欢迎访问中南医学期刊社系列期刊网站！
欢迎访问中南医学期刊社系列期刊网站！
目的 建立菟丝子提取物的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱，分析其与抗氧化活性的谱效关系。
方法 采用UPLC法测定11批菟丝子提取物的指纹图谱，以1,1-二苯基-2-苦基肼自由基、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐法测定菟丝子体外抗氧化活性，结合正交偏最小二乘法（OPLS）以及灰色关联度法分析指纹图谱与抗氧化活性的关联度，筛选出对抗氧化活性贡献较大的关键物质。
结果 菟丝子提取物相似度均在0.97以上，共有21个共有峰，通过与对照品对比，指认了10个峰，其中峰5为新绿原酸，峰8为绿原酸，峰9为隐绿原酸，峰10为咖啡酸，峰12为对香豆酸，峰15为金丝桃苷，峰16为异槲皮苷，峰17为紫云英苷，峰20为槲皮素，峰21为山奈素。灰色关联度以及OPLS结果表明，峰8、15、16、18与抗氧化活性呈现正相关，为主要药效成分。
结论 菟丝子抗氧化活性是多组分联合效应的结果，通过指纹图谱与抗氧化谱效分析，可为后面菟丝子的进一步研究提供数据参考。
菟丝子为旋花科植物南方菟丝子Cuscuta australis R. Br.或菟丝子Cuscutae Semen Lam.的干燥成熟种子，其性辛、甘、平，归肝、肾、脾经，可补益肝肾，固精缩尿，安胎，明目，止泻，主治肝肾不足、腰膝酸软、阳痿遗精、遗尿尿频、肾虚胎漏、胎动不安、目昏耳鸣、脾肾虚泻等症状[1-2]。现代药理研究表明，菟丝子含有丰富的黄酮类成分、酚酸类以及多糖等活性物质，其中黄酮类以及酚酸类物质种类较多且含量较高，对心血管、免疫系统以及生殖系统等方面有一定的调节作用[3]。中药配方颗粒是在中医药理论的指导下，结合现代技术对药材采取提取、浓缩、喷干等一系列操作加工制备而成的颗粒剂[4]。提取物作为直接影响配方颗粒成品最终质量的产物，目前针对其谱效关系的研究较少[5]。本试验从菟丝子提取物的指纹图谱入手，研究其图谱中各共有峰与抗氧化活性之间的谱效关系，筛选出贡献较大的活性物质，以期为菟丝子的进一步质量控制研究提供依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters型超高效液相色谱仪[沃特世科技（上海）有限公司]；MiliQ Direct 8型超纯水机（德国Merck有限公司）；KQ-500DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；B-290 型喷雾干燥仪（瑞士步琪有限公司）；XP26百万分之一天平、ME204E型万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；UV-2600i型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；YRE-501型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；DLSB-5/20型低温冷却液循环水泵（郑州长城科工贸有限公司）。
1.2 材料
对照品：新绿原酸（批号：DSTDX001503，纯度98.0%）、隐绿原酸（批号：DST2104027-035，纯度98.0%）、对香豆酸（批号：DST 210508-057，纯度99.94%）、紫云英苷（批号：DSTDZ000101，纯度99.19%）均购自成都乐美天医药有限公司；绿原酸（批号：110753-202018，纯度96.1%）、咖啡酸（批号：110885-201703，纯度99.7%）、金丝桃苷（批号：111521-201809，纯度94.9%）、山奈素（批号：110861-202013，纯度93.2%）、异槲皮苷（批号：111809-201804，纯度97.2%）、槲皮素（批号：100081-201610，纯度99.1%）、维生素C（批号：100425-202105，纯度98.0%）均购自中国食品药品检定研究院；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）清除能力试剂盒（批号：G20220621YG）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）清除能力试剂盒（批号：G20220621YG）均购自苏州格锐思生物科技有限公司。
