目的  探究低共熔溶剂法提取淫羊藿中黄酮类化合物的最佳提取工艺。

方 法  以淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的总提取率作为评价指标，在料液比、摩尔比、含水率、提取温度、提取时间等单因素试验的基础上结合正交试验设计对淫羊藿中黄酮类成分的提取工艺进行优化，并利用大孔树脂对溶剂中的成分进行回收。

结果  氯化胆碱与乙醇胺形成的低共熔溶剂提取效果最好，当氯化胆碱与乙醇胺的摩尔比为1 ∶ 4、料液比为0.5 g ∶ 25 mL、含水率为50%、提取温度为70 ℃、提取时间为15 min时，总提取率为（20.07±0.43）mg/g，且AB-8大孔树脂能够回收低共熔溶剂中的黄酮类成分，平均回收率为88.29%。

结论  低共熔溶剂较传统提取溶剂提取效率高，回收工艺简单，回收率高，在中药活性成分提取应用中有巨大的潜力。

淫羊藿又名仙灵脾，为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb. et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥叶，淫羊藿中富含黄酮、多糖、生物碱等多种化学成分，具有抗骨质疏松、抗肿瘤、免疫调节、影响生殖系统等作用 [1-5]，其中黄酮类成分是主要的活性物质，包括淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等，淫羊藿苷及总黄酮可通过提升大鼠胸腺指数和小鼠的外周血指标，达到对免疫系统的保护作用[6-7]；淫羊藿苷可改善卵巢组织功能，起到保护卵巢和预防早衰的作用[8]；淫羊藿苷可调控相关蛋白的表达来改善小鼠心肌纤维化[9]；淫羊藿苷和朝藿定A、B、C均能抑制肿瘤生长[10-11]。以上研究表明，淫羊藿苷表现出广泛的药效作用，且淫羊藿苷和朝藿定A、B、C是《中国药典》规定的质量控制成分。因此，从淫羊藿中高效提取淫羊藿苷等黄酮类成分，并对其进行深入的研究具有重要意义。

有机溶剂在化学合成、储存和分离过程中具有重要作用，但其具有高度挥发性、亲脂性和毒性，对人体和环境有害，绿色化学一直是国际学术研究的前沿领域和研究热点。低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DESs）相比传统溶剂，具有黏度大、溶解度大、易制备、安全无毒等特点，其萃取能力要远高于传统溶剂[12]；由于DESs具有较高的沸点，故常规的减压浓缩的回收溶剂方式无法回收DESs，大孔树脂吸附法常用来将DESs与活性成分开，达到回收活性成分的目的。

本文基于绿色提取的理念，利用DESs提取淫羊藿中黄酮类成分，同时观察DESs对淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 4种成分的提取效果，故以淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C

4种成分的总提取率为评价指标，优化提取工艺，并利用大孔树脂回收提取液中的活性成分，为淫羊藿药材活性成分的药效学研究奠定基础，为DESs绿色、高效提取提供理论依据。

1 材料

1.1 主要仪器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪，包括DAD检测器、Openlab CDS 2.x色谱工作站（美国Agilent公司）；XSR105型十万分之一分析天平和ME204型万分之一分析天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SB25-12D 超声波清洗仪（宁波新艺超声设备有限公司）；MiLi-Q纯水仪（美国 milipore 公司）；大孔树脂D101、AB-8、HPD100（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品朝藿定A（批号：MUST-21112118，纯度99.51%）、朝藿定B（批号：MUST-21110403，纯度99.23%）、朝藿定C（批号：MUST-21100310，纯度99.11%）均购自成都曼思特生物科技有限公司；对照品淫羊藿苷（中国食品药品鉴定研究院，批号：110737-202017，纯度98.1%）；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司，批号：F21LCL201）；氯化胆碱（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C16658717）；尿素（批号：RH5963⁴9）、乙醇胺（批号：RH463983）、1,4-丁二醇（批号：RH426990）、乙二醇（批号：C15765681）和甘油（批号：RH461222）均购自上海易恩化学技术有限公司；乳酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：E2416257）；其余试剂为分析纯；淫羊藿药材（安徽佰草阁中药科技有限公司，产地：甘肃西河，批号：202202001）经江西中医药大学邓可众教授鉴定为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 混合对照品溶液的制备

分别取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品各适量，精密称定，加入甲醇溶解并稀释制成质量浓度分别为122.16、161.60、256.04、161.28 μg/mL 的混合对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备

