目的  研究羌活治疗阿尔茨海默病（AD）的活性成分及其潜在的作用机制，并建立一个能同时测定羌活中5个成分含量的高效液相色谱-串联质谱（HPLC- MS/ MS）法，为阐明其药效物质基础及分子机制的实验研究提供基础。

方法  通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库获取羌活活性成分和作用靶点，GeneCards、人类在线孟德尔遗传（OMIM）及美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库预测AD相关靶点。利用Cytoscape软件构建药物-成分-靶点-疾病可视化网络，借助STRING数据库在线平台构建蛋白互作网络，进行GO功能和KEGG通路富集分析，使用Maestro软件对主要活性成分与关键靶点进行分子对接来验证网络药理学结果。运用HPLC- MS/ MS法同时测定紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素5个成分的含量，采用 XTerra MS C₁₈柱（100  mm×2.1  mm，3.5 µm），以甲醇-水为流动相，梯度洗脱，流速为0.3 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为5  µL，电喷雾离子源，多反应监测正离子模式。

结果  网络药理学共获取13个羌活活性成分及36个抗AD靶点；基因富集分析显示，GO功能条目165个、通路89条（P＜0.05）。分子对接结果表明，羌活的主要活性成分与关键靶点视黄酸X受体结合活性最好。紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素在浓度为69.74~8  472.85、8.51~1 033.89、0.35~37.00、15.42~1 873.27、58.85~7 150.49 ng/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＞0.990  0）。

结 论  初步探究了羌活多成分多靶点多通路抗AD的潜在作用机；建立的HPLC-MS/MS法操作简便可靠、专属性强、重复性好，可用于羌活的质量控制。本研究将为羌活抗AD的药效物质基础研究、作用机制研究、相关制剂的质量控制提供依据。

羌活是伞形科羌活属植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T. Chang的干燥根茎及根，是我国传统中医药体系中常用的重要药材，始载于《神农本草经》，因产于羌地而得名[1]。羌活性温味辛苦，归膀胱、肾经，具有散表寒、祛风除湿和止痛等功能，主要用于风寒感冒头痛、风湿痹痛、肩背酸痛等症[2]。国内外学者对羌活的化学成分进行了系统的研究，分离出的化合物主要有香豆素类、挥发油及萜类、聚烯炔类、酚酸类、生物碱类等[3]。现代药理活性研究发现羌活具有抗炎抗菌[4]、抗氧化[5]、抗病毒[6]、抗癌细胞增殖[7]、解热和镇痛[8]的活性，并且对中枢神经系统[9-10]、心血管系统[11-12]、呼吸系统[13]、消化系统[14]等有显著的影响。

本课题组前期探讨了羌活中的香豆素类成分羌活醇治疗阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的作用机制[9, 15]，但口服生物利用度低，可能会使其活性受到限制。近年来，许多中药采用网络药理学挖掘分析单味中药的活性成分，检索与疾病的作用靶点，探索中药的作用机制，为相关实验及其临床研究提供理论依据，从而达到减缓疾病发生和发展的效果 [16]。本研究利用网络药理学和分子对接技术，预测羌活治疗AD的主要活性成分、潜在作用靶点及信号通路等，探讨其作用机制，为羌活抗AD的机制研究提供参考；同时，推测香豆素类成分可能是其发挥抗AD作用的潜在活性成分，又因质谱技术专属性强等特点，因此，本研究又通过高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法对筛选得到的多种潜在活性成分进行定量分析，建立同时检测5个成分的含量测定方法。

1 材料

1.1 主要仪器

LC-20A 型高效液相色谱仪，包括SIL-20AC 自动进样器和CTO-20A柱温箱（日本岛津）；API 3200MD型三重四级杆质谱仪（美国AB SCIEX 公司）及配备的Analyst MD Software1.6.2 数据采集和分析软件（MultiQuant MD 3.0.2 数据分析模块）；AUW120D型十万分之一电子分析天平和AEL^-160型万分之一电子分析天平购自日本SHIMADZU公司；XK 96-3型微量振荡器（江苏新康医疗器械有限公司）；KQ3200型超声波清洗机（杭州微米派科技有限公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

