目的  采用超高效液相色谱串联四极杆静电场轨道阱质谱（UPLC-Q-Exactive-MS）技术对接骨七厘片的化学成分及大鼠血中移行成分进行定性分析，为该制剂的体内有效物质研究提供参考。

方法  体外色谱条件：Hypersil GOLD C₁₈色谱柱（50  mm×2.1  mm，1.9 µm），流动相为0.1%甲酸水溶液和甲醇（梯度洗脱），柱温为30 ℃，进样量为5 µL；体外质谱条件：样品经电喷雾电离，采用正负离子双模式检测，扫描范围为m/z 100~1 500。体内色谱条件：ACQUITY HPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8  µm），流动相为95%水+5%乙腈和47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水（梯度洗脱），柱温为40 ℃，进样量为8 µL。体内质谱条件：样品经电喷雾电离，采用正负离子双模式检测，扫描范围为m/z 70~1 050。连续7 d灌胃给予SD大鼠接骨七厘片，通过腹主动脉取血获得含药血清及空白血清样品（雌、雄性接骨七厘片含药血清组和雌、雄性空白血清组）。采用非靶向LC-MS技术并利用Progenesis QI软件进行对比分析，鉴定大鼠血中移行成分。

结果  体外共鉴定出75种化合物，体内共鉴定出98种化合物，结合体内外鉴定的化学成分，共鉴定出7种入血成分，分别为甲基异茜草素、花生四烯酸、柠檬酸、焦谷氨酸、3-吲哚丙酸、16-羟基棕榈酸、油酸酰胺。

结论  该方法高效、准确灵敏，为今后在接骨七厘片药效物质基础和质量控制研究提供科学参考。

中药血清药物化学是通过口服给药，对比药物、空白血清与含药血清的图谱差异，从而对血中移行成分进行鉴定^[1]，可以反应机体对药物吸收代谢和药物在体内相互作用的影响，有效避免体外化学成分盲目分离引起的假阳性或假阴性现象^[2]。因此，鉴定血中移行成分是探究中药及其复方药效物质基础不可或缺的一步。

接骨七厘片源自于清代沈金鳌《杂兵源流犀烛》中接骨紫金丹衍生而来，由当归、烫骨碎补、炒乳香、炒没药、酒大黄、土鳖虫、血竭、硼砂、煅自然铜9味药组成^[3]，具有活血化瘀、接骨止痛等药效作用^[4]。临床研究表明，接骨七厘片对桡骨远端骨折与胫腓骨骨折功能恢复具有良好效果，同时还能缩短临床症状消失时间，缓解疼痛^[5-6]。在以往的研究中，通常是对复方中单味药进行分析，结果表明当归主要药效成分有当归多糖、挥发油藁本内酯、阿魏酸等^[7]；骨碎补黄酮类物质（柚 皮苷、木犀草素、山奈酚等）具有促进骨折愈合、抗骨质疏松、抗炎等作用^[8]；乳香主要有效成分为β-乳香酸、α-香树脂素、乳香醇等萜类物质^[9]；目前从没药中共鉴定出的成分有100多种，主要的化学成分为苍术内酯Ⅲ、木香烃内酯、莪术二酮等，大黄蒽醌类化合物（大黄酸、大黄素、大黄酚等）是发挥药效的基础物质^[10]；土鳖虫所含成分主要是氨基酸类（谷氨酸、天冬氨酸等、脂溶性物质、生物碱类核苷类等物质^[11]；血竭有效成分主要为黄酮类物质（黄烷、黄烷醇、查尔酮等）^[12]；硼砂与煅自然铜属于矿物质类中药，主要成分为镁、铁、锌等无机化合物，但目前鲜有对接骨七厘片的化学成分及血中移行成分进行报道。因此，有必要进一步研究该复方所含化学成分并明确其药效物质基础。本研究采用超高效液相色谱串联四极杆静电场轨道阱质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-exactive-mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive-MS）技术对接骨七厘片化学成分及大鼠血中移行成分进行测定，为其药效物质基础研究提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Q-Exactive HF-X质谱仪与HPLC液相色谱系统（美国Thermo Fisher Scientific）；Centrifuge 5424R型冷冻离心机（德国Eppendorf）；SBL-10TD型控温超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；NewClassic MS型电子天平（瑞士Mettler-Toledo）；LNG-T88台式快速离心浓缩干燥器（太仓市华美生化仪器厂）。

