目的  探讨程序性死亡受体1（PD-1）抑制剂帕博利珠单抗用于宫颈癌治疗效果的影响因素。

方法  回顾性分析2020年1月至2023年10月安徽省妇女儿童医学中心妇产科收治的使用帕博利珠单抗宫颈癌患者临床资料，根据疗效分为无效组和有效组。比较两组患者的临床资料[年龄、肿瘤类型、病理类型、病灶大小、分化程度、妊娠次数、生产次数、流产次数、绝经情况、肿瘤突变负荷（TMB）、DNA修复基因突变情况、PD-L1表达情况、糖尿病、高血压、治疗模式、体质量指数、肿瘤侵润淋巴细胞（TIL）表达情况、新抗原瘤内异质性（ITH）情况、有无肝病、家族史]，采用Logistic回归分析确定影响宫颈癌患者帕博利珠单抗疗效的危险因素。

结果  研究共纳入60例患者，有效组42例，无效组18例。无效组TMB＜143/Mb、DNA修复基因未突变、PD-L1低表达、单纯免疫治疗、TIL阴性、ITH高的患者占比均高于有效组（P＜0.05）。多因素Logistic回归分析显示，TMB＜143/Mb、DNA修复基因未突变、PD-L1低表达、单纯免疫治疗、TIL阴性、ITH高均是影响宫颈癌患者帕博利珠单抗疗效的危险因素（P ＜0.05）。

结论  宫颈癌患者PD-1抑制剂帕博利珠单抗疗效受TMB、DNA修复基因突变、PD-L1表达、治疗模式、TIL、ITH等因素的影响。

宫颈癌发病率和病死率较高，以手术治疗为主，但晚期患者手术生存率低且疗效不好。研究发现，免疫抑制在肿瘤发展中有着重要作用，帕博利珠单抗是程序性死亡受体（programmed death-1，PD-1）抗体，能够激活T细胞增强免疫，提高灭杀肿瘤细胞能力，并在宫颈癌患者中获得了较理想的疗效，但针对单分子或通路的免疫治疗仍不足以实现晚期宫颈癌患者持久临床效应[1-2]。因此，多采用免疫治疗结合放疗治疗模式来提高免疫疗法有效性和持久性。已有研究证明免疫治疗联合放疗在癌症临床治疗中效果满意，放疗可提高免疫疗法全身反应率[3]。但由于放疗部位、体积和剂量以及肿瘤免疫药物测序有关问题尚未解决，免疫治疗与放疗最佳组合方法尚不明确。为提高单纯免疫治疗效果，本研究对影响PD-1抑制剂帕博利珠单抗疗效的危险因素进行分析，旨在提高PD-1抑制剂治疗效果，为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2020年1月至2023年10月安徽省妇女儿童医学中心妇产科收治的宫颈癌患者临床资料，根据帕博利珠单抗的治疗效果分为无效组和有效组。纳入标准：①符合宫颈癌诊断标准[4]；②病理学检查为原发宫颈癌；③国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期为Ⅱ~Ⅳ期；④患者均为初次入院治疗；⑤年龄≥18岁；⑥临床资料完整，对研究知情同意。排除标准：①严重肝、肾功能障碍；②患有其他恶性肿瘤；③有帕博利珠单抗或化疗禁忌证；④存在恶病质表现；⑤重度营养不良；⑥对化疗药物过敏；⑧生命体征不稳定。本研究获安徽省妇女儿童医学中心医学伦理委员会批准（批件号：2023LK-119）。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法

所有患者均采用放疗计划系统进行放射治疗，CT扫描定位，上传CT图像结合MRI根据CT影像勾画靶区，总剂量50~50.4 Gy/25~28 f，强调放射治疗（intensity modulated radiation therapy，IMRT）计划靶区达到30 Gy后，每周穿插行1次腔内近距离放射治疗，A点共5~6次，6 Gy/次，总肿瘤吸收剂量为25~30 Gy，行7野IMRT计划。同时每隔3周静脉滴注1次帕博利珠单抗（美国Merck Sharp & Dohme公司，批号：S20180019，规格：100  mg/4  mL），200 mg/次，21 d为1个治疗周期，连续治疗3个周期。结束后3周行广泛性子宫切除术、盆腔淋巴结清除术。

1.2.2 资料收集

收集所有患者年龄、肿瘤类型、病理类型、病灶大小、分化程度、妊娠次数、生产次数、流产次数、绝经情况、肿瘤突变负荷（tumour mutational burden，TMB）、DNA修复基因突变情况、PD-L1表达情况、糖尿病、高血压、治疗模式、体质量指数、肿瘤侵润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyted，TIL）表达情况、新抗原瘤内异质性（intra-tumor heterogeneity，ITH）情况、有无肝病和家族史等资料。

