模式下获得的总离子流数据进行处理,以自建数据库为基础,以一级质谱误差在1×10-5以内为原则初步对壮西六味散中成分进行辨识分析,以各成分保留时间、元素组成、多级质谱碎片信息及与部分对照品比对做进一步确认,最终解析壮西六味散所含化学成分。
2.5 壮西六味散化学成分鉴定
取“2.2”项下供试品溶液,按“2.3”项下分析条件进样分析,获得壮西六味散供试品溶液和混合对照品溶液正、负离子模式下的总离子流图(图1),结合“2.4”项下分析方法对供试品所含化学成分进行辨识分析,结果在壮西六味散中共鉴定出65个化学成分(表1),包括16个生物碱类成分、11个黄酮类成分、14个有机酸类成分、6个色酮类成分、7个倍半萜类成分、4个脂肪酸类成分、3个氨基酸类成分、2个鞣质类成分、1个酚酸类成分、1个苯丙素类成分,其中8个成分经与对照品比对得到进一步确证。
2.6 黄酮类成分鉴定过程
11个黄酮类化合物在壮西六味散中被鉴定,包括22、24~27、30、32~34、36、49号化合物,鉴定过程以槲皮素(化合物33)为例进行说明:33号化合物在ESI-模式下可见[M-H]- m/z 301.037 1准分子离子峰,保留时间为22.93 min,Xcalibur软件拟合其分子式为C15H9O7,误差为4.205 ×106,准分子离子峰发生逆狄尔斯-阿德尔反应(RDA)脱去1分子C7H6O2后产生m/z 178.998 7 [M-H-CO-C7H6O2]-,进一步脱去1分子CO产生m/z 151.003 4 [M-H-CO-C7H6O2]-碎片离子峰,或准分子离子峰丢失1分子CO后产生m/z 273.042 6 [M-H-CO]-,结合化合物的元素组成、裂解规律、碎片离子信息[7-9],确认33号化合物为槲皮素,其MS2质谱图及可能的裂解途径见图2。
2.7 生物碱类成分鉴定过程
16个生物碱类化合物在壮西六味散中被鉴定,包括35、37、39、41~43、45~46、53~56、58~61号化合物,鉴定过程以胡椒碱(化合物54)为例进行说明:54号化合物在ESI+模式下可见[M+H]+m/z 224.200 4 准分子离子峰,保留时间为30.32 min,Xcalibur软件拟合其分子式为C14H26NO,误差为-3.840×106,准分子离子峰失去C4H8产生m/z 168.137 7 [M+H-C4H8]-,连续脱去1分子NH3和H2O产生m/z 151.111 4 [M+H-C4H8-NH3]-、m/z 143.048 7 [M+H-C4H8-NH3-H2O]-碎片离子峰,结合化合物的元素组成、裂解规律、碎片离子信息[17-18],确认54号化合物为墙草碱,其MS2质谱图及可能的裂解途径见图3。
2.8 有机酸类成分鉴定过程
14个有机酸类化合物在壮西六味散中被鉴定,包括1~2、5~7、9~12、14、16、18~19、29号化合物,鉴定过程以莽草酸(化合物29)为例进行说明:29号化合物在ESI-模式下可见[M-H]- m/z 173.045 3准分子离子峰,保留时间为20.32 min,Xcalibur软件拟合其分子式为C7H8O5,误差为5.086 ×106,准分子离子峰连续丢失CO2、H2O可产生m/z 155.034 9 [M-H-H2O]-、m/z 111.044 6 [M-H-CO2]-、m/z 137.023 8 [M-H-2H2O]-、m/z 93.033 7 [M-H-2H2O-CO2]-碎片离子峰,结合化合物的元素组成、裂解规律、碎片离子信息[7-9],确认29号化合物为莽草酸,其MS2质谱图及可能的裂解途径见图4。
2.9 色酮类成分鉴定过程
6个色酮类化合物在壮西六味散中被鉴定,包括20~21、23、37、40、44号化合物,鉴定过程以沉香四醇(化合物20)为例进行说明:20号化合物在ESI+模式下可见[M+H]+ m/z 319.116 6准分子离子峰,保留时间为17.16 min,Xcalibur软件拟合其分子式为C17H19O6,误差为-3.055×106,准分子离子峰连续丢失H2O、CO后产生m/z 301.106 4 [M+H-H2O]+、m/z 283.095 9 [M+H-2H2O]+、m/z 255.100 9 [M+H-2H2O-CO]+、m/z 227.105 9 [M+H-2H2O-2CO]+,结合化合物的元素组成、裂解规律、碎片离子信息[12],确认20号化合物为沉香四醇,其MS2质谱图及可能的裂解途径见图5。
