目的  应用分子生物学鉴定技术，筛选出应用于鉴定青葙子与鸡冠花子的最佳DNA条形码，建立快速、准确、便捷的青葙属植物鉴定方法。

方法  收集青葙子、鸡冠花子样品共计21份，提取样品总DNA，对内部转录间隔区（ITS）、psbA-trnH、matK、rbcL和trnL-trnF序列进行扩增和测序，采用MEGA-X软件对数据进行分析处理，计算Kimura-2-parameter遗传距离，建立邻接聚类进化树，进行对比分析，基于TaxonDNA计算BestMatch、BestCloseMatch以评估DNA条形码的鉴别能力，利用ITS2数据库和RNAfold数据库预测条形码序列二级结构。

结果  条形码ITS、matK、psbA-trnH、rbcL、trnL-trnF序列均扩增成功且具有较高的测序成功率，其中psbA-trnH具有最多的变异位点，ITS次之。psbA-trnH、ITS2、trnL-trnF具有较明显的条形码间隙，以psbA-trnH最为显著（100%）。系统进化树显示，IITS、ITS2、psbA-trnH、matK、trnL-trnF序列均可将青葙子与鸡冠花子各自聚为一支，各分支点的支持率均高于60%，以psbA-trnH、trnL-trnF的各分支点的支持率最高（99%）。分子方差分析结果显示psbA-trnH序列的群体遗传分化指数最高，适用于区分青葙子和鸡冠花子物种间差异。除matK外，青葙子与鸡冠花子psbA-trnH、ITS2、trnL-trnF序列的二级结构均有差异。

结论  以psbA-trnH为主、ITS和trnL-trnF为辅，可实现青葙子和鸡冠花子的准确鉴定。

青葙属Celosia L.为苋科植物中的一类，约60种，分布于非洲、美洲和亚洲亚热带和温带地区，我国产3种：青葙Celosia argentea L.、鸡冠花Celosia cristata L.和台湾青葙Celosia taitoensis Hayata。青葙，别名野鸡冠花、指天笔、牛尾巴花等，苋科青葙属1年生草本植物，子实入药，具有清肝泻火、明目退翳等功效，用于治疗肝热目赤、目生翳膜、视物昏花、肝火眩晕等疾病[1]。鸡冠花，别名鸡公花、老来少、鸡髻花等，为苋科青葙属1年生草本植物，源自亚洲热带和非洲地区，目前在我国已大面积种植。其花、茎叶、籽均可入药，具有收敛止血、止带、止痢等功效，用于治疗吐血、崩漏、便血、痔血、赤白带下、久痢不止等疾病[1]。青葙子在我国分布广泛，同属植物鸡冠花子和苋属多种植物的干燥成熟种子与青葙子在性状上极为相似，种子细小且难以区分，且由于各地用药习惯的影响而误收误用，造成了目前青葙子药材品种混乱，质量低劣等问题。利用传统的基原鉴定和性状鉴定难以准确快速地进行鉴别，因此，需要建立一种通用、快速、准确的青葙属药材方法。

随着分子生物学技术的发展，免疫鉴定法、特异聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）标记法、生物效价测定法和DNA条形码等生物学鉴定方法在中药材鉴定领域应用越来越广泛，其中DNA条形码鉴定技术的出现，开启了中药材分子鉴定的新篇章。该技术能够在不受样本形态影响的情况下，通过分子生物学方法，从基因层面比较 DNA序列的差异，从而最大限度地减少人为自主因素的影响，使鉴定结果更加准确，已实现中药鉴定的自动筛选与规范化 [2]。《中国药典》测序技术指导原则中，将植物类药材的主序列定为内部转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2），辅助序列为psbA-trnH，将动物药材主序列定为细胞色素c氧化酶亚基I，以ITS2为辅助序列，生命条形码联盟植物工作组基于大量实验推荐采用双基因组合“rbcL+matK”作为陆生植物鉴定的DNA条形码 [3-4]。目前鸡冠花子和青葙子的鉴别主要为传统鉴别方法，即性状鉴别和显微鉴别 [5- 8]，此二者外观性状极为相似，采用传统鉴别方法对其性状完整性要求较高，而中药DNA分子鉴别方法不受样品形态限制，原药材及其粉末均可应用。