异欧前胡素（批号：wkq23042509）、羌活醇（批号：wkq22102506）、香叶木素（批号：wkq23042302）、紫花前胡苷（批号：wkq22091312）、佛手柑内酯（批号：wkq22091305）对照品均购自四川省维克奇生物科技有限公司，纯度≥98%；卡马西平（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq23052503，纯度≥98%）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为屈臣氏水。

羌活（批号：220902307）购自河北济鑫堂药业有限公司，经沈阳药科大学路金财教授鉴定为中药羌活，标本（批号：GH2023NR）保存于北部战区总医院药剂科实验室。

2 方法与结果

2.1 基于网络药理学和分子对接探讨羌活治疗AD的作用机制

2.1.1 羌活活性成分及潜在靶点的获取

在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）数据库检索羌活的化学成分，设定筛选条件为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug like，DL）≥0.18，得到羌活潜在活性成分15个，并在此数据库对其活性成分进行靶点预测，其中2个化学成分6'-feruloylnodakenin、coumarin glycoside无靶标蛋白，予以删除，具体见表1。将TCMSP数据库预测到的蛋白靶点名导入UniProt数据库，限定物种为人类（human），将作用人类蛋白名称转换成标准的基因名，共得到55个作用于人类的基因靶点。

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  表格1 羌活中活性成分信息

  Table 1.Information on active ingredients of Notopterygii rhizoma et radix

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2.1.2 AD疾病靶点的预测

以“Alzheimer's disease”为关键词，分别在GeneCards数据库、人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）及美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中在线检索AD相关靶点。其中，GeneCards数据库靶点根据Score值进行排序，Score值越大代表靶点与疾病越相关，并以Score≥10为阈值筛选靶点，最终得到1 443个靶点；OMIM、NCBI数据库分别得到143、1 438个相关靶点。汇总3个数据库得到的靶点并删除重复值，得到2 297个AD潜在靶点。利用Venny 2.1.0在线绘图软件讲获得3个数据库的交集靶点及羌活与AD的交集靶点（即羌活抗AD的作用靶点）进行映射，绘制韦恩图，获得羌活治疗AD的潜在作用靶点36个，具体见图1和表2。

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  图1 韦恩图

  Figure 1.Venn diagram

  注：A. AD靶点的韦恩图；B. 药物靶点-AD相关靶点的韦恩图。

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  表格2 36个羌活治疗AD的潜在作用靶点

  Table 2.36 potential therapeutic targets of Notopterygii rhizoma et radix for AD

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2.1.3 蛋白-蛋白相互作用网络构建

将36个羌活治疗AD的潜在靶点导入STRING 11.5（https://www.string-db.org/）数据库构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。物种类别设置为“Homo sapiens”，网络类型为“full STRING network”，网络边缘的意义为“evidence”，主动交互源全选，阈值为“medium confidence（0.400）”，最大交互数无，网络交互模式为“interacitve svg”，蛋白名称字体大小为12号，隐藏没有相互作用的节点，进行PPI分析，构建PPI网络图（图 2A）。网络中有36个节点，116条边，其中节点表示蛋白，每条边代表PPI关系，线条越多表示两者之间的关联度越大，平均节点度值（degree value，DV）为6.44，平均局部聚类系数为 0.513。将隐藏无连接节点（F10、PRSS1）后的34个潜在作用靶点的PPI网络导入Cytoscape 3.9.1软件进行可视化优化，优化后的网络图（图2B）中节点的颜色和大小与AD靶点的DV成正相关，在PPI网络中颜色越深代表其之间的相互作用关系越强；再应用CytoCNA插件分别以前10名的接近中心性（closeness centrality，CC）、介数中心性（betweenness centrality，BC）、DV得到网络中的3个核心靶点网络图（图3），经3个参数综合筛选得到6个关联度最高的靶点：CASP3、SLC6A4、ESR1、JUN、PTGS2、HSP90AA1，提示这些靶点在整个网络中发挥着较为重要的作用。