11批菟丝子饮片均为市售样品（编号：S1~S11），产自内蒙古，经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为菟丝子Cuscutae Semen Lam.的干燥成熟种子；取菟丝子饮片加入适量的纯化水煎煮提取，冷却过滤，提取液全部转移至真空浓缩，清膏加入适量的糊精搅拌均匀后喷雾干燥，得到菟丝子提取物。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用UPLC法，色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm, 1.8 m），以乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~4 min，7%→9%A；4~6 min，9%→11%A；6~18 min，11%→12%A；18~23 min，12%→ 14%A；23~34 min，14%→15%A；34~44 min，15%→24%A，44~49 min，24%→30%A；49~ 55 min，30%→31%A）；检测波长：0~20 min为325 nm，20~55min为360 nm ；流速：0.3 mL·min-1；进样量：1 μL；柱温：30℃。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液
分别取新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、金丝桃苷、山奈素、槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷、对香豆酸、咖啡酸适量，精密称定，加甲醇溶解，制成浓度分别为0.018 9，0.010 2，0.010 0，0.018 7，0.009 8，0.010 0，0.099 5，0.010 3，0.097 5，0.011 2 mg·mL-1的对照品混合溶液。
2.2.2 供试品溶液
取菟丝子提取物0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率：300 W，频率：40 kHz）30 min后取出，放冷，再称定重量，以80%甲醇补足减失重量，摇匀，经0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 稳定性试验
取编号为S6的菟丝子提取物，精密称定，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24，48 h时，按“2.1”项下色谱条件进样检测，以金丝桃苷为参照（S）峰，计算得各共有峰与S峰之间相对保留时间的RSD为0.1%~0.92%（n=7），相对峰面积的RSD为0.59%~3.79%（n=7），说明供试品溶液在48 h内稳定性良好。
2.3.2 重复性试验
取编号为S6的菟丝子提取物，精密称定，按照“2.2.2”项下方法分别制备6份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样检测，计算得各共有峰与S峰之间相对保留时间的RSD为0.15%~1.0%（n=6），相对峰面积的RSD为0.58%~4.01%（n=6），说明方法重复性良好。
2.3.3 精密度试验
取编号为S6的菟丝子提取物，精密称定，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，计算得各共有峰与S峰之间相对保留时间的RSD为0.05%~0.93%（n=6），相对峰面积的RSD为0.12%~3.16%（n=6），说明仪器精密度良好。
2.4 菟丝子提取物指纹图谱的建立及相似度评价
2.4.1 指纹图谱的建立
分别取11批菟丝子提取物，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样检测，标记色谱图基本信息。将色谱图文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），以S6样品为参照，采取平均数法进行标记峰匹配，得到11批菟丝子提取物的叠加指纹图谱以及对照图谱（图1）。结果显示，指纹图谱中含20个共有峰，与对照图谱对比，指认峰5为新绿原酸，峰8为绿原酸，峰9为隐绿原酸，峰10为咖啡酸，峰12为对香豆酸，峰15为金丝桃苷，峰16为异槲皮苷，峰17为紫云英苷，峰20为槲皮素，峰21为山奈素。
