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三七总皂苷由于具有良好的抗凝、改善血流动力学等药理作用，被广泛用于临床心脑血管疾病的治疗。本文整理分析了三七总皂苷的生物合成途径，对其中的关键酶如法尼基二磷酸合成酶、鲨烯合成酶、鲨烯环氧酶、达玛烯二醇合成酶、氧化鲨烯环化酶、超基因家族氧化酶、葡萄糖苷转移酶在表达调控中的作用进行归纳总结，并综述了异源人工合成途径的构建及生物合成调控方面的研究进展，以期为三七总皂苷的生物合成方法优化提供参考。
三七（notoginseng radix）为五加科人参属Panax L.植物三七[Panaxnotoginseng (Burk.) F. H. Chen]的干燥根，具有散瘀止血、消肿止痛的作用[1]。三七总皂苷（panaxnotoginseng saponins，PNS）作为主要活性成分，约占三七中成分含量的12%，药理学研究发现其在抗凝、抗炎、神经元保护等方面有着良好药效[2]。研究发现，PNS可通过晚期糖基化终末产物（advanced glycation end product，AGE）-受体（advanced glycation end product receptor，RAGE）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶（Akt kinase，Akt）信号通路发挥抗凝和抗板作用[3-4]，显著降低血清炎性因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6水平，在心脑血管疾病患者中发挥抗炎作用[5-7]。此外，PNS可以透过血脑屏障，调节帕金森患者体内氨基酸水平，同时改善海马组织形态，减少神经细胞凋亡，促进神经元修复 [5-6]。动物和细胞研究也证实PNS在抗肿瘤、降脂、促进骨损伤修复等方面也显示出了良好的药理作用。
PNS相关制剂已广泛用于临床心脑血管疾病的治疗，但天然药物三七产量受自然气候、病虫害、生长年限等因素影响较大，且PNS在天然药物中含量通常较低，提取工序复杂繁琐，需要较多的人力物力，现有的传统栽培育种方式尚未能实现快速提高三七中皂苷的含量，导致PNS产量和价格不稳定，因此亟需开发人工合成途径以满足日益增加的临床使用需求。本文总结了近年来PNS的生物合成进展，以期为相关中成药制剂的工艺优化提供参考。
1 PNS生物合成途径的关键酶
目前已从三七植物中陆续发现以三萜皂苷为主的皂苷类成分达80余种[8-9]，三萜皂苷主要由原人参二醇（protopanaxadiol，PPD）型皂苷和人参三醇（protopanaxatriol，PPT）型皂苷[10]组成。
三萜皂苷的生物合成途径如图1所示[11-17]，限速酶酶有法尼基二磷酸合成酶（farnesyl diphosphate synthase，FPS）、鲨烯合成酶（squalene synthase，SS）、鲨烯环氧酶（squalene epoxidase，SE）、达玛烯二醇合成酶（dammarenediolsynthase，DS）、氧化鲨烯环化酶（cycloartenol synthase，CAS）、超基因家族编码的含有血红素的氧化酶CYP450和糖苷转移酶（glycosyl transferases，GT）等。
1.1 法尼基二磷酸合成酶