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  图2 PPI网络图

  Figure 2.PPI network diagram

  注：A. 初始PPI网络图；B. 优化PPI网络图。

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  图3 核心靶点

  Figure 3.Hub targets

  注：A. DV；B. CC；C. BC。

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2.1.4 “药材-活性成分-靶点-AD”网络构建及网络拓扑学分析

将13个羌活活性成分、34个潜在作用靶点和疾病等信息导入Cytoscape 3.9.1软件进行网络可视化分析，构建“羌活-活性成分-靶点-AD”网络（图4）。网络中节点代表疾病、药物、靶点基因、活性成分；边用来连接疾病与基因、基因与活性成分、活性成分与药物的关系。该网络由49个节点和115条边构成，正方形节点代表活性成分，圆形节点代表潜在靶点，菱形节点代表羌活，箭头形节点代表AD。同一成分可作用于不同靶点，同一靶点也可对应多个成分，表明羌活治疗AD具有多成分、多靶点的特征。利用Network Analyzer功能进行网络拓扑学分析（表3），通过参考节点BC、CC和DV等拓扑学参数对比化合物在网络中的重要性，这些数据越大，说明该节点在网络中更关键。其中β-谷甾醇、香叶木素、珊瑚菜素、异珊瑚菜素这4个成分综合排名靠前，考虑到治疗AD的药物需要具有较好的血脑屏障通透性，因此，将香叶木素排除。综上，β-谷甾醇、珊瑚菜素、异珊瑚菜素可作为羌活抗AD的主要活性成分。

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  图4 “羌活-活性成分-靶点-AD”网络

  Figure 4."Notopterygii rhizoma et radix-active ingredient-target-AD" network

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  表格3 “羌活-活性成分-靶点-AD”网络中的拓扑学数据

  Table 3.Topological data in "Notopterygii rhizoma et radix-active ingredient-target-AD" network

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2.1.5 生物功能预测

将羌活的潜在作用靶点录入用于生物学信息注释、可视化和集成发现的DAVID（Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery）数据库中，Identifier设为“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，物种为“Home sapiens”，列表类型为“Gene List”，提交目录，对GO功能和KEGG通路进行富集分析，背景为“Home sapiens”，点击“Functional Annotation Tool”后得到分析结果，下载“Gene Ontology”项下的“GOTERM_BP_DIRECT”、“GOTERM_CC_DIRECT”、“GOTERM_MF_DIRECT”以及“Pathways”项下“KEGG_PATHWAY”的表格，数据筛选标准为“P＜0.05”。GO功能分析获得165个GO功能条目，包括89个生物过程（biological process，BP）、34个细胞组分（cellular component，CC）、42个分子功能（molecular function，MF），按P值大小分别选取排名前10的条目绘制GO功能条形分析图（图5）。BP主要涉及对外源性刺激的反应、对雌二醇的反应、对脂多糖的反应、细胞凋亡的调节、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的正调节、磷蛋白磷酸酶活性的正调控等；CC主要包括大分子复合物、神经元细胞体、质膜、突触后膜、突触后模、髓鞘、胱天蛋白酶复合物等；MF主要有一氧化氮合酶调节活性、神经递质受体活性、酶结合等。KEGG通路富集分析共得到89条通路，按P值大小取前20名绘制气泡图（图6），涉及癌症途径、神经退行性变的途径-多种疾病、脂质与动脉粥样硬化、钙离子信号通路、化学致癌-受体激活、肺结核、人类免疫缺陷病毒1型感染、人巨细胞病毒感染、帕金森病、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、雌激素信号通路、cAMP信号通路、5-羟色胺能突触、乙型肝炎、胆碱能突触、苯丙胺成瘾、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、肺小细胞癌、唾液分泌、细胞凋亡-多种物种。

