目的  建立HPLC法测定戊二酸酐中有关物质的方法。

方法  采用HPLC法，色谱柱：Waters Symmetry C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（3 ∶ 97）；流速：0.9 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：20 µL；检测波长：210 nm。

结果  戊二酸酐中丁二酸、己二酸及未知杂质均能有效检出，丁二酸、己二酸、戊二酸的线性范围分别为5.925~59.251 μg/mL（r=0.999 6）、6.210~62.100 μg/mL（r=0.999  7）、5.110~8 516.000 μg/mL（r=0.999 9）；丁二酸和己二酸的平均回收率分别为100.92%（RSD=0.86%）和105.89%（RSD=2.99%）（n=9）。

结论  该方法专属性强、灵敏度高、准确度好，可用于测定戊二酸酐的有关物质。

戊二酸酐又称为胶酸酐，针状晶体，分子式为C₅H₆O₃，易溶于氯仿、乙醚、丙酮、甲苯和四氢呋喃等，吸水后转化为戊二酸，需于密闭、干燥的环境下储存[1]。在医药原料合成过程中，戊二酸酐常作为酰化试剂[2]，通过参与酰化、酰胺化、脱水缩合等多种反应，在原料药中引入羰基结构。文献检索显示，在依折麦布、来那度胺、盐酸苯达莫司汀、普巴瑞林等多种医药原料的合成过程中，戊二酸酐均可用作起始物料[3-6]。目前文献资料中多采用滴定法对其含量进行测定[7-8]，药典中未收载戊二酸酐有关物质的测定方法，也未检索到戊二酸酐中有关物质测定的相关文献。对戊二酸酐中有关物质进行测定，对于该物料、原料药终产品及相关制剂的质量控制有重要意义[9- 11]。本文介绍了一种HPLC法测定戊二酸酐中有关物质的方法，并对杂质含量的限度进行了规定。

戊二酸酐通常由戊二酸脱水制备，而戊二酸多由混合二元酸提纯而来[12-13]，在戊二酸酐制备过程中，其他二元酸如丁二酸、己二酸脱水生成丁二酸酐、己二酸酐，因此，在进行戊二酸酐有关物质测定时，需对戊二酸酐中可能存在的丁二酸酐、己二酸酐等杂质进行控制。戊二酸酐及相关杂质进行液相测定时，容易与水发生反应生成戊二酸及相应杂质的酸，不能以酸酐的形式存在。根据这一特点，将戊二酸酐及其有机杂质水解为戊二酸及相应杂质的酸（如丁二酸、己二酸）后，再进行测定和控制。对于戊二酸酐中本身存在的戊二酸，在此方法中计为戊二酸酐水解后的主成分，在后续合成步骤生成的中间体或终产品原料中，可对戊二酸以及未完全反应的戊二酸酐进行进一步控制，以保证终产品的质量。因此本文自拟色谱条件，建立了HPLC法测定戊二酸酐的有关物质，将戊二酸酐水解后以酸的形式进行测定，并采用对照品外标法测定其水解产物中可能存在的杂质丁二酸、己二酸，作为已知杂质定入质量标准，并规定了其他单个杂质及总杂质限度。方法学验证结果表明，该方法专属性强、灵敏度高、准确度好，能有效地对戊二酸酐中的有关物质进行控制。

1 材料

1.1 主要仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪和2998 PDA检测器（美国Waters公司）；XS205 DU型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 主要药品与试剂

戊二酸酐（宜兴市联阳化工厂，批号：20180203、20180228、20180306、20180512）；丁二酸（批号：L6B0R19，纯度98.95%）和己二酸（批号：LH40R97，纯度：99.84%）购自北京百灵威科技有限公司；磷酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C₁₈柱（250  mm  ×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（3 ∶ 97）；流速：0.9 mL/min；柱温：30 ℃，进样体积：20 µL；检测波长：210 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

分别取丁二酸和己二酸各约30 mg，精密称定，置同一50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液1 mL，置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取样品约80 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，室温反应80 min后，作为供试品溶液。

2.2.3 测定方法及限度

精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至20 min。供试品溶液的色谱图中如有与丁二酸、己二酸保留时间一致的色谱峰，按外标法计算，丁二酸、己二酸均不得过0.15%，其他单个杂质按面积归一化法计算不得过0.5%，所有杂质总量不得过1.0%。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验