FPS含有底物烯丙基焦磷酸（allyl pyro-phosphate，APP）及异戊烯焦磷酸（isopentenyl pyro-phosphate，IPP）的结合位点[18]，可催化IPP和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）以1,4头尾连续缩合反应，形成萜类前体物质法尼基二磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）。已有研究表明，FPS的氨基酸序列在三七、人参、西洋参、大戟等多种植物中比较保守，长度在342个或357个aa左右 [19-20]。吴耀生[21]运用系统发育树的方法对三七种FPS与人参、积雪草进行多序列比较，结果表明，两者与三七种FPS之间碱基同源性分别为99%和95%。周秘等[22]通过对FPS相对表达量与刺五加叶中皂苷产率的相关性研究，发现FPS相对表达量越高，刺五加叶子中皂苷产率越高。Kim等[23]通过毛根农杆菌（Agrobacteriumtumefaciems）的转化，发现与野生型比较，FPS基因的过表达可以使人参皂苷含量从4.81%增加到11.5%的水平，这也说明FPS参与了三萜皂苷类物质的生物合成过程，并起到重要作用。现有研究表明，过表达FPS可显著提高人参、积雪草等植物中三萜皂苷的含量，该策略是提高人参皂苷产量的一个重要因素[24-25]。
1.2 鲨烯合成酶
SS酶能够促进两分子FPP发生缩合反应生成鲨烯，随后通过系列催化作用转化为三萜类物质或植物甾醇，在植物次生代谢过程中扮演着不可或缺的角色。该酶作为三萜合成途径的核心催化剂，对植物甾类物质的生物合成具有决定性影响。SS在不同植物间表达具有多态性，通过分析目前所具有的研究成果，三七、甜椒、人参、青蒿以及黄芪的ss氨基酸序列相对固定并高度相同，其长度处于409~415 aa[26-29]。大量文献研究显示，SS的表达量与皂苷产量呈显著的正相关关系，其表达水平决定了皂苷产量，提高SS的转录水平有利于提高皂苷产量，说明SS在三七皂苷生物合成中起重要作用[30- 32]。
1.3 鲨烯环氧酶
SE是关键限速酶之一，可将氧化鲨烯催化为2,3-氧化鲨烯。Garaiová等[13]发现SE抑制剂会导致酿酒酵母生长缺陷，导致鲨烯堆积，证明SE与鲨烯的转化有关。李坤等[33]从三七根中提取得到了编码长度为1 648 bp、包含537个氨基酸残基的SE基因cDNA序列。通过对氨基酸序列和核苷酸序列对比，可发现三七与人参中SE的同源性达到97%。
Han等[34]研究发现了人参三萜皂苷和甾醇生物合成中的PgSE1基因对人参皂苷的合成起到正调节，同时导致根中PgSE2基因和CAS显著上调，使甾醇产量显著增加。牛云云等[35]从三七中筛选得到2类不同类型的SE编码基因PnSE1和PnSE2，通过生物信息学研究推测，PnSE1基因广泛存在于三七植物中，催化三萜皂苷的生物合成；PnSE2基因主要在花中表达，参与甾醇合成。目前的研究认为，三七、人参等植物中存在2种表达模式相似的SE同源基因，分别调控三萜皂苷和甾醇的合成，二者的表达水平是影响三萜皂苷产量的重要因素之一。
1.4 达玛烯二醇合成酶
DS的主要作用是催化2,3-氧化鲨烯环化为达玛烯二醇。在DS氨基酸水平上，三七与人参和西洋参具有较高的同源性，分别为98.7%和99%。
Sun等[36]从人参根cDNA噬菌体文库中得到DS基因，研究结果表明，表达重组的DS蛋白可以提高达玛烯二醇的表达水平，同时也表明DS在人参皂苷的生物合成中具有重要功能。Han等 [37]利用RNA干扰技术沉默人参中的DS基因，结果工程菌株的人参皂苷产量降低84.5%。有文献利用茉莉酸甲酯刺激上调植物中DS的表达，发现细胞中三萜皂苷的产量也随之升高[38]，证实了DS在三萜皂苷生物合成途径中起到关键调控作用。
1.5 氧化鲨烯环化酶
CAS与DS同样作用于2,3-氧化鲨烯，可催化其向甾醇的合成转化，生成环阿屯醇，从而间接影响三萜皂苷的生物合成[39]。