1.2 主要药品与试剂

自制接骨七厘片（规格：每片相当于原生药量0.3 g，批号：20180401），9味药材当归、土鳖虫、炒乳香、炒没药、烫骨碎补、硼砂、血竭、煅自然铜、酒大黄均由湖南金沙药业有限责任提供，批号分别为：20221101、20221103、P045221210、P044221107、20221106、Y005221002、Y064220820、P047221002、P00120221002；甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 动物

SPF级SD大鼠24只，雌雄各半，体重（200±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004；饲养于湖南新领航检测技术有限公司屏障环境，实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2022-0005，室温20.0~26.0 ℃，相对湿度40.0%~70.0%。该研究所有操作严格按照我国实验动物福利伦理相关法律法规和湖南新领航检测技术有限公司相关标准操作规程执行（伦理审批号：IACUC-XLH-2023-107）。

1.4 方法

1.4.1 样品的制备

①接骨七厘片样品的制备。精密称取0.5 g接骨七厘片干燥粉末置具塞锥形瓶中，加入50 mL 50%甲醇水称定重量，超声（功率：500 W，频率：40 kHz）提取30 min，静置放冷后用50%甲醇水补足减失的重量，摇匀，0.22 µm微孔滤膜过滤，得到接骨七厘片50%甲醇提取液。

②接骨七厘片含药血清样品的制备。SD大鼠适应性喂养1周后随机分为雌、雄性空白对血清和雌、雄性接骨七厘片含药血清组。含药血清组给药剂量按成人临床等效剂量的2倍计算为0.54 g/ kg，每日称取1.56 g接骨七厘片干燥粉末（含损耗量）加入25 mL水，混匀得到接骨七厘片水溶液，含药血清组给予接骨七厘片水溶液灌胃（1 mL/100 g）；空白血清组给予等体积超纯水，连续灌胃两周。末次给药1 h后通过乙醚麻醉进行腹主动脉取血，4 ℃条件下1 006.2×g下离心10 min，收集血清。

取含药血清样本100 µL，加入含L-2-氯苯丙氨酸等4种内标300 µL提取液中，涡旋混匀，低温超声提取30 min后置于-20 ℃ 30 min；4 ℃条件下18 894.2×g离心15 min，取上清液氮气吹干，加入100 µL复溶液（乙腈 ∶ 水=1 ∶ 1）复溶涡旋，超声萃取5 min后，4 ℃条件下18 894.2×g离心10 min，取上清液。

1.4.2 色谱条件

①体外色谱条件。采用Hypersil GOLD C₁₈色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.9 µm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0~5 min，5%~30% B；5~10 min，30%~60% B；10~28 min，60%~100% B；28~30 min，100% B），柱温为30 ℃，进样量为5 µL。

②体内色谱条件。采用ACQUITY HPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm），流动相为95%水+5%乙腈（A）-47.5%乙腈 +47.5%异丙醇+5%水（B），梯度洗脱（0~3 min，100%~80% A；3~4.5 min，80%~65% A；4.5~5 min，65%-0% A；5~6.4 min，0% A；6.4~8 min，0%~100% A），柱温为40 ℃，进样量为8 µL。

1.4.3 质谱条件

①体外质谱条件。样品经电喷雾电离，采用正负离子双模式检测，扫描范围为m/z 100~1 500，鞘气流速为35 arb，辅助气流速为13 arb，辅助气温度为375 ℃，毛细管温度为320 ℃，正负离子模式毛细管电压分别为3 500 V和-3 500 V，全扫描分辨率为60 000，二级质谱分辨率为7 500。