2.4.2 相似度评价
以对照图谱为参照，结合《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）分析各样品之间的差异性。结果各共有峰之间的相似度在0.972~0.999之间，均大于0.97，表明不同批次的样品整体较为稳定。
2.5 体外抗氧化活性
2.5.1 供试品溶液的制备
按照“2.2.2”项下方法，用80%甲醇分别稀释制备成浓度为0.05，0.50，1.00，5.00，1.00 mg·mL-1的供试品溶液。
2.5.2 阳性对照溶液的制备
取维生素C适量，精密称定，加80%甲醇溶解，制成浓度为0.300 mg·mL-1的维生素C母液。取维生素C母液分别稀释，制备成浓度为0.012，0.030，0.060，0.300 mg·mL-1的DPPH法阳性对照溶液；取维生素C母液分别稀释制备成浓度为0.006，0.012，0.075，0.150 mg·mL-1的ABTS法阳性对照溶液。
2.5.3 DPPH自由基清除率试验
称取DPPH粉末适量，溶于无水乙醇中，超声混匀，得DPPH工作液。取“2.5.1”项下不同浓度供试品溶液各0.4 mL，加入0.6 mL的DPPH工作液，混匀，记为测定管；取“2.5.1”项下不同浓度供试品溶液各0.4 mL，加入0.6 mL无水乙醇稀释，混匀，记为对照管；取无水乙醇0.4 mL，加入DPPH工作液0.6 mL，混匀，记为空白管。以上试液于室温25℃避光静置30 min，精密量取试液0.8 mL至玻璃比色皿中，于紫外分光光度计517 nm处测定吸光度（A）值。取“2.5.2”项下的DPPH阳性对照溶液，按以上方式测得阳性对照溶液的A值。每个样品平行测定3次，按照公式[（1-（A测定-A对照）/A空白）×100%]计算不同浓度供试品溶液以及阳性对照溶液的清除率，根据清除率以及供试品溶液（维生素C）浓度拟合曲线计算得半抑制浓度（IC50），结果见表1。
2.5.4 ABTS自由基清除率试验
取硫酸钾粉末适量，溶于1.47 mL蒸馏水中，振荡混匀，得储备液1；取ABTS粉末适量，溶于2.86 mL蒸馏水中，振荡混匀，得储备液2；临用前将蒸馏水溶解后的储备液1与储备液2按照比例1 ∶ 1混合，避光反应12 h后，再用无水乙醇稀释30倍，得ABTS工作液。取“2.5.1”项下不同浓度供试品溶液各0.05 mL，加入0.95 mL的ABTS工作液，混匀，记为测定管；取“2.5.1”项下不同浓度供试品溶液各0.05 mL，加入0.95 mL无水乙醇稀释，混匀，记为对照管 ；取无水乙醇0.05 mL，加入ABTS工作液0.95 mL，混匀，记为空白管。以上试液于室温25℃避光静置，全部移取至玻璃比色皿中，于紫外分光光度计734 nm处测定A值。取“2.5.2”项下的ABTS阳性对照溶液，按以上方式测得阳性对照溶液的A值。每个样品平行测定3次，按照“2.5.3”项下公式计算不同浓度下的供试品溶液以及阳性对照溶液的清除率，根据清除率以及供试品溶液（维生素C）浓度拟合曲线计算得IC50，结果见表1。
2.6 灰色关联度分析
2.6.1 数据标准化
基于原始数据的单位以及量纲不同，采用SPSS 20.0软件对其进行Z分数标准化处理，变换后的参考序列记为X0(t)，比较序列记为Xi(t)。以标准化后的抗氧化指标IC50作为参考序列，各共有峰面积为比较序列，分析对抗氧化活性贡献较大的物质基础[6]。
2.6.2 关联系数的计算
根据以下公式计算灰色关联系数：
式中：ηi(k)是第k个样品的第i个峰面积与IC50的关联系数，θ0(k)为菟丝子的抗氧化指标IC50相反数；θi(k)为菟丝子各共有峰峰面积；ρ为分辨系数0.5；minmin|θ0(k)-θi(k)|、maxmax|θ0(k)-θi(k)|分别表示参考序列与比较序列差的第二级最小差值和最大差值。
2.6.3 关联度计算
根据以下公式计算关联度（r）：
关联度的范围在0~1内，随着关联度的增加，则表示参考序列与比较序列的关联度较大。结果显示，所有峰与抗氧化指标的关联度均大于0.57，说明各个共有峰对ABTS以及DPPH清除率有一定的贡献，且菟丝子的抗氧化功能是综合多组分的共同效应。ABTS关联系数≥0.7时，有11个共有峰，关联度由大到小排列依次是14＞13＞9＞3＞7＞8＞6＞5＞16＞15＞18。DPPH关联系数大于0.68时，有11个共有峰，由大到小排序分别是18＞20＞5＞2＞10＞8＞1＞4＞15＞16＞19。综合分析，5、8、15、16、18这几个峰与抗氧化能力关联较为密切，可初步将这几个关联度较大的共有峰作为指纹图谱的药效控制点，具体见表2。