取本品叶片，粉碎过三号筛，取0.5  g粉末，精密称定，置于离心管中，加入 25 mL 含水量为40%的DESs，涡旋混匀后置于超声清洗器中，设定超声温度为70 ℃，提取时间为20  min。提取完成后15 285×g离心10 min，取上清液1 mL，稀释5倍后用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0~12 min，9%→12% A；12~13 min，12%→21% A；13~21 min，21% A；21~22 min，21%→25% A；22~40 min，25% A；40~41 min，25%→44% A；41~51 min，44% A）；流速：1.0 mL/min，检测波长：270 nm，柱温：30 ℃，进样量：10 μL[13]。HPLC色谱图见图1。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatogram

  注：A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.空白溶剂；1.朝藿定A；2.朝藿定B；3.朝藿定C；4.淫羊藿苷。

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2.2 线性考察

取“2.1.1”项下的混合对照品溶液适量，用甲醇稀释制成不同浓度的混合对照品溶液，其中朝藿定A 122.16、61.08、30.54、15.27、7.64、3.82  μg/mL，朝藿定B 161.60、80.80、40.40、20.20、10.10、5.05 μg/mL，朝藿定C 256.04、128.02、64.01、32.01、16.00、8.00 μg/mL，淫羊藿苷161.28、80.64、40.32、20.16、10.08、5.04  μg/mL。经0.22 μm微孔滤膜过滤后，取续滤液10  μL，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以对照品浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果显示，各待测成分均在其相应浓度范围内与其峰面积的线性关系良好，具体见表1。

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  表格1 淫羊藿中4个成分的线性关系

  Table 1.Linear relationship of 4 constituents in Epimedii folium

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2.3 DESs制备

将氯化胆碱和不同类型的氢键供体（尿素、乳酸、乙醇胺、乙酰胺、1,4-丁二醇、乙二醇和甘油）按表2中的比例置于80 ℃恒温水浴锅中混合，搅拌至形成均一透明的液体，取出后放冷至室温，即得不同类型的DESs[14]。

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  表格2 不同类型DESs

  Table 2.Different types of DESs

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2.4 DESs单因素考察

2.4.1 提取率的计算

以总提取率（4种活性成分之和）作为指标，采用以下公式计算总提取率：

总提取率=（M₁+M₂+M₃+M₄）/M

式中，M₁、M₂、M₃、M₄分别代表朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷质量（mg）；M代表淫羊藿粉末质量（g）。

2.4.2 DESs类型

按“2.1.2”项下方法共制得7种不同DESs的供试品，并进行含量测定，试验重复3次。结果如图2所示，7种DESs对淫羊藿中4种活性成分（朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷）表现出不同的提取效果，其中DESs-3（氯化胆碱-乙醇胺）的总提取率最高，其原因可能是氯化胆碱和乙醇胺形成的DESs，混合后液体的极性与淫羊藿中黄酮类成分极性相近，根据相似相溶原理，故能增加淫羊藿中黄酮类成分的溶出，提高提取效果；另一方面，可能是由于DESs能够破坏植物细胞壁而增加物质间的传递，从而提高提取效果，故选择DESs-3作为最佳溶剂。

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  图2 不同类型DESs对淫羊藿中4种活性成分总提取率的影响（n=3）

  Figure 2.The effect of different types of DESs on the total extraction rate of four active components from Epimedii folium (n=3)

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2.4.3 摩尔比

摩尔比是影响DESs提取效率的重要影响因素，摩尔比的不同会改变DESs的熔点、黏度、表面张力等性质，从而影响目标成分的提取效率 [15]。本文考察了不同摩尔比（氯化胆碱-乙醇胺分别为2 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4）对淫羊藿中活性成分提取的影响，结果如图3所示，随着乙醇胺摩尔量逐渐增加，提取效率逐渐升高，当摩尔比为1 ∶ 4时，提取效率达到最高，故选择摩尔比为1 ∶ 4进行后续试验。

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  图3 不同摩尔比对淫羊藿中4种活性成分总提取率的影响（n=3）

  Figure 3.The effect of different molar ratio on the total extraction rate of four active components from Epimedii folium with different molar ratios (n=3)

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2.4.4 含水率

相对于传统溶剂，DESs具有黏度大的特点，含水量增加能降低DESs的黏度，使药材粉末完全分布于溶剂中，从而增加药材的提取效率。本文考察了不同含水量对提取效果的影响，结果如图4所示，随着含水率的增加，提取效率逐渐增加后降低，含水率为40%时提取率最高，故选择含水率选择40%。

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  图4 不同含水率对淫羊藿中4种活性成分总提取率的影响（n=3）

  Figure 4.The effects of different moisture contents on the total extraction rate of four active components from Epimedii folium (n=3)