精密量取空白溶剂（水）20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，空白溶剂对本品有关物质测定无干扰。精密量取加标供试品溶液（丁二酸、己二酸及戊二酸浓度分别约为0.016，0.017，8.300 mg/mL）20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为丁二酸、戊二酸、己二酸，保留时间分别为4.496，5.815，9.270  min，加标供试品溶液中各杂质之间及杂质与主峰之间分离度良好。具体见图1。

• 
  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatogram

  注：A. 空白溶剂；B. 加标供试品溶液；1.丁二酸；2.戊二酸；3.己二酸；4.未知杂质。

  

2.3.2 线性关系考察

精密量取线性贮备液A（戊二酸浓度为8.516  mg/mL）1 mL及杂质对照品贮备液（丁二酸浓度为0.593 mg/mL，己二酸浓度为0.621 mg/ mL）5 mL，置同一50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为线性7号溶液。精密量取线性贮备液 A 4 mL，置5 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为线性贮备液B。分别精密量取线性7号溶液0.3，1.0，1.5，2.0，3.0，5.0 mL，各置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为线性1~6号溶液。以线性1~7号溶液及线性贮备液A、线性贮备液B作为戊二酸线性溶液，以线性2~7号溶液作为丁二酸、己二酸线性溶液。

分别精密量取线性1~7号溶液及线性贮备液 A、线性贮备液B，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以浓度（X，μg/mL）为横坐标，相应峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。结果表明，线性范围内，各组分浓度与峰面积之间线性关系良好。

• 
  表格1 各组分的线性方程、线性范围及相关系数

  Table 1.The linear equations, linear ranges, and correlation coefficients of each component

  

2.3.3 精密度试验

精密量取“2.3.2”项下线性4号溶液（丁二酸浓度为11.850 μg/mL、己二酸浓度为12.420  μg/ mL、戊二酸浓度为34.064 μg/mL）20  μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6次，记录色谱图，分别计算得丁二酸、己二酸和戊二酸峰面积的RSD分别为1.42%，1.82%，1.48%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.3.4 定量限和检测限试验

取对照品溶液及供试品溶液，分别加水稀释制成不同浓度的溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以信噪比约为10 ∶ 1时的样品浓度作为定量限，结果得丁二酸、己二酸、戊二酸的定量限浓度分别为5.925，6.210，5.110  μg/ mL，分别相当于供试品进样浓度的0.074%，0.078%，0.064%。定量限溶液连续进样6次，丁二酸、己二酸、戊二酸峰面积的RSD分别为2.61%，3.28%，1.46%（n=6）。以信噪比约为3 ∶ 1时的样品浓度作为检测限，结果得丁二酸、己二酸、戊二酸的检测限浓度分别为1.777，1.863，1.533 μg/mL，分别相当于供试品进样浓度的0.022%，0.023%，0.019%。

2.3.5 回收率试验

取戊二酸酐（批号：20180512，丁二酸含量为0.047%，己二酸含量为0.027%）约80 mg，共9份，精密称定，各置9个10 mL量瓶中，精密量取对照品贮备液（丁二酸、己二酸浓度分别为0.080、0.081 mg/mL）1.0，1.5，2.0 mL各3份，置上述9个10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，室温反应80 min后，作为供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行测定，同时测定对照品溶液，扣除背景含量，以测得量与加入量计算回收率，结果丁二酸和己二酸的平均回收率分别为100.92%（RSD=0.86%）和105.89%（RSD=2.99%）（n=9）。结果表明，丁二酸及己二酸回收率良好。

2.3.6 重复性与中间精密度试验

按“2.2”项下方法制备对照品溶液及供试品溶液，供试品溶液平行配制6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定。6份样品中丁二酸的含量均值为0.052%，极差为0.012%，己二酸均未检出，最大未知单杂含量均值为0.31%，RSD为5.16%（n=6），总杂质含量均值为0.45%，RSD为3.56%（n=6）。结果表明该方法重复性良好。

另取本品，由不同人员在不同时间、采用不同仪器依法测定有关物质，分别平行测定6份，计算同重复性试验共12份的平均值，12份样品中丁二酸的含量均值为0.052%，极差为0.014%，己二酸均未检出，最大未知单杂含量均值为0.31%，RSD为4.52%（n=12），总杂质含量均值为0.44%，RSD为4.32%（n=12）。结果表明该方法中间精密度良好。

