目的  探究塞来昔布对大鼠急性脑出血神经功能的影响。

方法  采用随机数字表法将SD大鼠分为假手术组、模型组、抑制剂组和塞来昔布组。除假手术组外各组采用自体血注入法制作脑出血模型。抑制剂组大鼠在模型组基础上在前侧脑室注射细胞外调解蛋白激酶（ERK）抑制剂（DCZ19931），塞来昔布组大鼠腹腔注射100 mg·kg^-1·d^-1的塞来昔布，连续两周。采用Longa五级评分法比较大鼠神经功能损伤程度；检测各组大鼠脑组织含水量，同时采用免疫印迹法检测各组大鼠脑组织中水通道蛋白4（AQP4）表达水平；采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠脑组织中白细胞介素-1β（IL^-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量；采用免疫印迹法检测各组大鼠丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ERK信号通路蛋白表达情况。

结果  与假手术组相比，模型组大鼠神经功能评分、脑组织含水量、脑组织中AQP4蛋白相对表达水平、IL^-1β、TNF-α、MDA含量、p-ERK1、p-ERK2、MAPK蛋白相对表达水平显著升高，SOD含量显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，抑制剂组和塞来昔布组大鼠神经功能评分、脑组织含水量、脑组织中AQP4蛋白相对表达水平、IL^-1β、TNF-α、MDA含量、p-ERK1、p-ERK2、MAPK蛋白相对表达水平显著降低，SOD含量显著升高（P＜0.05）。

结论  塞来昔布可以有效改善急性脑出血模型大鼠神经功能，其作用机制可能与调控MAPK/ERK信号通路并抑制炎症反应相关。

急性脑出血（acute cerebral hemorrhage, ACH）是一种常见的致死性脑血管病，病情凶险，病死率高[1]。临床研究发现，ACH是病变部位压迫脑实质，导致脑部血液循环障碍形成水肿并血脑屏障损伤，影响神经系统，为不可逆的损伤[2]。有研究表明，ACH可能与炎性反应、氧化应激反应、凝血酶变化、血管痉挛及水通道蛋白4（aquaporin protein 4, AQP4）表达相关[3]。ACH的发病与多种信号通路相关，如核因子E2相关因子2（nuclear factorerythroid-2-relatedfactor2, Nrf2）抗氧化反应元件（anti-oxidant response element, ARE）信号通路、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K） /苏氨酸激酶（serine/threoninekinase, AKT）以及丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular-signal-regulated kinases, MAPK/ERK）信号通路等。其中MAPK/ERK信号通路与P13K/AKT是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）的重要下游信号通路[4]。有学者认为抑制MAPK/ERK信号通路可减少神经细胞凋亡，减轻脑出血后神经功能损伤[5]。此外，抑制MAPK/ERK信号通路可调节下游核因子-κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）信号通路来实现抑制下游炎症反应，从而实现改善ACH患者脑组织炎症反应[6]。塞来昔布是一种主要用于缓解骨关节炎症状和急性疼痛的药物。临床研究发现塞来昔布能有效减轻脑出血患者脑水肿及炎症反应[7]。基于此，本研究使用塞来昔布作用于ACH模型大鼠，观察塞来昔布对ACH大鼠的治疗效果，探究其作用机制以期为临床治疗ACH提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取SPF级8周龄SD大鼠80只（许可证号：SCXK(蒙)2020- 0001），购自内蒙古医科大学实验室。大鼠均在内蒙古医科大学附属医院动物中心实验室饲养，本实验经内蒙古医科大学附属医院动物伦理委员会批准（批准号：IMUH-0023）通过。

塞来昔布（辉瑞制药有限公司，批号：BK221712）；MAPK/ERK信号通路抑制剂（DCZ19931）、戊巴比妥钠、ERK1抗体（货号：ab184699）、ERK2抗体（货号：ab210460）、MAPK抗体（货号：ab308333）、AQP4抗体（货号：ab259318）、GAPDH抗体（货号：ab8245）、HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗购自美国Thermo公司；ELISA检测试剂盒：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD，莱尔生物，批号：20221119）、丙二醛（malondialdehyde，MDA，上海白益生物科技有限公司，批号：BY20221119）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL^-1β，上海白益生物科技有限公司，批号：32160702）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，批号：20221117）。