目前对青葙属植物研究多集中于化学成分及药效学研究部分，关于DNA分子鉴别研究方面鲜少有报道。本文本研究选取ITS、ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL和trnL-trnF等6个常用的植物DNA条形码序列，评估其对鸡冠花子和青葙子的分子鉴定效率，筛选适用于鸡冠花和青葙鉴定的DNA条形码序列，并进一步分析二者的遗传多样性，验证DNA条形码序列筛选的可靠性。

1 材料与方法

1.1 仪器

ME204E型万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；5425R型冷冻离心机（德国Eppendorf）；BLF-P₂₅型微孔板迷你离心机（上海一恒科技有限公司）；BioSpec-nano型紫外微量分光光度计（日本岛津）；T100型PCR仪（美国Bio-Rad）；Vortex型涡旋仪（上海达姆实业有限公司）；Owl Easy Cast B2型电泳仪（美国ThermoFisher Scientific）；NuGenius XE多功能凝胶成像系统（瑞士NuGenius）。

1.2 主要药品与试剂

琼脂糖（批号：S14003）和GelRed染料（批号：S24647）购自上海源叶生物科技有限公司；DNA Maker DL1000（批号：3591A）、DNA Maker DL2000（批号：3427A）和Mighty AMP DNA聚合酶（批号：R071A）购自TaKaRa；高效植物基因组DNA 提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，批号：DP350]；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

本试验收集21份样品，经广东一方制药有限公司潘礼业副主任中药师鉴定为青葙子和鸡冠花子，其中S1~S13为苋科植物鸡冠花子，S14~S21为苋科植物青葙子。药材标本保存于广东一方制药有限公司样品管理室，样品信息见表1。

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  表格1 青葙子和鸡冠花子样品信息

  Table 1.Sample collection information table of Celosiae semen and Celosia cristatae semen

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1.3 方法

1.3.1 样品DNA提取、PCR扩增和测序

分别取鸡冠花和青葙花干组织适量，于2.0  mL离心管中，置于研磨仪中研碎，取上述研碎粉末30 mg，研磨后置于 2.0 mL 离心管中，然后用植物基因组DNA试剂进行总DNA的提取，超微分光光度计检测其纯度和浓度，-20 ℃储藏备用。

PCR扩增：ITS、psbA-trnH、matK、rbcL、trnL-trnF序列的扩增引物和PCR程序见表2。基因片段的PCR扩增在PCR仪上完成。反应体系为50 μL，包括2 μL DNA模板，25 μL 2×PCR Buffer，0.5 μL的2.5 U/μL Mighty AMP，21.5 μL ddH₂O，10 μmol/L正反扩增引物各0.5  μL。PCR扩增反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，48℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，共5个循环；95 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，取4 μL扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将条带明亮、单一的产物回收，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。

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  表格2 PCR扩增引物及扩增程序

  Table 2.DNA barcode primer and amplification program

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1.3.2 数据分析

测序后得到的原始序列测序结果通过Bioedit进行测序质量判断，对于结果中的峰重叠区域大于50%的序列不列入分析，测序结果通过Seqman软件进行拼接，所得序列通过NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）根据得分来进行Blast序列相似性比对。采用HMMer注释方法从ITS序列中提取各样品的ITS2序列。采用MEGAX软件进行多重比对，获得各DNA条形码候选序列的特征和变异位点信息。基于K2P（Kimura-2-parameter）双参数模型计算种内和种间遗传距离；采用邻接法构建系统进化树；并根据Bootstrap（1 000次重复）检验各分支的支持率。对ITS2的二级结构进行预测（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/），采用RNAfold对psbA-trnH、matK、trnL-trnF序列进行二级结构预测，采用Arlequin3.5软件进行各条形码序列的分子方差分析。采用TaxonDNA软件的“BestMatch（BM）”“BestClosedMatch（BCM）”功能计算青葙属各条形码的鉴别成功率，并以此作为DNA条形码鉴别能力的指标之一。

2 结果

2.1 扩增成功率和测序成功率

本研究所有样品的条形码ITS、psbA-trnH、matK、rbcL、trnL-trnF序列进行PCR扩增，并采用凝胶电泳对扩增序列进行检验。按“扩增产物有明亮单一电泳条带”的标准统计扩增成功率，按“扩增产物经测获得高质量样本”的标准计算测序成功率。结果显示，ITS、psbA-trnH、matK、rbcL、trnL-trnF扩增成功率均为100%。测序成功率分别为100%、95%、100%、95%、81%。扩增电泳图见图1。