②体内质谱条件。样品经电喷雾电离，采用正负离子双模式检测，扫描范围为m/z 70~1 050，鞘气流速为50 arb，辅助气流速为13 arb，辅助气温度为425 ℃，毛细管温度为325 ℃，正负离子模式毛细管电压分别为3 500 V和-3 500 V，全扫描分辨率为60 000，二级质谱分辨率为7 500。

2 结果

2.1 接骨七厘片体外成分鉴定

通过优化液相和质谱条件后，经Accurate-Mass Q-TOF获得正负离子模式下接骨七厘片质谱图（图1）。经Compound Discoverer 3.2.0.421数据库比较分析，初步鉴定75个化合物，包括6个苯丙素类化合物、4个生物碱类化合物、8个黄酮类化合物、3个萜类化合物、4个醌类化合物、3个酚类化合物、2个香豆素类化合物、2个嘌呤代谢物、1个糖苷类化合物、4个有机酸、7个氨基酸、10个脂肪酸、4个酰胺类化合物以及17个其他化合物，具体见表1。

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  图1 接骨七厘片50%甲醇提取液的正负离子模式质谱图

  Figure 1.Positive and negative ions mode mass spectra of 50% methanol extraction solution of Jiegu Qili tablets

  注：A. 负离子模式；B. 正离子模式。

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  表格1 接骨七厘片50%甲醇提取液成分鉴定表

  Table 1.The ingredient identification form of 50% methanol extraction solution of Jiegu Qili tablets

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2.1.1 蒽醌类化合物

本试验共鉴定出4种蒽醌类化合物，该类化合物主要以[M-H]^-分子离子峰形式存在。以47号化合物为例，准分子离子峰为m/z 254.057 40，推测其分子式为C₁₅H₁₀O₄。其脱去1个CO得到m/z 225.05 [M-H—CO]^-的离子碎片，或失去1个CO₂得到m/z 209.15 [M-H—CO₂]^-的离子碎片，分别再失去1个CO₂和1个CO得到m/z 182.09 [M-H—CO—CO₂]^-的离子碎片。与相关文献^[22]比对，推测其为甲基异茜草素。其裂解过程见图2。

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  图2 茜草素可能的裂解过程

  Figure 2.Possible cleavage of alizarin

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2.1.2 黄酮类化合物

本试验共鉴定出8种黄酮类化合物。以32号化合物为例，其分子离子峰为287.055 56 [M-H]^-，推测其化合物为C₁₅H₁₂O₆。其中获得m/z 151.00、m/z 135.04、m/z 107.01等离子碎片（图3），与相关文献^[23]相比较，推测其为圣草酚。

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  图3 圣草酚二级质谱图

  Figure 3.Secondary mass spectra of holy herbol

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2.1.3 苯丙素类化合物

本试验共鉴定出6个苯丙素类化合物，该化合物主要以[M-H]^-分子离子峰形式存在。以21号化合物为例，其分子离子峰为353.087 26 [M- H]^-，推测其分子式为C₁₆H₁₈O₉。其脱去1分子C₉H₅O₃得到m/z 191.06 [M-H—C₉H₅O₃]^-的离子碎片，或脱去1分子C₆H₉O₅得到m/z 179.03 [M-H-C₆H₉O₅]^-的离子碎片。与相关文献^[24]相比较，推测其为绿原酸。其裂解过程见图4。

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  图4 绿原酸可能的裂解过程

  Figure 4.Possible cleavage process of chlorogenic acid

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2.1.4 生物碱类化合物

本试验共鉴定出4个生物碱类化合物，该化合物主要以[M+H]⁺分子离子峰形式存在。以24号化合物为例，准分子离子峰为348.117 73，推测其分子式为C₂₀H₁₆N₂O₄。其脱去1分子CO₂得到m/ z 303.09 [M+H—CO₂]⁺的离子碎片，再失去1分子C₃H₄O得到m/z 245.05 [M+H—CO₂—C₃H₄O]⁺的离子碎片，然后再失去C₆H₄O₃得到m/z 166.53 [M+H—CO₂—C₃H₄O—C₆H₄O₃]⁺的离子碎片。与相关文献^[25]比对，推测其为喜树碱。其裂解过程见图5。