1.2.3 标本分析

采集患者术后癌组织标本，提取总RNA，在患者接受治疗前留取外周血10 mL，离心处理，提取血浆游离DNA（circulating free DNA，cfDNA），用约50 ng的cfDNA进行二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）文库构建。对癌症标本中DNA进行基因测序分析，用NGS基因测序方法进行测序分析，包含部分人类基因组区域及常见肿瘤相关基因，测定TMB和ITH。TMB定义为每百万碱基里突变个数，对融合、拷贝变异和非编码区突变不计为TMB。采用实时荧光定量PCR基因扩增仪扩增，分析DNA修复基因突变结果和PD-L1表达情况。采取新鲜癌组织标本，制成细胞悬液，Ficoll梯度离心法离心，收集上层淋巴细胞悬液并计数，调节细胞数量为0.5×10⁶个/mL，离心，分别加入CD4-APC、CD3-PE和CD8-Pacific Blue抗体，采用流式细胞仪对组织内CD3⁺、CD4⁺、CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺TIL细胞进行测定分析。

1.3 疗效评估

根据RECIST 1.1实体瘤疗效评价标准[5]评估，CT或MRI测量病灶大小。完全缓解：目标病灶完全消失，淋巴结直径减小至≤10 mm；部分缓解：肿瘤病灶直径相比于基线减少≥30%；疾病稳定：肿瘤病灶直径相比于基线减少＜30%或增加＜50%；疾病进展：肿瘤病灶直径总和相较于基线增加≥20%或出现新病灶。疾病完全缓解和部分缓解为帕博利珠单抗治疗有效，疾病稳定和疾病进展为帕博利珠单抗治疗无效。

1.4 统计学分析

应用SPSS 22.0统计软件处理数据，计数资料以n（%）表示，采用χ²检验，计量资料以表示，组间比较采用t检验；多因素分析采用Logistic逐步回归分析，以P≤0.05为变量选入标准，以P＞0.10为变量剔除标准。所有检验以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

研究共纳入60例患者，有效组42例，无效组18例。无效组TMB＜143/Mb、DNA修复基因未突变、PD-L1低表达、单纯免疫治疗、TIL阴性、ITH高的患者例数高于有效组（P＜0.05）。具体见表1。

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  表格1 影响帕博利珠单抗疗效的单因素分析

  Table 1.Univariate analysis of factors affecting the efficacy of pembrolizumab

  注：*为连续性校正。

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2.2 影响帕博利珠单抗疗效的多因素Logistic回归分析

以帕博利珠单抗疗效作为因变量，将单因素分析中有差异的因素为自变量，进行多因素Logistic回归分析，各变量赋值见表2。Logistic回归分析结果显示，TMB＜143/Mb、DNA修复基因未突变、PD-L1低表达、单纯免疫治疗、TIL阴性、ITH高均是影响宫颈癌患者帕博利珠单抗疗效的危险因素（P＜0.05）。具体见表3。

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  表格2 量化赋值表

  Table 2.Quantitative assignment table

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  表格3 影响宫颈癌患者帕博利珠单抗疗效的多因素Logistic回归分析

  Table 3.Multivariate logistic regression analysis on the efficacy of pembrolizumab in cervical cancer patients

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3 讨论

宫颈癌多发于35~55岁女性，早期宫颈癌可通过手术获得较高的生存率，但早期宫颈癌微小癌症状不明显，临床误诊、漏诊率较高，而中晚期宫颈癌患者病灶难以控制，手术无法根治且术后复发和转移风险也较高[6]。近年来随着对肿瘤免疫微环境研究的深入，免疫治疗已经应用于多种恶性肿瘤治疗中。PD-1抑制剂帕博利珠单抗在多项研究中均表现出可显著延长宫颈癌患者生存期，甚至有部分患者可完全缓解。冯淑娴等[7]研究发现，复发性宫颈癌患者经帕博利珠单抗治疗8个疗程后，临床症状明显减轻，且不良事件是可控的。但PD-1抑制剂治疗肿瘤患者效果存在显著差异，部分患者疗效并不理想。