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2.4.5 溶剂体积

适当的溶剂体积可提高DESs的提取效率，本文考察了溶剂体积对提取效果的影响，保持DESs-3的摩尔比为1 ∶ 4，含水率为40%，称取0.5 g粉末，分别加至不同体积（5、10、15、20、25  mL）的DESs-3中。结果如图5所示，当溶剂体积逐渐增加，提取效率逐渐增加，其原因可能是溶剂体积增加后，与粉末有更大的接触面积，增加了溶剂与粉末之间的作用力，当体积为25 mL时，提取效果最好，故选择溶剂体积为25 mL。

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  图5 不同溶剂体积对淫羊藿中4种活性成分总提取率的影响（n=3）

  Figure 5.The effect of different solvent volume on the total extraction rate of four active components from Epimedii folium (n=3)

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2.4.6 提取温度

本文考察了不同温度对提取效果的影响，设置温度为40、50、60、70、80 ℃。结果如图 6所示，随着温度的升高，提取效果逐渐升高，DESs的黏度受温度影响较大，适当提高温度可以增加DESs的流动性，增加溶剂与粉末的接触面积，从而提高提取效率；温度从40 ℃增加到70 ℃时，提取率增加，当温度提高到80 ℃时，提取率变化不明显，原因可能是温度较高，降低了溶剂与成分之间的作用力，故选择提取温度为70 ℃。

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  图6 不同提取温度对淫羊藿中4种活性成分总提取率的影响（n=3）

  Figure 6.The effect of different extraction temperature on the total extraction rate of four active components from Epimedii folium (n=3)

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2.4.7 提取时间

提取时间对活性成分的提取有较大的影响，时间过长，可能导致成分分解，时间过短，可能导致成分未完全溶出。本文设置的提取时间为5、10、15、20、25 min，结果如图7所示，当时间为5~10 min时，此阶段为提取初期，物质的溶出较快，故提取率升高较快，提取20 min后，大部分物质已被提取出来，提取率升高幅度不大，提取达到稳定，故选择提取时间为20 min。

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  图7 不同提取时间对淫羊藿中4种活性成分总提取率的影响（n=3）

  Figure 7.The effect of different extraction time on the total extraction rate of four active components from Epimedii folium (n=3)

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2.4.8 提取工艺的正交试验

根据单因素优化试验结果，选择提取温度（A）、提取时间（B）、含水率（C）为主要影响因素，选择适合的水平，采用L₉（3⁴）正交表进行试验（表3），以总提取率为考察指标，正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。通过对各个参数进行优化，以获得高提取率的关键工艺参数组合。

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  表格3 正交试验因素水平

  Table 3.Factor level of orthogonal experiment

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  表格4 正交试验极差分析结果

  Table 4.Results of range analysis of orthogonal experiment

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  表格5 正交试验方差分析结果

  Table 5.Results of variance analysis of orthogonal experiment

  注：F0.05（2.2）=19.00。

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结果显示，3个因素对总提取率的影响顺序依次为C（含水率）＞A（提取温度）＞B（提取时间），但结果均无显著影响，综合考虑提取效率和节约能源等因素，确定最优提取工艺为A₂B₁C₃，即提取温度70 ℃，提取时间15 min，含水率50%。

2.4.9 DESs与传统溶剂的提取效果比较

甲醇、乙醇、水是中药提取常用的提取溶剂，本文将DESs与传统溶剂（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水）在相同条件下进行提取，提取条件为氯化胆碱-乙醇胺1 ∶ 4，料液比0.5  g  ∶  25  mL，提取温度70 ℃，提取时间15  min，含水率50%。结果如图8所示，在相同的工艺条件下，DESs-3提取淫羊藿中黄酮类成分的效率高于传统溶剂；比较了朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的含量，DESs-3对朝藿定C的提取效果低于传统溶剂，而对朝藿定A、B、淫羊藿苷的提取效果均高于其他溶剂。其中DESs-3提取液中的淫羊藿苷含量[（7.72±0.14）  mg/ g]远高于50%乙醇提取液[（4.17±0.47）  mg/ g]，相对传统溶剂提取效果提高了1.85倍。

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  图8 不同提取溶剂对对淫羊藿中4种活性成分的总提取率（n=3）

  Figure 8.The total extraction rate of four active components from Epimedii folium with different extraction solvent (n=3)