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  图5 GO功能富集分析

  Figure 5.GO function enrichment analysis

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  图6 KEGG通路富集分析

  Figure 6.KEGG pathway enrichment analysis

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2.1.6 羌活活性成分与关键靶点的分子对接

根据生物功能预测结果，选取“羌活-活性成分-靶点-AD”网络中度值较大的3个作用靶点（RXRA、SLC6A4、TGFB1）与3个DV较大的有效成分（β-谷甾醇、珊瑚菜素、异珊瑚菜素）进行分子对接。在PubChem数据库下载活性成分3D结构的SDF文件，再从蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）中获得靶点的PDB文件。通过Maestro 11.5软件对蛋白结构进行删去配体分子和水分子、补全不完整的残基、加氢等优化处理，对化合物规定相应pH范围和立体构型等。将准备好后的小分子配体和蛋白在Mmaestro中通过XP（extra precision）来“Ligand docking”，以“Docking score”来衡量结合活性（表4），再采用“Ligand Interaction”对对接结果进行可视化处理，产生2D作用图（图7）。通常通过结合能评估受体和配体之间的亲和性，一般结合能≤-5.0 kcal/mol时，配体和受体结合较好，结合能≤-7.9 kcal/mol时，说明配体与受体强烈结合[17]。结果显示，异珊瑚菜素、珊瑚菜素均与视黄酸X受体具有强烈的结合，但与靶点自身配体相比结合能较弱，β-谷甾醇与视黄酸X受体未对接成功，考虑是由于β-谷甾醇结构大无法进入活性口袋。3个成分与SLC6A4和TGFB1的结合能都较弱，但异珊瑚菜素与SLC6A4和TGFB1、珊瑚菜素与TGFB1的结合比其自身配体的结合活性还强。选取每个化合物与靶点自身配体的结合能之比最高的蛋白质进行可视化分析，可视化图（图7）提示活性成分与靶点之间存在氢键、π-π共轭等分子间作用力，其中分子与蛋白靶点产生作用的主要基团是氧原子。

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  表格4 羌活活性成分与对应关键靶点的最低结合能

  Table 4.Minimum binding energy of active components of Notopterygii rhizoma et radix and key targets

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  图7 羌活活性成分与关键靶点的相互作用图

  Figure 7.Interaction diagrams of active components of Notopterygii rhizoma et radix and key targets

  注：A~C分别为Phellopterin与视黄酸X受体、Cnidilin与SLC6A4、Phellopterin 与TGFB1的分子对接图。

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2.2 基于HPLC-MS/MS法测定羌活中5个成分的含量

通过网络药理学筛选得到的13个成分里多数为香豆素类成分，而本课题组前期作为抗AD成分研究的羌活醇因OB差未被纳入，因此，选择了其中的紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素5个潜在活性成分进行了含量分析。

2.2.1 色谱条件

XTerra MS C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，3.5  µm）；流动相为甲醇（B）-水（A）为流动相，梯度洗脱（0~5 min，53% B；5~5.2 min，53%→80% B；5.2~7 min，80%→70 % B；7~9 min，70 %→60% B；9~13 min，60%→53% B）；流速为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为5 µL。

2.2.2 质谱条件

采用电喷雾正离子源，选择多反应监测模式进行离子扫描，干燥气和鞘气均为高纯度氮气，雾化气压为50 psi，加热气压为55 psi，气帘气压为30 psi，喷雾温度为500 ℃，喷雾电压为5 500 V。质谱参数见表5。

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  表格5 羌活中5个成分的质谱参数

  Table 5.Mass spectrometry parameters of 5 components in Notopterygii rhizoma et radix

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2.2.3 对照品储备液的制备

精密称取上述5个对照品适量于100 mL量瓶中，加甲醇溶解，摇匀并定容至刻度，得浓度约为40 μg/mL对照品储备液。

2.2.4 供试品溶液的制备

取羌活粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声处理（功率：250 W，频率：50 kHz）30  min，放冷至室温，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2.5 线性关系考察

精密量取“2.2.3”项下的紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素各对照品储备液，用甲醇配得浓度依次为5  648.57、689.26、224.82、1 248.85、4 767.00  ng/mL的混合对照品，再用甲醇按不同比例稀释后，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以对照品的浓度为横坐标（X，ng/mL）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程，结果见表6。