孙颖[40]利用CatewayTM技术，构建RNA干扰沉默载体，利用T-DNA介导法转化至三七基因组中，抑制CAS基因的表达，阻断或降低植物甾醇的合成，进而提高三七皂苷的合成。何沐阳[41]利用RNA干扰技术沉默人参细胞中的CAS核心保守序列，发现相较于对照组，突变体发根系的环阿屯醇量降低了80.64%，而达玛烯二醇量得到提高；植物甾醇量相较于对照平均降低53.61%，而人参皂苷产量有所增加；用高效液相色谱法分析检测显示，CAS基因抑制的突变体发根系中人参皂苷Rg1、Re和Rb1量比对照组均有不同程度的升高。
1.6 超基因家族氧化酶
CYP450是一类亚铁血红素-超基因家族氧化酶[42]，位于三萜皂苷合成代谢途径的下游，其表达量与三萜皂苷的合成量呈正相关[43]。
Luo等[44]利用高通量测序技术，获得了15个来自三七根的全长CYP450。其中Pn00158及Pn02132转录本分别与人参CYP716A47、大豆CYP93E1的氨基酸序列高度同源，推断二者很可能是参与PNS合成的候选CYP450。吴鹏等[45]运用RT-PCR分析了刺五加中CYP450基因在不同产地、器官及不同发育期及MA刺激条件下的表达差异。结果表明，CYP450基因的表达与总皂苷的含量呈极高度相关。Han等[46]首次验证了CYP450家族中CYP716A47基因可催化工程菌体内原人参二醇的生物合成。Chen等[47]应用高通量454GS FLX测序技术挖掘人参、西洋参和三七含有大量的CYP450基因，猜测这可能是在生物合成三萜皂苷类成分过程中最重要的一种酶。
1.7 葡萄糖苷转移酶
GT基因cDNA序列在三七、狸藻、拟南芥、玉米等植物中发现，长度为416~1 036 aa，这是因为gt通过糖基转位于皂苷元合成的最后一步（即体内合成）催化皂苷元的生成[48]。
向丽等[49]通过分析各紫锥菊转录组结果得到，有3个三七糖基转移酶基因与蒺藜苜蓿中三萜GT基因UGT73K1和UGT71G1非常接近，认为其可能参与紫锥菊皂素的最终生成，发挥催化作用。修乐山等[17]发现茉莉酸甲酯处理可显著提高刺五加中UGT基因的表达量。不同产地、器官和时期刺五加UGT基因的表达量与总皂苷产量有较大的变化，但UGT基因的表达量与总皂苷产量有很好的相关性，即两者同时增加或减少。结果表明，UGT作为刺五加合成总皂苷的关键酶，其表达水平决定了刺五加中总皂苷的产量。
2 PNS人工细胞合成体系的构建
2.1 底盘细胞的选择和优化
研究人员在分析了三七皂苷的合成途径以及发掘三七中一些重要的合成酶基因的基础上，运用合成生物学手段证明了微生物细胞不能产生PNS，构建获得了三七、人参等植物中三萜皂苷人工细胞合成体系[50-51]。
目前，大肠埃希菌模式微生物底盘宿主仍是当前三萜皂苷及其前体物质的主要合成宿主，包括：原核细胞如大肠杆菌（E.coli）和枯草芽孢杆菌（B.subtilis）；真核细胞如酿酒酵母（S.cerevisiae）、毕赤酵母（P.pastoris）、解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）等。
2.1.1 原核细胞宿主
以生长速度快、遗传背景简单、使用方便为优势的大肠埃希菌成为目前合成天然产物的典型模式微生物。大肠杆菌中天然存在甲基赤藓糖醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途径，由于其特点，研究人员可以通过这种底盘细胞生产合成三萜皂苷途径中的重要中间体——角鲨烯。张亦男等[52]以E.coli作为宿主细胞对鲨烯合酶进行了异源表达，同时增加MEP途径相关合成酶和异构酶的表达，从而采用大肠杆菌作为底盘细胞生产角鲨烯，产率达到73.88 mg/L，发酵条件最优化[53]。然而大肠杆菌体内不具有MVA代谢通路，Zhu等[54]基于大肠杆菌底盘细胞MVA代谢途径，实现外源合成重要中间体衍生物法尼烯，并且引入了关键参茸皂苷合成通路中的C阶段成分。他们进一步优化不同组分酶反应次序来实现法尼烯的合成，获得1.1 g/L的较高收率。