2.7 正交偏最小二乘积法分析
灰色关联度较为直观地反映不同峰与抗氧化作用的关联度大小，但无法呈现两者的正负相关性，故需结合偏最小二乘积法（optimized potentials for liquid simulation, OPLS）综合分析。将Z分数标准化后的数据，导入SIMCA 14.1软件进行OPLS分析，以菟丝子不同批次的共有峰峰面积为自变量，抗氧化指标IC50为因变量，根据模型拟合得到变量投影重要性指标（variable importance in projection, VIP）值以及回归系数。图2结果显示，与DPPH清除率呈现正相关的有13个峰，贡献度由大到小排列分别为13＞14＞15（金丝桃苷）＞8（绿原酸）＞11＞9（隐绿原酸）＞16（异槲皮苷）＞7＞5＞6（新绿原酸）＞3＞4＞18，其余的峰与DPPH呈现负相关，依次为21（山奈素）＞20（槲皮素）＞17（紫云英苷）＞2＞1＞10（咖啡酸）＞19＞12（对香豆酸），方程y=-0.026x1-0.029x2+0.023x3+0.012x4+0.026x5+0.024x6+0.028x7+0.032x8+0.030x9-0.026x10-0.032x11-0.011x12+0.03x13+0.033x14+0.033x15-0.030x16-0.031x1-0.012x18-0.024x19-0.032x20-0.036x21，其中x代表各共有峰，y代表抗氧化清除率，回归系数绝对值越大则表示自变量的贡献度越大。结合图3分析，与ABTS清除率呈现正相关的有12个峰，贡献度由大到小分别为18＞4＞8＞14＞17＞19＞16＞15＞13＞21＞5＞9，其余的峰与ABTS呈现负相关，依次为12＞20＞2＞3＞6＞11＞1＞10＞7，回归方程为y= -0.046x1-0.150x2-0.116x3+0.234x4+0.084x5-0.109x6-0.002x7+0.207x8+0.001x9-0.025x10-0.056x11-0.382x12-0.105x13+0.205x14-0.120x15-0.153x16+0.170x17-0.595x18-0.160x19-0.211x20+0.087x21。VIP值是反映自变量对因变量解释能力的重要指标之一，VIP值＞1，则说明该自变量在解释因变量时具有显著重要性 [7]。在以DPPH清除率为指标时，VIP＞1的共有峰从大到小依次为13、9、17、10、7、6、19、3、14、15、21、2，具体见图4。在以ABTS清除率为指标时，VIP＞1的共有峰从大到小依次为18、8、16、14、15、1、13，具体见图5。综上所述，结合各共有峰对DPPH以及ABTS清除率的作用分析，8、9、13、14、15、16、18是影响菟丝子抗氧化能力较为重要的物质基础，与其呈现正相关。综合以上两种分析手段，筛选出峰8、15、16、18对菟丝子抗氧化能力具有较大的贡献度。整体来看，OPLS与灰色关联度的结果较为一致。
3 讨论
本文通过比较不同的制样方式对其特征图谱的影响，其中溶剂为80%甲醇，超声时间为30 min，功率为300 W方法较优。在何广铭等[8]的研究基础上，考察不同的流动相体系对色谱峰的分离效果，结果乙腈-0.2%甲酸体系较优。文献[9-10]报道，菟丝子中含有的酚酸类以及黄酮类物质分别在波长为325 nm和360 nm处响应值较高，采取分段波长融合更有利于样品分析。
研究表明，菟丝子提取物能够降低老年秀丽隐杆线虫细胞内活性氧的水平，在预防衰老方面具有一定的临床研究价值[11-12]。11批菟丝子提取物中DPPH所对应IC50的浓度范围为0.296 6~ 0.579 0 mg·mL-1，ABTS对应IC50的浓度范围为0.945 5~1.373 2 mg·mL-1，说明不同批次间的菟丝子提取物存在一定的差异，可能与采收季节、贮存环境等因素有关。抗氧化能力与物质浓度成反比，在同等清除率的情况下，所需浓度越高，则抗氧化能力越低；维生素C常作为抗氧化能力研究的阳性对照药物，在清除率为50%时，菟丝子喷干粉两种抗氧化自由基IC50均高于维生素C，有一定的差异，但都具有较明显的抗氧化效果。