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  图1 扩增产物的琼脂糖凝胶检测电泳图

  Figure 1.Agarose gel detection electrophoresis of amplified products

  注：M. DNA Maker DL1000、DNA Maker DL2000；1-13. 鸡冠花子S1~S13；14-21. 青葙子S17~S24；N. ddH2O。

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2.2 物种鉴定能力评估

对123条序列在GenBank数据库中运用BLAST方法进行序列比对，比对率超过99%的视为鉴定到物种水平（对同一物种的多个样本取平均值）。结果显示，ITS、psbA-trnH、matK、trnF-trnL序列青葙子和鸡冠花子比对率均可达99.0%以上。

采用TaxonDNA软件的BM、BCM功能计算各条形码的鉴别成功率。结果显示，BM中matK和trnF-trnL的鉴别成功率最高（100.00%），ITS（95.00%）和psbA-trnH（94.73%）次之，由于rbcL序列不能区分青葙花和鸡冠花，因此鉴别效率为0%。在BCM中matK的鉴别成功率最高（100.00%），ITS（95.00%）和psbA-trnH（94.73%）次之，与BM结果保持一致，但trnF-trnL的鉴别效率降至89.47%，其原因为trnF-trnL在BCM分析中部分序列超过阈值5%被归为“no% match”。各条形物种鉴定率见表3。

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  表格3 各条形物种鉴定率

  Table 3.Identification rate of various DNA bar species

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2.3 序列特征和变异位点分析

本研究共获得青葙属2个物种21个样品的ITS2、ITS、psbA-trnH、matK、rbcL、trnL-trnF序列共123条序列，6个条形码候选序列的序列特征及变异位点信息见表4，从表可以看出ITS、ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL、trnL-trnF的一致性序列长度分别为448、215、638、758、595、953，GC含量变幅分别为55.18%~56.05%、56.74%~55.61%、24.46%~25.31%、35.22%~35.25%、43.00%、31.93%~31.50%。在6个条形码候选序列中，变异位点、简约信息位点和单一多态位点的占比均为psbA-trnH最高、rbcL最低，2倍简并位点占比最高是trnL-trnF、最低是ITS2，4倍简并位点占比最高为ITS2、最低为psbA-trnH。

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  表格4 青葙属药用植物6个条形码候选序列特征

  Table 4.Sequence characteristics of six candidate barcodes in medicinal plants of Celosia L.

  注：A和P分别指数目和所占比例。

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2.4 种内和种间遗传距离分析

基于ITS、ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL、trnL-trnF序列的种内和种间的遗传距离见表5，遗传距离分布柱状图见图2。结果显示，鸡冠花子与青葙子除rbcL序列，其余条形码种内遗传距离平均值均小于种间遗传距离平均值。6个条形码序列的种内变异按遗传距离平均值排序依次为：psbA-trnH＞ITS＞matK＞ITS2=trnL-trnF＞rbcL。6个条形码候选序列的种间变异按遗传距离平均值排序依次为：psbA-trnH＞ITS＞ITS2＞trnL-trnF＞matK＞rbcL。各条形码中每条序列对应的最大种内距离数值小于其最小种间距离的数据个数与总序列数的比值代表该条形码的条形码间隙（Barcoding gap） 的显著程度，比值越大则该条形码Barcoding gap 越显著。以psbA-trnH序列的Barcoding gap（100.00%）最显著；随后依次为trnL-trnF（94.70%）＞ITS2（75.00%）＞ITS（45.00%）＞matk（4.76%）。从图2可以看到ITS、matK序列的种内和种间遗传变异重叠比例较高，psbA-trnH序列种间遗传变异和种内遗传变异重叠比例较小，ITS2、trnL-trnF序列种间遗传变异和种内遗传变异无明显重叠。故psbA-trnH、ITS2、trnL-trnF序列可作为鉴别鸡冠花子和青葙子的核心条形码之一。

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  表格5 基于6个条形码候选序列计算的种内和种间遗传距离