自动生化分析仪（型号：BS-240）购自迈瑞；微量注射泵（型号：68025）购自瑞沃德生命科技有限公司；大鼠脑立体定位仪（型号：LEGATO 130）购自瑞沃德生命科技有限公司；体视镜（型号：SZ61）购自OLYMPUS公司；电子天平（型号：AL）购自梅特勒-托利多公司；低温离心机（型号：TGL^-16M）购自济南来宝医疗器械有限公司；正置型金相显微镜（型号：SG-51）购自上海光学仪器厂；蛋白电泳及转膜仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统购自以色列DNR公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及建立模型

80只大鼠适应性喂养1周，每个笼子饲养5只，每只大鼠分别剪脚趾分为1~5号，笼子分为1~16号笼子，以此将大鼠分为1~80号，采用随机数字表法，分为假手术（Sham）组、模型（ACH）组、抑制剂（DCZ19931）组和塞来昔布（Celecoxib）组，每组20只。除Sham组外，其余各组大鼠采用改良自体血注入法制作脑出血大鼠模型，制作方法及判断模型是否成功参考Chen等[8]研究。具体操作如下：使用戊巴比妥钠麻醉SD大鼠，将其俯卧固定，用脑立体定位注射仪，定位好前囟和后囟点，选择前囟点右侧中线旁开3 mm、冠状缝前0.2 mm处，定位尾状核，颅骨钻孔；反转暴露尾根腹侧，分离尾动脉，微量进样器刺入，抽取50 μL血液；微量进样器固定于立体定位仪，以5 μL·min^-1速度注入血液，注射结束采用二次退针法，缝合消毒后待大鼠麻醉苏醒30 min后，使用Longa五级评分法[9]对造模大鼠进行评分，评分为3分以上的动物为造模成功。Sham组大鼠仅开颅，不注入自体血。本次实验另准备20只大鼠备用，造模未成功则使用备用大鼠。

1.2.2 药物干预

Sham组和ACH组大鼠，每日腹腔注射生理盐水，注射剂量100 mg·kg- 1·d^{- 1}，每日1次；DCZ19931组造模前和造模后60 min使用PBS配置0.1 mol·L^-1的DCZ19931腹腔注射；Celecoxib组大鼠腹腔注射100 mg·kg^-1·d^-1的塞来昔布，每日1次，连续注射2周后进行神经功能评分及后续实验。

1.2.3 检测指标

大鼠神经功能采用Longa评分法：0分：大鼠神经功能正常；1分：无明显神经功能损伤；2 分：大鼠神经功能轻度损伤，提尾悬空时无法顺利伸展左前肢；3分：大鼠神经功能中度损伤，前行时向左打弯；4分：大鼠神经功能中重度损伤，站立不稳并向左侧或右侧倾倒；5分：大鼠神经功能重度损伤，不能自发行走、意识不清。

脑组织含水量检测。每组大鼠选取5只，造模成功24 h后断头取脑，将取出的脑组织放在生理盐水湿润的定性滤纸的培养皿中，取脑组织约100 mg，称取湿重，于85℃烘烤后称取干重，计算含水量。脑组织含水量（％）=（湿重-干重） /湿重×100％。

其他指标检测。每组选取15只大鼠，取大鼠脑组织，研磨后依据ELISA试剂盒上的步骤检测各组大鼠脑组织SOD、MDA、IL^-1β和TNF-α含量。使用Western blotting检测大鼠脑组织AQP4、MAPK和p-ERK1/2蛋白，取大鼠受损侧脑组织，使用胰蛋白酶消化后，提取总蛋白，使用半干法将蛋白转移至PVDF膜，置于5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加入各需检测蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，以GAPDH为内参蛋白，采用显色液显色后行吸光度分析，计算各蛋白相对表达量。

1.3 统计分析

本研究数据分析采用SPSS 22.0软件，作图采用GraphPad Prism5软件。符合正态分布的计量资料（大鼠神经功能评分、脑组织含水量、炎症因子含量和蛋白相对表达水平）采用x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间采用单因素方差分析。本研究所有检验均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠神经功能损伤评分比较