以灰色关联度作为化学评价手段，菟丝子提取物中各共有峰与DPPH以及ABTS的关联度均大于0.57，表明各共有峰与抗氧化指标具有较大的相关性，揭示菟丝子中抗氧化活性为多组分联合效应，并非单一物质主导。为进一步反映共有峰与抗氧化能力的正负相关性，结合OPLS分析，其中1、2、10、20与抗氧化呈现负相关，4、5、8、9、13、14、15、16、18则呈现正相关。结合VIP＞1的结果，峰8（绿原酸）、9（隐绿原酸）、13、14、15（金丝桃苷）、16（异槲皮苷）、18对抗氧化指标IC50有显著影响，为主要的药效基础。物质药效往往与化学结构息息相关，据报道，酚羟基的位置以及数量可影响抗氧化的活性大小 [13]。在绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷以及异槲皮苷化学结构中，均含有两个及以上的酚羟基，这可能为其抗氧化贡献度较大的原因之一。在指纹图谱中，峰8、9、15含量较高，而峰13、14、16、18含量偏低，说明指纹图谱能较为直观地体现药材内在化学成分的种类与数量，但无法阐述药材成分与药理活性存在绝对的内在关联 [14]。本研究仅指认一部分有效峰，具有一定的局限性，以期后面从质谱等高分辨手段入手，结合药效分析各化学成分结构骨架，进一步确定抗氧化的活性物质。
1.中国药典2020年版. 一部[S]. 2020: 190.
2.赵唯年, 潘新波, 赵丽娟, 等. 不同炮制方法对菟丝子醇提物中总黄酮、总多糖及7种成分的影响[J]. 中国中医药信息杂志, 2022, 29(11): 97-103. [Zhao WN, Pan XB, Zhao LJ, et al. Effects of different processing methods on total flavonoids, total polysaccharides and seven components in the alcohol extract of Cuscutae semen[J].Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine, 2022, 29 (11): 97-103.] DOI: 10.19879/j.cnki. 1005-5304.202201308.
3.徐长丽, 石芸, 梁裕莎, 等. 菟丝子的研究进展及质量标志物(Q-marker)的预测分析[J]. 中南药学, 2022, 20(7): 1610-1616. [Xu CL, Shi Y, Liang YS, et al. Research status of Cuscuta semen and the prediction of quality markers[J]. Central South Pharmacy, 2022, 20(7): 1610-1616.] DOI: 10.7539/j.issn.1672-2981. 2022.07.023.
4.张伟, 孙叶芬, 金传山, 等. 中药配方颗粒研究现状与展望[J]. 中草药, 2022, 53(22): 7221-7233. [Zhang W, Sun YF, Jin CS, et al. Research status and prospect of traditional Chinese medicine formula granules[J]. Chinese herbal medicine, 2022, 53(22): 7221-7233.] DOI: 10. 7501/j.issn.0253-2670.2022.22.027.
5.姚晓璇, 王瑜婷, 邱彩月, 等. 菟丝子饮片、水煎液和配方颗粒的HPLC指纹图谱相关性研究[J]. 广东药科大学学报, 2022, 38(2): 24-30. [Yao XX, Wang YT, Qiu CY, et al. Study on the correlation of HPLC fingerprint of Cuscutae semen pieces, water decoction and formula granules[J]. Journal of Guangdong Pharmaceutical University, 2022, 38(2): 24-30.] DOI: 10.16809/j.cnki. 2096-3653.2021111702.