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  图5 喜树碱可能的裂解过程

  Figure 5.Possible cleavage process of camptothecin

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2.1.5 有机酸类化合物

本试验共鉴定出4个有机酸类化合物，该化合物主要以[M-H]^-分子离子峰形式存在。以10号化合物为例，准分子离子峰为192.026 06，推测其分子式为C₆H₈O₇。其二级质谱获得m/ z 191.02、m/z 111.01、m/z 173.01等离子碎片（图6），其中失去1分子CO₂和2分子H₂O获得m/z 111.01 [M-H—CO₂—2H₂O]^-离子碎片。与相关文献^[26]对比，推测其为柠檬酸。

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  图6 柠檬酸在负离子模式下二级质谱图

  Figure 6.Secondary mass spectra of citric acid in negative ion mode

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2.1.6 其他类化合物

在上述化合物基础之上，还鉴定出3个萜类、3个酚类、2个嘌呤代谢物、1个糖苷类、7个氨基酸、10个脂肪酸、4个酰胺类及17个其它化合物。分析鉴定方法同黄酮类、蒽醌类等鉴定过程。

2.2 接骨七厘片血中移行成分鉴定

参照体外化学成分鉴定方法及相关文献，对接骨七厘片血清样品通过LC/MS检测，得总离子色谱图（图7）。结合体外化学成分，共鉴定出7个入血成分，分别为甲基异茜草素、花生四烯酸、柠檬酸、焦谷氨酸、3-吲哚丙酸、16-羟基棕榈酸、油酸酰胺。其结构见图8。

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  图7 接骨七厘片含药血清总离子色谱图

  Figure 7.Total ion chromatogram of medicated serum of Jiegu Qili tablets

  注：A. 正离子模式；B. 负离子模式；1. 焦谷氨酸；2. 3-吲哚丙酸；3. 油酸酰胺；4. 柠檬酸；5. 甲基异茜草素；6. 花生四烯酸；7. 16-羟基棕榈酸。

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  图8 接骨七厘片入血成分结构

  Figure 8.The structure of the blood components of Jiegu Qili tablets

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2.2.1 接骨七厘片含药血清HMDB分类

对所鉴定的化合物进行HMDB（Human Metabolome Database）分类，脂质与脂质样分子占比最重，为45.78%（141种），其次为有机酸及其衍生物18.51%（57种）、有机杂环化合物10.71%（33种）、苯类化合物8.12%（25种）、有机氧化合物5.19%（16种）等，其中能明确鉴定出98种化合物。接骨七厘片含药血清HMDB分类图见图9。

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  图9 接骨七厘片含药血清HMDB分类图

  Figure 9.HMDB classification diagram of medicated serum of Jiegu Qili tablets

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2.2.2 接骨七厘片含药血清PLS-DA分析

对血清样本进行偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），以和Y矩阵的解释率（R²Y）、模型的预测能力（Q²）等考察模型的有效性及可靠程度，一般认为参数R²Y和Q²＞0.5则模型可靠。如图10所示，含药血清雌、雄性组和空白血清雌、雄性组明显分开，说明含药血清中与正常血清中的化学成分发生明显变化；正常雌性组与正常雄性组、含药血清雌性组与含药血清雄性组均明显分开，说明含药血清雌雄两组、正常雌雄两组化学成分也存在明显差异。

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  图10 接骨七厘片含药血清各类成分PLS-DA得分图

  Figure 10.PLS-DA score plot of various components of medicated serum of Jiegu Qili tablets