2.3.7 稳定性试验

按“2.2”项下方法制备对照品溶液及供试品溶液，分别于配制后0，2，4，6，8，10，12，18，24 h各进样20 μL，记录色谱图，考察对照品溶液峰面积的变化情况和供试品溶液杂质含量的变化情况。对照品溶液在室温下放置24 h，丁二酸峰面积的RSD为2.95%（n=9），己二酸峰面积RSD为4.18%（n=9）。供试品溶液在室温下放置24 h，己二酸未检出，丁二酸含量均值为0.055%，极差为0.013%，最大未知单杂均值为0.31%，RSD为3.23%（n=9），总杂质均值为0.47%，RSD为2.13%（n=9）。结果表明对照品溶液及供试品溶液在室温下放置24 h稳定。

2.3.8 耐用性试验

精密量取加标供试品溶液（丁二酸、乙二酸及戊二酸浓度分别约为0.016，0.017，8.300 mg/mL）20 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别调整色谱参数甲醇-0.1%磷酸的比例（2 ∶ 98~4 ∶ 96）、流速（0.85~0.95 mL/min）及柱温（28~32 ℃），考察各杂质峰之间的最小分离度（己二酸与其后面相邻杂质峰的分离度），均能完全分离，表明本方法耐用性良好。

2.3.9 样品处理方法筛选

配制供试品溶液时，于配制后不同反应时间进样分析，考察戊二酸酐完全转化为戊二酸的反应时间。结果表明，戊二酸酐供试品溶液室温反应80 min后，戊二酸酐才能够完全转化为戊二酸。试验数据见表2。因此，本品供试品溶液配制后在室温反应80 min后再进样分析。

• 
  表格2 戊二酸酐转化为戊二酸的反应时间考察

  Table 2.Investigation of reaction time for the conversion of glutaric anhydride to glutaric acid

  

2.4 样品测定

分别取4批戊二酸酐样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，同时测定对照品溶液，按外标法以峰面积计算丁二酸、己二酸的含量，按面积归一化法计算其他杂质的含量，结果见表3。

• 
  表格3 样品测定结果（%, n=4）

  Table 3.Determination results of the samples (%, n=4)

  

根据样品测定结果，参考ICH Q3A指导原则杂质控制策略，已知杂质丁二酸及己二酸的质控限度均为0.15%，戊二酸酐有关物质限度规定为：按外标法计算，丁二酸及己二酸均不得过0.15%，其他单个杂质按面积归一化法计算不得过0.5%，所有杂质总量不得过1.0%。

3 讨论

采用梯度洗脱方式，升高流动相中甲醇比例，对供试品溶液进行分析，发现有机相比例升高后，供试品溶液中并没有新的杂质洗脱出来，因此，本品可以不用提高有机相比例，使用更省时的等度洗脱方式进行分析。己二酸后有一未知杂质，方法优化要保证己二酸与该杂质分离度大于1.5。通过优化流动相甲醇-0.1%磷酸溶液比例、流速以及柱温，最终保证方法既能满足杂质分离度要求，又能高效检测供试品中的杂质含量。

经方法学验证和样品测定结果表明，本文建立的HPLC法测定戊二酸酐有关物质的方法，专属性强、灵敏度高、操作简便，能准确测定戊二酸酐的有关物质。同时，该方法也可用于其他产品中丁二酸、己二酸或戊二酸的测定。相较于文献中笼统地测定戊二酸酐的含量，本文建立的有关物质标准中规定了已知杂质，其他单个杂质及总杂质限度，规避了杂质在后续反应中向下传递的风险，该方法能更好地控制戊二酸酐的产品质量，为戊二酸酐杂质去向研究提供了方法依据，为相应原料药终产品提供了源头控制策略。

1.Wang Z, Dupré N, Lajaunie L, et al. Effect of glutaric anhydride additive on the LiNi0.4Mn1.6O4 electrode/electrolyte interface evolution: a MAS NMR and TEM/EELS study[J]. Journal of Power Sources, 2012, 215: 170-178. DOI: 10.1016/j.jpowsour.2012.05.027.

2.陈福泉, 陈思, 洪清林, 等. 戊二酸酐酯化κ-卡拉胶的制备及理化性质[J]. 食品工业科技, 2021, 42(9): 30-35. [Chen FQ, Chen S, Hong QL, et al. Preparation and physicochemical properties of glutaric acid esterified κ-Carrageenan[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(9): 30-35.] DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2020070142.