6.瞿领航, 曹国胜, 涂济源, 等. 基于灰色关联度与正交偏最小二乘法分析的苍术挥发油燥性谱效关系研究[J]. 中草药, 2019, 50(1): 150-156. [Qu LH, Cao GS, Tu JY, et al. Spectrum-effect relationship of dryness of Atractylodis Rhizoma volatile oil based on grey relational grade and orthogonal partial least squares analysis[J]. Chinese Herbal Medicine, 2019, 50(1): 150-156.] DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2019.01.023.
7.Zhu CS, Lin ZJ, Xiao ML, et al. The spectrum-effect relationship——a rational approach to screening effective compounds, reflecting the internal quality of Chinese herbal medicine[J]. Chin J Nat Med, 2016, 14(3): 177-184. DOI: 10.1016/S1875-5364(16)30014-0.
8.何广铭, 曹斯琼, 周湘媛, 等. 菟丝子盐炙前后HPLC指纹图谱的变化研究[J]. 广东药科大学学报, 2021, 37(1): 23-29. [He GM, Cao SQ, Zhou XY, et al. Study on the HPLC fingerprint of Cuscutae Semen and its processed products strifried with salt[J]. Journal of Guangdong Pharmaceutical University, 2021, 37 (1): 23-29.] DOI: 10.16809/j cnki.2096‐3653.2020082202.
9.王亚楠, 包永睿, 王帅, 等.基于多波长融合的菟丝子多成分定量方法研究[J]. 中南药学, 2021, 19(3): 517-521. [Wang YN, Bao YR, Wang S, et al. Multi-component quantitative method for Cuscutae semen based on multi-wavelength fusion [J]. Central South Pharmacy, 2021, 37 (1): 23-29.] DOI: 10.7539/j.issn.1672-2981.2021.03.025.
10.陈蕾, 赵陆华, 谭喜莹. HPLC法同时测定菟丝子药材中酚酸和黄酮类成分含量[J]. 药学与临床研究, 2018, 26(2): 101-103. [Chen L, Zhao LH, Tan XY, et al. Simultaneous determination of flavonoid active components and phenolic acids in Semen cuscutae by HPLC[J]. Pharmaceutical and Clinical Research, 2018, 26 (2): 101-103.] DOI: 10.13664/j.cnki.pcr.2018.02.007.
11.金衡宇, 张谨莹, 丁洛阳, 等. 性情影响动物应激及抗氧化性能机制的研究进展[J]. 生命科学研究, 2022, 26(6): 487-494. [Jin HY, Zhang JY, Ding LY, et al.Research progress on the mechanism of temperament affecting stress and antioxidant performance in animals[J]. Life Science Research, 2022, 26(06): 487-494.] DOI: 10.16605/j.cnki.1007-7847.2021.06.0161.
12.Sayed SMA, Alseekh S, Siems K, et al. Identification of a hydroxygallic acid derivative, zingibroside R1 and a sterol lipid as potential active ingredients of Cuscutae Semen extract that has neuroprotective and antioxidant effects in aged Caenorhabditis elegans[J]. Nutrients, 2022, 14(19): 4199. DOI: 10.3390/nu14194199.
13.杨恬, 张忠, 秦潇潇, 等. 基于新型互作模型的多酚不同羟基的抗氧化性评价[J]. 食品安全质量检测学报, 2022, 13(22): 7422-7430. [Yang T, Zhang Z, Qin XX, et al. Antioxidative evaluation of different hydroxyl groups of polyphenols based on a novel interaction model[J]. Journal of Food Safety and Quality Inspection, 2022, 13 (22): 7422-7430.] DOI: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2022.22.050.
14.马悦, 胡相卡, 赵艳丹, 等. 基于COX-2酶活性的柴胡生物质量评价研究[J]. 中药药理与临床, 2019, 35(3): 91-95. [Ma Y, Hu XK, Zhao YD, et al. Study on bio-quality evaluation of Bupleuru chinensis based on COX-2 enzyme activity[J]. Pharmacology and Clinical Studies of Traditional Chinese Medicine, 2019, 35(3): 91-95] DOI: 10.13412/j.cnki.zyyl.2019.03.020.