相比Sham组，ACH组、DCZ19931组和Celecoxib组大鼠神经功能评分显著升高（P＜0.05）；相比ACH组，DCZ19931组和Celecoxib组大鼠神经功能评分均显著降低（P＜0.05），见图1。

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  图1 各组大鼠神经功能损伤评分比较

  Figure 1.Comparison of nerve function injury scores in each group

  注：与Sham组相比，aP<0.05；与ACH组相比，bP<0.05

  

2.2 大鼠脑组织含水量及AQP4表达比较

相比Sham组，ACH组大鼠脑组织含水量和AQP4蛋白相对表达水平均显著升高（P＜0.05）；相比ACH组，DCZ19931组和Celecoxib组大鼠脑组织含水量和AQP4蛋白相对表达水平均显著减低（P＜0.05）；相比DCZ19931组，Celecoxib组大鼠脑组织中AQP4蛋白相对表达水平显著减低（P＜0.05），见图2。

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  图2 各组大鼠脑组织含水量及AQP4表达比较

  Figure 2.Comparison of water content and aquaporin 4 expression in brain tissue of rats in each group

  注：A为Sham组；B为ACH组；C为DCZ19931组；D为Celecoxib组；与Sham组相比，aP<0.05；与ACH组相比，bP<0.05；与DCZ19931组相比，cP<0.05

  

2.3 大鼠组织炎症因子比较

相比Sham组，ACH组大鼠脑组织中IL^-1β和TNF-α含量均显著升高（P＜0.05）；相比ACH组，DCZ19931组和Celecoxib组大鼠脑组织中IL^-1β和TNF-α含量均显著降低（P＜0.05），见图3。

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  图3 各组大鼠脑组织炎症因子比较

  Figure 3.Comparison of inflammatory factors in brain tissue of rats in each group

  注：A为Sham组；B为ACH组；C为DCZ19931组；D为Celecoxib组；与Sham组相比，aP<0.05；与ACH组相比，bP<0.05

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2.4 大鼠脑组织中SOD和MDA水平比较

相比Sham组，ACH组大鼠脑组织中SOD含量显著降低（P＜0.05），MDA含量显著升高（P＜0.05）；相比ACH组，DCZ19931组和Celecoxib组大鼠脑组织中SOD含量显著升高（P＜0.05），MDA含量显著降低（P＜0.05）；相比DCZ19931组，Celecoxib组大鼠脑组织中SOD含量显著升高（P＜0.05），见图4。

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  图4 各组大鼠脑组织中SOD和MDA水平比较

  Figure 4.Comparison of SOD and MDA levels in brain tissues of rats in each group

  注：A为Sham组；B为ACH组；C为DCZ19931组；D为Celecoxib组；与Sham组相比，aP<0.05；与ACH组相比，bP<0.05；与DCZ19931组相比，cP<0.05

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2.5 大鼠MAPK/ERK信号通路蛋白相对表达水平比较

相比Sham组，ACH组大鼠脑组织中p-ERK1、p-ERK2和MAPK蛋白相对表达水平显著升高（P＜0.05）；相比ACH组，DCZ19931组和Celecoxib组大鼠脑组织中p-ERK1、p-ERK2和MAPK蛋白相对表达水平显著降低（P ＜0.05）；相比DCZ19931组，Celecoxib组大鼠脑组织中p-ERK1、p-ERK2和MAPK蛋白相对表达水平显著升高（P＜0.05），见图5。

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  图5 各组大鼠MAPK/ERK信号通路蛋白相对表达水平比较

  Figure 5.Comparison of the relative expression levels of MAPK/ERK signaling pathway

  proteins in each group

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3 讨论

脑出血是临床上常见的一种非外伤性脑实质内出血。ACH对中枢神经系统的损害主要表现为机械性压迫导致神经细胞的坏死[10]。脑出血后有多种机制参与继发损害，如缺血缺氧、脑水肿、炎症反应、自由基损害等[11]。目前ACH的治疗主要包括：降低颅内压、降低血压、止血治疗以及抗炎治疗等[12]。塞来昔布属于非甾体消炎药，是一种常见的选择性环氧酶2抑制剂，可以通过抑制NF-κB信号通路实现改善炎症反应[13]。本研究采用了Longa五级评分法检测了各组大鼠的神经功能评分，发现ACH模型组大鼠神经功能评分显著升高；使用MAPK/ERK抑制剂和塞来昔布处理后大鼠神经功能评分均显著降低。表明使用MAPK/ERK抑制剂和塞来昔布均可有效改善脑出血后神经功能。