3.张翠兰, 李如梦, 胡玉娇, 等. 依折麦布的合成研究进展[J]. 山东化工, 2022, 51(24): 51-55, 58. [Zhang CL, Li RM, Hu YJ, et al. Research progress in synthesis of ezetimal[J]. Shandong Chemical Industry, 2022, 51(24): 51-55, 58.] DOI: 10.19319/j.cnki.issn.1008-021x.2022.24.057.

4.赵靓琳, 赵智伟, 陈晓杰, 等. 来那度胺的合成方法研究进展[J]. 山东化工, 2020, 49(23): 68-70, 73. [Zhao LL, Zhao ZW, Chen XJ, et al. Research progress in synthesis method of lenalidomide[J]. Shandong Chemical Industry, 2020, 49(23): 68-70, 73.] DOI: 10.19319/j.cnki.issn.1008-021x.2020.23.026.

5.殷昕, 崔美姬, 江淼, 等. 盐酸苯达莫司汀的合成[J]. 合成化学, 2016, 24(5): 457-460. [Yin X, Cui MJ, Jiang M, et al. Synthesis of bendamustine hydrochloride[J]. Chinese Journal of Synthetic Chemistry, 2016, 24(5): 457-460.] DOI: 10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.05.15185.

6.熊非, 陈璐, 朱元杰, 等. 普瑞巴林的合成研究进展 [J]. 合成化学, 2021, 29(2): 148-165. [Xiong F, Chen L, Zhu YJ, et al. Research advance on thesynthetic process of pregabalin[J]. Chinese Journal of Synthetic Chemistry, 2021, 29(2): 148-165.] DOI: 10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.21042.

7.赵志建, 王训遒. 滴定法测定戊二酸酐的含量[J]. 化工生产与技术, 2016, 23(5): 43-45, 10. [Zhao ZJ, Wang XQ. Measuring the content of glutaric anhydride by titration method[J]. Chemical Production and Technology, 2016, 23(5): 43-45, 10.] DOI: 10.3969/j.issn.1006-6829.2016.05.014.

8.马金芬, 陈永霞, 胡迈声, 等. 戊二酸酐含量的测定[J]. 石油化工应用, 2011, 30(8): 56-58. [Ma JF, Chen YX, Hu MS, et al. Measuration for content of glutaric anhydride[J]. Petrochemical Industry Application, 2011, 30(8): 56-58.] DOI: 10.3969/j.issn.1673-5285.2011.08.018.

9.韦日伟, 王昆, 吴先富, 等. 药物中有关物质检测方法的研究进展及应用[J]. 中国药师, 2015, 18(5): 851-855. [Wei RW, Wang K, Wu XF, et al. Research advance and application of detection methods for related substances in drugs[J]. China Pharmacist, 2015, 18(5): 851-855.] DOI: 10.3969/j.issn.1008-049X.2015.05.053.

10.王云, 朱建伟. 化学合成原料药起始物料的选择原则[J]. 中国医药工业杂志, 2022, 53(5): 728-734. [Wang Y, Zhu JW. Principles for selection of starting materials for chemical synthetic API[J]. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 2022, 53(5): 728-734.] DOI: 10.16522/j.cnki.cjph.2022.05.020.

11.杜爽, 梁毅. 化学合成原料药申报过程中起始物料的选择与控制[J]. 中国医药工业杂志, 2018, 49(8): 1172-1176. [Du S, Liang Y. Selection and control of starting materials in the process of chemical synthetic APIs submission[J]. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 2018, 49(8): 1172-1176.] DOI: 10.16522/j.cnki.cjph.2018.08.020.

12.马帅. 混合二元酸中戊二酸的分离研究进展[J]. 当代 化工研究, 2018, (4): 42-43. [Ma S. Research progress on separation of glutaric acid from mixed dibasic acid[J]. Modern Chemical Research, 2018, (4): 42-43.] DOI: 10.3969/j.issn.1672-8114.2018.04.028.

13.庞贝. 二元酸的回收利用工艺[J]. 河南化工, 2019, 36(11): 39-40. [Pang B. Recycling process of dibasic acid[J]. Henan Chemical Industry, 2019, 36(11): 39-40.] DOI: 10.14173/j.cnki.hnhg.2019.11.012.