天然的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）具有无内毒素产生、低营养物质要求、高密度高效发酵、高外源蛋白质生产能力等优点，因而备受食品、药用产业的青睐并已应用于生产很多菌产制品，如枯草芽孢杆菌。Song等[55]利用不同来源筛选及分离了鲨烯合酶并将其引入枯草芽孢杆菌宿主细胞系统建立了新的角鲨烯生物合成途径，通过改善培养条件和代谢途径，他们将鲨烯的产量从枯草芽孢杆菌宿主细胞中增加至7.5 mg/L。然而，该宿主细胞原核系并没有产生关键酶CYP450，是制约其进一步合成三萜皂苷的重要因素。
2.1.2 真核细胞宿主
至今，酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和解脂耶氏酵母是公认的3个最常用的三萜皂苷人工细胞合成系统的真核底盘细胞。真核底盘细胞在复杂天然产物三萜皂苷人工细胞合成系统上，相对于原核底盘细胞，具有不可替代的独特优势：其中携带有自身的MVA途径，可以有效地进行前体化合物的IPP、DMAPP、角鲨烯等的合成；同时，得益于细胞内丰富的膜状体系及翻译后修饰，能够使得环化酶、细胞色素P450等氧化酶作用更加高效。
作为一种优质的底盘细胞，除具有普通酵母底盘细胞的功能之外，毕赤酵母还可以很容易地使异源基因整合在其染色体上，而且改造后的细菌具有高效遗传稳定性，所以是首选的底盘细胞之一。Zhao等[56]已经成功地建立了毕赤酵母体内生产人工皂苷D（达玛烯二醇-II）的生物合成途径，这种生产途径使用的是两种关键酶，即达玛烯二醇-II合酶和角鲨烯环氧酶的自我组合方法。当利用这种方法时，获得了最高的0.10 mg/g产品产量，该工程菌株能在48 h内获得这种产物。
解脂耶氏酵母具有无毒、可以在非极性环境中生长和具有高效生物产脂能力等特点，它现在已成为生产多种萜类、黄酮类、聚酮类等化合物的发酵工程微生物。Wu等[57]将原人参二醇合成代谢途径构建在解脂耶氏酵母外源体上，使原人参二醇达到300.67 mg/L的产率。Li等[58]用外源性MVA途径中的核心基因进行过表达，合成出了将细胞色素p450单加氧酶和辅酶还原酶等融合为蛋白质的一个基因，并且可以通过工程生物合成产生人参皂苷Compound K。所得产品的浓度能够达到161.8 mg/L。
酿酒酵母是一种具备相对简单基因改造操作、低生产成本的典型真核改造模型体系，在许多生物通路的应用非常广泛，特别是用于原生苷，如三萜皂苷类化合物的生产。酵母细胞平台所生产的三萜皂苷类物质主要包括达玛烯二醇、原人参二醇、原人参三醇、人参皂苷Compound K、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg3、部分人参皂苷糖基化衍生物[59-63]。
选育并改造底盘细胞是三萜皂苷及其他化合物异源生产的重中之重，底盘细胞的改造是建立三萜皂苷生物合成通路的关键环节。该技术主要包括底盘细胞的基因组工程及染色体工程等，如基因工程删减基因片段和密码子压缩技术 [64-65]。其过程主要去除那些可有可无的基因，以增加自身代谢速率和能源利用效率，可大大提高底盘细胞生物合成途径的预测性和可控性，从而达到高效合成产物的目的。
2.2 三七皂苷生物合成途径的调控
2.2.1 提高三萜皂苷合成途径的代谢流
因为外源三萜皂苷的生物合成过程会与内源形成的三萜皂苷生物合成过程形成竞争，所以增加前体物质的浓度能够保证基础内源性代谢过程的稳定性，也能够提高其异源性三萜皂苷形成的能力，有利于增加所合成产品的产量。另外也可通过改变关键基因的启动子强弱或者改变其拷贝数等方式来优化其目标过程，利用新的基因挖掘技术、酶工程或蛋白质工程等技术来提高三萜皂苷产生过程所需酶的酶活性，进而提高目标产物的形成。以上常规的调控手段也可相互结合应用于提高目标产品的产量。