2.10 倍半萜类成分鉴定过程
7个倍半萜类化合物在壮西六味散中鉴定出,包括31、47~48、50~52、57号化合物,鉴定过程以异土木香内酯(化合物48)为例进行说明:48号化合物在ESI+模式下可见[M+H]+m/z 233.152 8准分子离子峰,保留时间为28.49 min,Xcalibur软件拟合其分子式为C15H19O2,误差为-3.587×106,准分子离子峰丢失H2O、CO可产生m/z 215.142 2 [M+H-H2O]-、m/z 187.147 7 [M+H-H2O-CO]-碎片离子峰,结合化合物的元素组成、裂解规律、碎片离子信息及对照品比对[15-16],确认48号化合物为异土木香内酯,其MS2质谱图及可能的裂解途径见图6。
2.11 氨基酸、脂肪酸类成分鉴定过程
3个氨基酸类化合物在壮西六味散中被鉴定,包括3~4、13号化合物,鉴定过程以色氨酸(化合物13)为例进行说明:13号化合物在ESI+模式下可见[M+H]+ m/z 205.095 8准分子离子峰,保留时间为10.53 min,Xcalibur 3.0软件拟合其分子式为C11H13N2O2,误差为-6.700×106,准分子离子峰失去1分子NH3基团产生m/z 188.070 3 [M+H-NH3]+,继续丢失1分子CO2产生m/z 144.080 4 [M+H-NH3-CO2]+碎片离子峰,或准分子离子峰a、b键发生α断裂分别产生m/z 132.080 6 [M+H-C2H3NO2]+、m/z 118.065 0 [M+H-C3H5NO2]+,结合化合物的元素组成、裂解规律、碎片离子信息[10],确认13号化合物为色氨酸。化合物13可能的裂解途径及MS2图见图7。
4个脂肪酸类化合物在壮西六味散中被鉴定,包括62~65类化合物,鉴定过程以亚油酸(化合物63)为例进行说明:63号化合物在ESI-模式下可见[M-H]- m/z 279.234 6准分子离子峰,保留时间为36.81 min,Xcalibur 3.0软件拟合其分子式为C18H31O2,误差为3.557×106,准分子离子峰失去1分子H2O后产生m/z 261.223 4 [M-H-H2O]-,结合化合物的元素组成、裂解规律、碎片离子信息[7-9],确认63号化合物为亚油酸。化合物63可能的裂解途径及MS2图见图8。
3 讨论
传统复方作为一个多成分共存的复杂体系,所含各成分理化性质存在较大差异,进而导致其在不同流动相条件下的质谱反应不尽相同,因此,研究前期对不同的流动相组成(乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液)进行了考察,结果在甲醇-0.1%甲酸水溶液流动项体系下,获得色谱峰数量较多,且各成分质谱响应信息更为丰富;同时,因生物碱类化合物中的氮原子电负性优于碳原子,使得其更易捕获1个质子,从而使其在正离子的电离模式下的质谱响应较好,而有机酸类、黄酮类等其他类成分在负离子模式下的质谱响应相对更优,为使表征成分质谱信息更为丰富,本研究在全扫面方式下采用正、负两种离子模式对壮西六味散样品进行了测定分析。
对样品处理方式及处理时间考察发现,加热回流处理和超声处理对色谱峰数量及质谱响应无明显影响,基于人力、时间成本考虑,研究采用了超声方式对样品进行处理,同时,延长超声时间并未使色谱峰数量增加、质谱响应提高,因此,研究确定样品最优处理条件为超声处理30 min。
综上,本研究采用HPLC-Q-Exactive-MS技术对蒙药壮西六味散进行了全面、精准、系统的定性研究,共鉴别获得65个化学成分,包括16个生物碱类成分、11个黄酮类成分、14个有机酸类成分、6个色酮类成分、7个倍半萜类成分、4个脂肪酸类成分、3个氨基酸类成分、2个鞣质类成分、1个酚酸类成分、1个苯丙素类成分,本研究为该方剂药效物质挖掘、血清移行成分解析、作用机理探讨提供了强有力的数据支撑。
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