  注：A. 正离子模式；B. 负离子模式；CN0为空白血清雌性组；CN为空白血清雄性组；P为含药血清雄性组；P0为含药血清雌性组；QC为质控样本。

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2.2.3 接骨七厘片含药血清代谢物聚类分析

研究表明，大鼠性别不同，其吸收、分布、代谢、排泄可能存在差异^[27]。如图11所示，大鼠性别不同，其排名前50的接骨七厘片代谢物存在明显差异，性别相同其成分大部分相同，对于雌性大鼠，含药血清组与正常血清组中12(R)-HETE、NLc5Cer、PE-NMe2（18 ∶ 1（11Z）/15 ∶ 0）、L-赖氨酸、异丁烯、丙酸、L-脯氨酸、CDP-DG（i-18 ∶ 0/LTE4）、SM（d14 ∶ 1/20 ∶ 0）等存在明显差异；对于雄性大鼠，含药血清组与正常血清组中12(R)-HETE与11,17-二羟基-3,20-二氧戊环-4-烯-21-乙酸酯存在明显差异，但性别的差异导致药物在大鼠体内代谢物差异是否会影响到接骨七厘片的药效作用还有待进一步研究。

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  图11 接骨七厘片含药血清聚类热图

  Figure 11.Cluster heatmap of medicated serum of Jiegu Qili tablets

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3 讨论

中药复方接骨七厘片具有较好的接骨止痛的作用，然而现有研究对于复方中有效化学成分及其入血成分尚不清楚，因此明确其主要化学成分及大鼠体内成分对于揭示接骨七厘片的药效物质基础，阐明其药效作用具有重要意义。

本研究主要通过UPLC-Q-Exactive-MS技术鉴定接骨七厘片成分及含药血清成分，分别得到相应质谱图，同时获得各成分的保留时间、相对分子质量与特征结构碎片等重要信息，结合数据库鉴定入血成分。本研究将接骨七厘片水溶液、50%甲醇溶液、纯甲醇溶液进行UPLC-Q-Exactive-MS分析比较，结果发现接骨七厘片50%甲醇提取液的响应较多，并进一步分析共鉴定出75种化合物。通过LC-MS技术对大鼠体内成分进行鉴定，结果发现空白对照组与接骨七厘片给药组化学成分存在明显差异，且性别不同其成分也存在一定差异。

结合体内外化学成分，共鉴定出7种入血成分，分别为甲基异茜草素、花生四烯酸、柠檬酸、焦谷氨酸、3-吲哚丙酸、16-羟基棕榈酸、油酸酰胺。研究表明，甲基异茜草素能明显抑制破骨前体细胞分化，削弱破骨细胞的过度激活从而抑制骨吸收，对因破骨细胞功能增强导致的骨质疏松、风湿性关节炎、癌症骨转移等骨代谢疾病有一定启示^[28]；柠檬酸可作为一种有效的骨靶向修饰分子，能显著提高药物递送系统的骨靶向性，在骨酸性条件下实现药物的快速释放，减少绝经后骨质疏松小鼠的骨质流失^[29]。花生四烯酸通过与二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸结合显著增加骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并增加成骨Runt相关转录因子2的表达^[30]。研究表明甲基异茜草素、柠檬酸、花生四烯酸药理作用与接骨七厘片主要功效相吻合。而对于另外几种化合物，3-吲哚丙酸有益于肠上皮屏障功能并能缓解结肠炎小鼠免疫细胞的炎症反应^[31]并能通过修复肠道屏障及缓解炎症达到治疗2型糖尿病的效果^[32]；油酸酰胺能显著抑制脂多糖诱导的炎症因子的产生^[33]；焦谷氨酸能缓解高盐饮食小鼠肠道结构受损，降低小肠炎症因子的分泌^[34]且其与贝壳碳酸钙反应后生成的焦谷氨酸钙对抗骨质疏松有一定的效果^[35]。研究药物在体内的代谢过程和产物，是揭示药物在体内发挥作用的关键物质基础^[36]。这些成分能够经口服被吸收入血，很可能在机体内协同发挥其药效作用，可能是接骨七厘片的药效物质。

综上，本研究在大鼠体内检测到的入血成分较少，推测可能是由于血清样品中存在其他内源性物质，这些物质在机体代谢中可能发生质变而未被鉴定出来。因此，接骨七厘片的药效物质还需进一步挖掘。

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