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2.5 成分回收工艺研究

2.5.1 大孔树脂类型考察

取活化后的HPD100、D101、AB-8大孔树脂各1.0 g，吸取30 mL DESs提取的淫羊藿药液，吸附6 h，收集吸附后的药液，用25 mL去离子水洗脱后，再加入25 mL 95%乙醇洗脱，以吸附率和解析率作为考察指标，分别测定吸附后的药液与95%乙醇洗脱液中各成分含量。结果如图9所示，吸附率最大的为D101树脂，洗脱率最大的为AB-8树脂，经过树脂重量和药液体积的调整，在树脂重量不变的情况下，降低药液体积至25  mL时，3种大孔树脂可将药液中的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷全部吸收，故只需选择解吸率最大的，树脂即AB-8大孔树脂。

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  图9 不同类型大孔树脂考察结果（n=3）

  Figure 9.Investigation results of different types of macroporous resins (n=3)

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2.5.2 洗脱溶剂考察

取活化后的AB-8大孔树脂1.0 g，吸取25  mL DESs提取的淫羊藿药液，吸附6 h，收集吸附后的药液，用25 mL去离子水洗脱后，再分别加入10 mL水、10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脱，以总提取物质量作为考察指标，测定不同乙醇洗脱液中各成分含量。结果如图10所示，水、10%乙醇不能将淫羊藿黄酮类成分洗脱下来，30%、50%、70%、95%乙醇能将淫羊藿黄酮类成分洗脱下来，且70%乙醇洗脱能力最强，故选择70%乙醇作为洗脱溶剂。

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  图10 不同浓度乙醇洗脱结果（n=3）

  Figure 10.Elution results of different concentrations of ethanol (n=3)

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2.5.3 洗脱溶剂用量考察

取活化后的AB-8大孔树脂1.0 g，吸取25  mL DESs提取的淫羊藿药液，吸附6 h，收集吸附后的药液，用25 mL去离子水洗脱后，再加入70%乙醇洗脱，每3 mL进行一次检测，以总提取物洗脱率作为考察指标，测定70%乙醇洗脱液体积。结果如图11所示，随着70%乙醇体积的增加，总提取物洗脱率先增加后减小，在6 mL时含量最高，洗脱至45 mL时，总提取物已无法检测，故洗脱量为45 mL。

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  图11 洗脱溶剂用量考察结果（n=3）

  Figure 11.Investigation results of elution solvent dosage (n=3)

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2.5.4 黄酮类成分回收工艺验证试验

根据上述试验结果，量取25 mL DESs提取的淫羊藿药液作为上样药液，与1.0 g AB-8大孔树脂混合，吸附6 h，收集吸附后的药液，用25 mL去离子水洗脱后，再以70%乙醇45 mL洗脱，分别测定上样药液（上样量为6 359.85 μg）和70%乙醇洗脱液（洗脱量）中的各成分含量，平行操作3次。如表6所示，验证结果重复性好，可用于淫羊藿黄酮类成分回收。

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  表格6 大孔树脂回收工艺验证结果

  Table 6.Verification results of macroporous resin recovery process

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3 讨论

本文对DESs法提取淫羊藿主要黄酮的提取工艺及大孔树脂回收主要黄酮进行了全面研究。以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的含量作为指标，通过单因素试验确定了最佳溶剂为氯化胆碱与乙醇胺形成的DESs，其摩尔比为1  ∶ 4，固液比为0.5 g ∶ 25 mL，再通过正交试验优选出了DESs最佳条件：提取温度70  ℃，提取时间15  min，含水率50%；在此条件下，朝藿定A提取率为（1.87±0.18） mg/ g，朝藿定B提取率为（7.30±0.19）mg/ g，朝藿定C提取率为（3.18±0.06）mg/g，淫羊藿苷提取率为（7.72±0.14）mg/g，总提取率为（20.07±0.43） mg/ g，提取效果远高于水、甲醇、乙醇等传统溶剂；大孔树脂回收黄酮成分研究表明，该工艺能有效回收DESs中的淫羊藿黄酮成分，即每1 g的AB-8大孔树脂，加入25 mL药液，吸附6 h后，将吸附后的药液放出，用25 mL去离子水清洗，再使用70%乙醇将黄酮成分洗脱，黄酮成分的平均回收率为88.29%。因此，DESs法可高效提取淫羊藿黄酮成分，同时结合大孔树脂可达到回收黄酮成分的目的。

DESs作为新型绿色溶剂，较传统溶剂具有制备简单、高效、环保等特点[16-20]，本研究表明DESs可提高淫羊藿黄酮成分的提取效果，但未对氯化胆碱和乙醇胺形成的溶剂进行表征，无法确定溶剂的结构、极性等理化性质，只能证明其较传统溶剂提取效率更高，而无法阐明其具体机制，故后期试验将增加对DESs的表征，以阐明DESs高效提取的机制。

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