Wu等[57]通过基因修饰技术提高解脂耶氏酵母内转醛醇酶和转酮醇酶活性，扩大细胞质内的乙酰辅酶A需求，从而提高了原人参二醇产量达88.73 mg/L。Wang等[63]采用类似的方法，在UGTPg45中添加多个delta位置点的复制以增大UGTPg45的表达量，从而把原有人参皂苷Rh2生产能力35.7 mg/L提高到52.7 mg/L，并用一个非常强的启动器—UAS-TDH进一步促进，最终成功获得了人参皂苷Rh2产量高达74.7 mg/L的表达。Song等[55]通过对UGT51进行半理性的设计，有效提高了UGT51的催化效率，将其应用于人工细胞合成人参皂苷Rh2过程中效果显著，最终可将Rh2产量翻番至2.90 mg/L，是原始菌株的900多倍。Zhang等[66]通过在酿酒酵母体内过量表达关键酶基因保证前体供应，与从光果甘草新挖掘出的β-香树脂醇合成酶进行过量表达，这样在酿酒酵母细胞内β-香树脂醇作为人参皂苷ro前体物的产量提高65倍。
2.2.2 下调底盘细胞内源竞争途径
为了提高底盘细胞生产目标产物（三萜皂苷）的质量和产率，可以将一些不需要或不需要合成的内源性代谢路径限制、切断，从而增加它们形成三萜皂苷所需的重要代谢通路的输入资源和能量，从而促进目标产物的合成产能。其中FPP（前一步合成功能性目标产物三萜皂苷的前体物质）、角鲨烯、2,3-氧化角鲨烯等都是甾醇类物质合成的必经元素，参与调控甾醇类物质合成的核心酶基因，对于维持底盘细胞基本的生命活动影响比较大，不能完全灭绝该元素，所以不存在削减底盘细胞与目标产物竞争的影响。研究的手段主要为调控甾醇合成通路上的关键酶基因，减少该条竞争性链路对目标产物合成的阻碍，从而实现优化产物的目标。有研究构建了利用底盘细胞的羊毛甾醇合酶催化2,3-氧化鲨烯转化为麦角固醇从而在巴斯德毕赤酵母中合成达玛烯二醇-II的合成途径[56]。通过改变麦角固醇竞争通路启动子的起始启动子为硫胺素抑制型启动子，从而增加了达玛烯二醇-II的产量3.6倍。而对于对基础细胞只进行轻微干扰或者不产生影响的竞争内部通路，可以直接剪切竞争通路以提高基础细胞中人参皂苷目标产物的产量。Kim等[67]通过构建酵母产酒过程中建立一个合成初始人参皂苷二醇的竞争路径，剪切了底部细胞中抑制FPP向法尼醇转换的LPP1和DPP1基因，因此减少了底物，也保证了中间材料FPP的足够供应，同时还删除了一些氧化还原酶基因使其更好地利用还原型辅酶II，从而大大提高了PPD的产量超过了11倍。
3 结语
PNS及其制剂因良好的药理活性，已被广泛用于临床心脑血管疾病的治疗。随着PNS的临床需求日益增大，生物合成PNS成为研究热点之一。微生物具有卓越的生物合成能力，可以产生广谱代谢物，已被广泛开发用于生产各种化学品、多聚物前体和药用活性分子的合成。
目前对PNS合成途径关键酶的调控机制尚未完全明确，仍需进一步对关键酶的作用方式和调控网络深入探索。尽管生物合成途径已经为高校生产PNS提供了新思路，但目前仍处于研究阶段，产生提升有限且未实现大规模生产。我们期望持续不断开发合成生物学工具和基因组编辑策略促进底盘菌株的构建，应用于合成生物学的研究，促进PNS的合成。针对甲羟戊酸途径强化的底盘菌株，构建分层动态调控系统，用于产物的合成、调控研究。一方面动态上调合成途径中的限速步骤，解除合成限速瓶颈，另一方面在发酵后期下调细胞生长，引导更多碳流量转向产物合成，同时构建优势小基因组底盘菌株，自上而下删减染色体片段。构建优质微生物底盘菌株用于高附加值化合物的合成，具有广阔的前景。
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