本研究中，60例宫颈癌患者经帕博利珠单抗治疗后有18例无效，42例有效，对可能影响帕博利珠单抗疗效的影响因素进行单因素分析发现，无效组TMB＜143/Mb、DNA修复基因未突变、PD-L1低表达、单纯免疫治疗、TIL阴性、ITH高的患者占比均高于有效组，而多因素分析提示上述因素是影响影响宫颈癌患者帕博利珠单抗疗效的危险因素。分析原因为：目前已经在非小细胞肺癌（non small celllung cancer，NSCLC） [8]、结直肠癌[9]、黑素瘤[10]等证实较高的TMB对免疫制剂有较强反应，TMB可作为PD-1疗法的生物标志物。TMB是每百万碱基中体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数，当体细胞突变后可导致新抗原、蛋白等产生，这些会被机体识别为非自身抗原，进而激活T细胞引起免疫反应，因而TMB越大表示新抗原产生越多，被免疫系统识别性就越大，免疫治疗有效性就越高[11]。Anagnostou等[12]对1 638名患者进行全面TMB评估发现，患者反应率、无进展生存期、总生存期与较高的TMB呈线性相关，并且TMB越高免疫抑制剂疗效越好。Rizvi等[13]对NSCLC患者经帕博利珠单抗治疗后进行测序，发现更高的TMB与患者客观反应率、持久临床效益和无进展生存期密切相关。以上研究提示TMB越高，免疫抑制剂疗效越好。癌症就是DNA基因突变引起的，研究发现，DNA修复基因突变可能会对免疫抑制剂疗效产生影响，主要是因为这些修复基因与细胞毒性相关基因表达、PD-1和PD-L1表达等有关，同时DNA修复中重要机制错配修复基因突变会引起DNA复制错误不断累积，导致体细胞突变[14-15]。有研究显示，帕博利珠单抗在错配修复缺陷肿瘤中有良好的效果，此类患者大部分肿瘤为超突变，导致翻译改变产生功能不活跃蛋白质，致使新抗原产生，引起特异性免疫应答，增强抗肿瘤免疫反应，进而提高免疫抑制剂敏感性[16]。研究发现，抗PD-1抗体在DNA修复基因错配修复缺陷结直肠癌患者中可显著提高疗效[17]。因此，在携带DNA修复基因突变的患者免疫治疗效果更好。

肿瘤组织中PD-L1表达与患者临床应答见存在密切关系。研究证实，PD-L1高表达者对抗PD-1/PD-L1疗法反应更明显，肿瘤细胞中PD-L1外泌进入外周后，PD-L1阳性表达升高患者PD-1单抗疗效更好[18]。说明PD-L1高表达者免疫治疗疗效越好，但由于肿瘤细胞中PD-L1表达是动态变化的，放化疗均对肿瘤PD-L1表达有影响，因而PD-L1高表达可让抗PD-1/PD-L1免疫疗法的患者受益仍有争议，其不能作为抗PD-1/PD-L1疗法效果的唯一预测指标。PD-1抑制剂虽在抗肿瘤治疗中有一定效果，但单独使用效果较差，仅有20%~40%患者可获益。有研究报道，免疫治疗和放疗在抗肿瘤免疫中有潜在协同效应，可提高治疗效率和延长总生存期[19]。一项回顾性分析发现，不论PD-L1表达和治疗线数如何，免疫治疗联合化疗的客观缓解率、疾病控制率和远期生存率均更高[20]。以上研究表明，对于肿瘤患者采用免疫治疗联合化疗治疗效果更具优势。

研究认为，肿瘤细胞PD-L1表达情况联合TIL可有效筛查潜在PD-1/PD-L1单抗疗法获益人群[21]。在TIL阳性和PD-L1阳性肿瘤中，阻断PD-1/PD-L1信号后，可使癌巢内预存肿瘤特异性T细胞重新激活，发挥杀伤肿瘤作用，尤其是对特征为高CD8⁺细胞密度或强干扰素-γ细胞毒性T细胞的肿瘤患者最有效，因此TIL阳性患者免疫抑制剂疗效更优[22]。临床上仍有较高突变负荷肿瘤患者无法获得理想免疫疗效。有研究发现，PD-L1在具有较高TMB和较低ITH的肿瘤中表达较多，同时高TMB且低ITH与单一高TMB相比，与生存时间相关性更高，并且此类患者临床疗效比单一高TMB患者更持久，整体生存率和无进展生存期更高[23]。肿瘤免疫微环境机制复杂，对PD-1抑制剂治疗效果影响因素较多，并且临床研究还发现盆腔淋巴结转移、病理类型、病灶大小等是宫颈癌患者放、化疗治疗效果的影响因素，但是否对PD-1抑制剂疗效的影响还尚不明确。本研究存在一定局限性，如：未对肿瘤标志物如CA125或鳞状上皮抗原等因素进行纳入分析，由于本文为回顾性分析，结果存在一定偏倚。后续需开展多中心、前瞻性试验，并将其他潜在因素纳入，进一步深入分析影响PD-1抑制剂治疗宫颈癌患者疗效的因素。

综上所述，PD-1抑制剂帕博利珠单抗治疗宫颈癌患者的疗效受TMB、DNA修复基因突变、PD-L1表达、治疗模式、TIL、ITH等因素的影响，在免疫治疗过程中可对上述指标进行密切关注，以此来提高PD-1抑制剂治疗效果。

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