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  表格6 各成分的线性关系考察

  Table 6.Investigation on the linear relationship of various constituents

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2.2.6 精密度试验

取“2.2.3”项下对照品储备液，用甲醇配得混合对照品溶液，紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素浓度依次为5  648.57、19.15、6.24、104.07、2  383.50  ng/ mL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录色谱峰面积，计算得紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素峰面积的RSD分别为3.11%、3.57%、3.47%、2.80%、2.92%（n=6），表明该仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验

取同一羌活样品适量，按“2.2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素的平均含量分别为5.590、0.035、0.020、0.130、4.340 mg/g，RSD分别为3.39%、4.65%、5.62%、3.29%、2.22%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验

取供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、12、18、24 h进样测定，计算得紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素峰面积的RSD分别为1.70%、4.24%、5.04%、5.79%、3.86%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.9 加样回收率试验

精密称定6份已知5种成分含量的羌活粉末，每份约0.5 g，根据样品中各成分含量，按1 ∶ 1比例精密加入相应对照品，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素的平均回收率分别为99.03%、96.73%、99.61%、99.26%、99.54%，RSD分别为4.47%、3.94%、3.11%、3.16%、2.93%（n=6），表明该方法准确性良好。

2.2.10 样品含量测定

取3份羌活药材粉末，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得样品中紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素的平均含量分别为5.556、0.035、0.020、0.129、4.321  mg/g（n=3）。

3 讨论

3.1 基于网络药理学与分子对接的抗AD作用机制预测分析

AD是一种常见的神经退行性疾病，目前关于AD发病机理的假说主要有胆碱能假说、神经炎症假说、β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）级联假说、Tau病理假说等。中药含有多种有效成分，具有多靶点、多层次、多通路的治疗优势。近年来，有报道通过数据挖掘探讨了对AD具有防治作用的潜在中药，发现了羌活含有多个潜在成分，有望成为防治AD的最具潜力中药[18]。中药网络药理学从系统层面上分析中药单味药或方剂的作用机制，全面分析复杂网络中的调控机制[19]。因此，本文基于网络药理学方法筛选了羌活中抗AD的活性成分，预测了AD相关靶点，构建了“羌活-活性成分-靶点-AD”可视化网络和用于分析羌活治疗AD潜在靶点的PPI网络，并进行了生物功能预测，表明羌活在治疗AD方面具有临床前景。

本研究中，在羌活中筛选得到了13个活性成分，并通过分子对接比较了主要活性成分与关键靶点的作用情况。分子对接是研究分子间（如药物与靶标）相互作用，预测其结合模式和亲和力的一种理论模拟方式，对接分数用来评估化合物对特定蛋白的结合能力，分值越低代表两者之间相互作用越强，其值的高低对于药物设计和分子相互作用研究都非常重要。β-谷甾醇可以很好地与多个关键靶点相结合，被认为是最主要的生物活性成分。β-谷甾醇是具有天然生物活性的甾体化合物中最有代表性的一种，参与植物细胞内各种生命活动[20]，且有文献报道β-谷甾醇具有抗炎、调节免疫系统、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗衰老等活性[20-23]，能影响凋亡、炎症等多种信号通路[24-25]，可用于治疗神经退行性疾病、心血管疾病等[26-27]。此外，在已报道的网络药理学研究中，β-谷甾醇也被发现是一种治疗AD的重要化合物，参与多药协同作用[28]。珊瑚菜素主要是可以从红藻中提取得到，其他植物中也含有，如白芷、羌活、防风，其生物活性是可抑制由白细胞介素-4介导的炎症反应[29]。紫花前胡苷最初是从当归根中分离出来，Dong等[30]证实紫花前胡苷通过增强胆碱能信号传导来逆转东莨菪碱诱导的认知功能障碍。但β-谷甾醇药理作用多样，且在植物中广泛存在，所以香豆素类成分更有望成为治疗AD的潜在药物。