  Table 5.Intra-and inter-specific genetic distances of six candidate barcodes

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  图2 5个条形码候选序列的种内和种间遗传距离分布

  Figure 2.Distribution of intra-and inter-specific genetic distances of five candidate barcodes

  注：A. ITS；B.ITS2；C.psbA-trnH；D.matK；E.trnL-trnF。

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2.5 系统发育树分析

一般说来，碱基转换发生的频率高于颠换，但是随物种分歧程度的增加，转换（ISS）/颠换（ISS.C）的比率接近或小于1，说明转换可能已经趋于饱和并可能成为进化杂音，故转换和颠换发生的频率与序列间分歧度的关系就可以反映出碱基替换是否受饱和效应的影响。采用DANBE软件分别对ITS、ITS2、psbA-trnH、matK、trnL-trnF5个条形码序列片段的碱基替换模式进行检测，结果见表6，以上5个条形码序列ISS均大于ISS.C值，即均不受饱和效应影响，可进行系统进化树分析。

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  表格6 替换饱和性检验

  Table 6.Replacement saturation test

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采用MEGA7.0软件基于K2P计算模型构建青葙子、鸡冠花子样品的IITS、ITS2、psbA-trnH、matK、trnL-trnF序列的邻接系统发育树。若同一物的所有个体形成一个单系，且分支点支持率大于50%，则认为该物种被准确鉴定。以上5种条形码序列均可将青葙子和鸡冠花子各自聚为一支，各分支点的支持率均高于60%，以psbA-trnH、trnL-trnF的各分支点的支持率最高（99%），其次为matK（66%），ITS2的邻接树中，鸡冠花子分支支持率为80%，青葙子分支支持率为62%，ITS的邻接树中，鸡冠花子分支支持率为62%，青葙子分支支持率为60%。可见上述5种条形码邻接树的区分能力方面，以psbA-trnH、trnL-trnF序列最强，matK、ITS2、ITS序列水平相差不大。具体见图3。

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  图3 基于ITS2（A）、ITS（B）、psbA-trnH（C）、matK（D）、trnL-trnF（E）序列构建青葙子、鸡冠花子植物邻接树

  Figure 3.Construction of neighbor-joining trees of Celosiae semen and Celosia cristatae semen plants based on ITS2 ITS2(A)、ITS(B)、psbA-trnH(C)、matK(D) and trnL-trnF (E) sequences

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2.6 分子方差分析

基于5个条形码序列进行分子方差分析，结果显示，种群间（种间）变异和种群内（种内）个体间变异对遗传差异均有极显著影响（P＜0.01）。基于ITS2、ITS、psbA-trnH、matK、trnL-trnF序列的群体遗传分化指数均较高，种间变异分别占72.33%、58.41%、75.56%、42.75%、61.85%，种内变异分别占27.77%、41.59%、24.44%、57.25%、38.15%，表明5个序列的种间或种内分子多样性均较高，其中psbA-trnH序列的种间变异百分率最高，最适用于区分青葙子和鸡冠花子的种间差异。具体见表7。

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  表格7 5个条形码候选序列分子方差分析

  Table 7.Molecular variation analysis of variance of five candidate barcodes

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2.7 二级结构预测分析

根据ITS2数据库预测的ITS2二级结构见图4。由图可以看出，青葙子与鸡冠花子的ITS2二级结构均由1个中心环和4个螺旋区（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区）组成。鸡冠花子中心环大于青葙子，青葙子螺旋区III经环数为5个，鸡冠花子为4个。根据RNAfold预测青葙子与鸡冠花子psbA-trnH、matK、trnL-trnF序列的二级结构，结果见图5~图7。psbA-trnH二级结构由1个中心环和6个螺旋区（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V、VI区）组成，主要差异在螺旋区II、III、VI。matK二级结构无差别，trnL-trnF二级结构由1个中心环和3个螺旋区，差异主要表现为茎环数目、位置、大小和螺旋发出时角度的不同。

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  图4 青葙子与鸡冠花子ITS2序列二级结构

  Figure 4.Secondary structure of ITS2 sequence of Celosiae semen and Celosia cnstatae.

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  图5 青葙子与鸡冠花子psbA-trnH序列二级结构

  Figure 5.Secondary structure of psbA-trnH sequence of Celosiae semen and Celosia cnstatae.