脑水肿是ACH病情加重的主要原因之一，减轻水肿是目前治疗ACH的关键之一[14]。AQPs是一组分布于细胞膜上与跨膜水转运密切相关的膜通道蛋白家族，目前已发现的AQPs有13种，AQP4是一类特异性转运水分子的细胞膜蛋白，其中AQP4主要存在于中枢神经系统的室管膜上皮细胞、蛛网膜下腔的软脑膜细胞中，在脑组织中的表达最为丰富。AQP4是脑胶质细胞缝隙连接的关键环节，与脑水肿的形成和消退有着紧密的联系[15]。本研究检测发现，造模后大鼠脑组织含水量和AQP4蛋白相对表达水平均显著升高，使用MAPK/ERK抑制剂和塞来昔布后大鼠脑组织含水量和AQP4蛋白相对表达水平均显著降低。

脑出血后有多种机制参与继发损害，如缺血缺氧和自由基损害等。TNF-α是前炎性细胞因子，TNF-α可直接促进中性粒细胞向病灶区聚集，诱导白细胞及受损组织细胞释放更多的细胞因子，这些炎性细胞因子具有神经毒性作用，可加速细胞死亡，加重脑组织损伤[16]。IL^-1β也是近年在脑血管疾病中研究较多的细胞因子，激活脑内的小胶质细胞，通过释放细胞因子自由基等多种机制参与脑内的炎症反应[17]。星形细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞均能产生IL^-1β，促使中性粒细胞趋化迁移，释放多种细胞因子及趋化因子，破坏血脑屏障，加重局部脑组织水肿，导致神经细胞凋亡，进一步加重脑组织损伤[18]。本研究检测IL^-1β和TNF-α发现，造模后大鼠脑组织中炎性因子IL^-1β和TNF-α含量显著升高，使用MAPK/ERK抑制剂和塞来昔布作用后IL^-1β和TNF-α含量均降低，这可能是因为塞来昔布属于非甾体消炎药，有效降低了大鼠脑出血后继发性的炎症反应。

自由基损害也是常见的脑出血后的继发性损害。MDA是氧化应激的重要指标，MDA的含量可以反映机体内发生脂质过氧化的程度，使自由基与生物膜中的多不饱和脂肪酸发生反应并使得氧化产物分解[19]。SOD也是常见的氧化自由基指标之一，其可以对抗氧自由基损伤。ACH后周围组织水肿缺血缺氧、继发性颅内压增高、脑组织代谢紊乱等，催化产生大量氧自由基，产生脂质过氧化物MDA，破坏细胞膜的生物结构[20]。本研究发现造模后大鼠脑组织中SOD含量显著降低，MDA含量显著升高。使用MAPK/ERK抑制剂和塞来昔布作用后大鼠脑组织中SOD含量显著升高，MDA含量显著降低，说明塞来昔布可以通过缓解自由基损害来改善大鼠ACH损伤。MAPK是一种能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸－苏氨酸蛋白激酶[21]。ERK1/2是MAPK/ERK通路的关键蛋白之一，经磷酸化后激活通路调控下游炎症及AQPs，缓解大鼠脑组织水肿[22]。本研究使用MAPK/ERK通路抑制剂和塞来昔布作用后发现，塞来昔布和MAPK/ERK通路抑制剂均有抑制MAPK/ERK通路的作用，表明塞来昔布缓解大鼠脑组织ACH可能与抑制MAPK/ERK通路相关。

综上所述，塞来昔布可以缓解大鼠脑组织ACH后的继发性炎症反应、自由基损害，同时抑制MAPK/ERK信号通路，有效改善ACH模型大鼠神经功能，实现缓解大鼠ACH损伤。本研究涉及使用的塞来昔布剂量较少，在后续的实验中将探究不同剂量的塞来昔布对ACH的治疗效果。

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