细胞内的分子过程是由多种蛋白协同作用完成，这种相互作用形成了PPI网络，网络中某个蛋白的异常将会导致一系列的功能异常，进而引发疾病[31]。本研究构建了羌活活性成分的相关靶点与AD疾病靶点的PPI网络，结果显示CASP3、SLC6A4、ESR1、JUN、PTGS2、HSP90AA1蛋白互作关系最多的靶点，可能是羌活治疗AD的关键靶点。免疫、炎症变化及其相关的氧化、亚硝基化是神经退行性病变的关键病理生理机制，PTGS2的转录是由与几种炎症信号级联相关的转录因子启动的，且在晚期AD患者中表达异常[32-34]。在AD发展过程中，雌激素可以减轻神经元损伤，加强突触传递等，ESR1是雌激素敏感组织上激素反应的重要介质，可以通过调节血清素受体的数量和功能、控制神经递质来激活神经元[35-36]。抑郁症在AD患者中普遍存在，大脑通过调节SLC6A4甲基化程度来改善负面情绪，进而降低患抑郁症的风险[37-38]。Aβ在诱导细胞凋亡和AD发病机制中起着重要作用，Aβ积累会导致细胞色素C释放、CASP3激活，进而使突出退化、神经元死亡[39]。HSP90AA1是热休克家族的成员，参与调节AD中p-Tau的稳定和功能[40]。对比上述报道发现，本文所得羌活治疗AD的关键靶点确实在AD的发生发展中起着重要作用，研制靶向关键靶点的药物能更有效防治AD。

为了更充分地了解羌活治疗AD的生物学过程和可能作用的信号通路，将得到的羌活治疗AD的潜在作用靶点进行GO功能和KEGG通路分析。其结果显示羌活治疗AD的作用途径主要与神经退行性疾病途径-多种疾病、凋亡-多物种、5-羟色胺能突触、钙信号通路、胆碱能突触等相关。据报道，5-羟色胺受体2A、5-羟色胺受体2C和5-羟色胺受体6与AD有关[41]，且5-羟色胺受体6拮抗剂可能刺激轴突生长并抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路[42]。乙酰胆碱酯酶是一种神经递质受体，在AD的治疗中也发挥着重要作用，比如乙酰胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐和加兰他敏可以稳定或减缓认知功能的下降[43]。Ca²⁺在神经元发育、突触传递和许多神经元代谢途径的调节中发挥重要作用[44]。这些报道均证明了5-羟色胺能突触、钙信号通路、胆碱能突触等是防治AD的重要信号通路，可通过多条途径来影响AD的病理进程。

3.2 5个潜在活性成分的含量测定

经TCMSP数据库发现，羌活中的香豆素类成分主要有紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素等。本研究通过HPLC- MS/ MS法得到了可能具有抗AD作用的香豆素类成分在羌活中的含量，为后续羌活中活性成分研究提供依据。含量测定结果表明，不同香豆素类成分在羌活中的含量差异较大，紫花前胡苷和异欧前胡素是其他成分的几十倍至几千倍不等，含量的多少不代表活性的大小，后续可对其他成分的抗AD活性进行验证，如得到活性较突出的化合物，可通过药物化学的手段来大量合成，结构优化改善不足之处，以期得到抗AD的新药。

综上所述，本研究通过网络药理学方法对羌活中的成分和靶点进行了系统分析，发现了其治疗AD的潜在作用靶点，并探讨了相关信号通路，但对预测靶点和生物学途径需进一步实验验证。本研究还建立了HPLC-MS/MS法同时测定羌活中紫花前胡苷、佛手柑内酯、香叶木素、羌活醇、异欧前胡素的含量，该方法操作简便可靠、专属性强、重复性好，可用于羌活药材中多种化学成分的研究。

1.蒋舜媛, 周毅, 孙辉, 等. 羌活属药用植物基源考证[C]. 生态文明建设中的植物学: 现在与未来-中国植物学会第十五届会员代表大会暨八十周年学术年会论文集-第4分会场: 资源植物, 2013: 90.

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