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  图6 青葙子与鸡冠花子matK序列二级结构

  Figure 6.Figre 6. Secondary structure of matK sequence of Celosiae semen and Celosia cnstatae.

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  图7 青葙子与鸡冠花子trnL-trnF序列二级结构

  Figure 7.Secondary structure of trnL-trnF sequence of Celosiae semen and Celosia cristatae.

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3 讨论

本试验选用5个条形码（ITS、psbA-trnH、matK、rbcL、trnL-trnF）筛选鉴定青葙子与鸡冠花子的最佳DNA条形码，所采集的21份样品中，5个条形码均PCR扩增成功且具有较高的测序成功率。在本研究评价体系中，理想的DNA条形码序列应具有明显的种间变异和较小的种内变异，即具有显著的Barcoding gap且BM、BCM中获得较高的鉴定成功率，同时该条形码所建立的系统发育树能将青葙子与鸡冠花子分开且单独聚为一支。DNA条形码可分为核糖体基因片段（如ITS）和叶绿体基因片段（如matK、psbA-trnH、rbcL、trnL-trnF）。核糖体基因片段ITS序列由ITS1、5.8S基因、ITS2区序列构成，较ITS2序列具更多的变异位点。本研究显示ITS在青葙属植物鉴别中，其变异位点在5个条形码中居于第2（2.68%），物种鉴定效率为95%，但其Barcoding gap较显著（45%）。

植物细胞内不同核糖体的进化水平可能存在差异，扩增产物可能被细菌、真菌等微生物的核糖体污染等，而叶绿体在结构、序列上相对保守，进化水平一致。psbA-trnH位于叶绿体基因psbA和trnH基因的间隔区（非编码区），两段存在保守序列，具有较快的进化速率[9]。但该片段不同物种间间隔区的长度或拷贝的变异性较大，序列长度变化区间为296~1 120 bp，且部分物种的psbA-trnH序列具有poly A/T结构，使得该片段不能得到广泛应用。本研究采用psbA-trnH条形码对青葙子与鸡冠花子进行测序鉴定，其扩增率为100%，测序成功率95%，变异位点占比最高6.11%，物种鉴别成功率为100%，具有显著的Barcoding gap（100.00%），所构建的进化树可将青葙子与鸡冠花子区分，二级结构上螺旋区二者有明显区别。

matK基因是叶绿体赖氨酸tRNA基因高度保守的2个外显子之间的内含子序列，为单拷贝编码基因，其进化速率介于ITS和rbcL之间[10]。本试验中扩增得到的matK序列为758 bp，变异位点占1.19%，物种鉴别率可达100%，所构建的进化树可将青葙子与鸡冠花子区分，但其Barcoding gap（除rbcL序列）最低（4.76%），二级结构上二者表达一致。因此在青葙子与鸡冠花子DNA条形码鉴别应用中非首选条形码。

rbcL位于叶绿体基因组大单拷贝区，编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亚基，在不同的植物类群中其进化速率不同，具有易扩增、易比对的优点。由于该序列物种变异水平不显著，导致物种难以进行有效鉴别[11]。本研究采用rbcL序列对青葙属植物进行鉴别，发现其扩增率可达100%，但青葙子与鸡冠花子两个物种的rbcL序列呈现一致。因此rbcL序列不能用于区分青葙子与鸡冠花子。

trnL-trnF序列位于叶绿体基因trnL内含子和trnL-F基因的间隔区，在进化上具有选择压力小和进化速率较快的特点。目前trnL-trnF条形码已被广泛用于植物属间、种间关系的鉴别[12-14]。本研究采用trnL-trnF条形码对青葙属植物进行鉴别，其扩增率可达100%，测序成功率较低（81%），变异位点占比0.52%，物种鉴别成功率BM为100%，BCM为89.47%，具有显著的Barcoding gap（94.70%），所构建的进化树可将青葙子与鸡冠花子区分，其二级结构在茎环数目、位置、大小和螺旋发出时角度有明显区别。综上所述，本课题组推荐使用psbA-trnH条形码作为鉴别青葙子与鸡冠花子首先序列，以ITS和trnL-trnF为辅助序列，以上序列能提供较多的遗传信息以准确鉴定青葙子与鸡冠花子，为青葙属药材的种类鉴定和种间分类地位提供分子生物学依据。

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