目的  为了更好控制产品质量，建立伤科跌打片的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱，同时测定芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄素甲醚10种成分的含量。

方法  采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C₁₈色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），以乙腈和0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为230 nm，进样量为5 μL。建立伤科跌打片的UPLC指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对10个生产企业74批伤科跌打片进行相似度评价，测定伤科跌打片10种成分的含量。

结果  伤科跌打片UPLC指纹图谱共标定出10个共有峰，74批伤科跌打片的相似度在0.85~0.99范围内。芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄素甲醚的线性关系良好，r均≥0.999 8，平均回收率在97.0%~105.1%范围内，RSD为0.4%~2.0%（n=6）。74批伤科跌打片中这10种成分的含量分别为：0.028~0.653、0.042~0.931、0.591~3.978、0.021~0.593、0~0.157、0.009~0.231、0.006~0.078、0.022~0.593、0.029~0.143、0.035~0.132  mg/片。

结论  成功建立伤科跌打片的UPLC指纹图谱，为伤科跌打片的质量评价提供依据，同时测定10个成分含量的方法操作简便，结果准确可靠。

伤科跌打片源于《中国名医验方汇编》，现收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第五册，其处方由大黄（制）、三七、续断、牡丹皮、当归、三棱（制）、制川乌、延胡索（醋制）、红花、郁金、地黄、五灵脂（制）、莪术（制）、青皮、香附（醋制）、蒲黄、防风、白芍（炒）、木香、乌药、柴胡、枳壳（炒）22味药组成。大黄、三七、郁金、白芍、青皮、木香、枳壳、延胡索8味粉碎成细粉入药，其余地黄等14味加水煎煮后入药。具有活血散瘀、消肿止痛的功效，临床常用于治疗跌打损伤、伤筋动骨、瘀血肿痛、闪腰岔气[1-3]。

现行标准仅收载大黄、三七和木香的鉴别方法，无含量测定项。现有文献关于伤科跌打片化学成分分析及质量标准的研究鲜有报道 [4- 5]。超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography ，UPLC）具有高分离度、高速度、高灵敏度等优点[6-10]，故本文拟建立伤科跌打片UPLC指纹图谱及10个成分的含量测定方法，并对来自10个生产企业的伤科跌打片质量进行研究，以期为有效评价伤科跌打片质量提供依据。

1 材料

1.1 主要仪器

BSA224S-CW万分之一电子天平和CP225D十万分之一电子天平购自德国Sartorius公司； ACQUITY ARC 超高效液相色谱仪，包括2489 UV/vis检测器和四元溶剂管理器（美国Waters公司）；AS20500BD超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品：芍药苷（批号：110736-202145，纯度94.6%）、柚皮苷（批号：110722-202116，纯度93.5%）、橙皮苷（批号：110721-202220，纯度97.2%）、新橙皮苷（批号：111857-201804，纯度99.4%）、芦荟大黄素（批号：110795-202011，纯度97.5%）、大黄酸（批号：110757-202308，纯度95.0%）、大黄素（批号：110756-201913，纯度96.0%）、木香烃内酯（批号：111524-202312，纯度99.6%）、去氢木香内酯（批 号：111525-202313，纯度99.8%）和大黄素甲醚（批号：110758-202218，纯度98.9%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇、磷酸为为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水；伤科跌打片来源信息见表1。

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  表格1 伤科跌打片来源信息

  Table 1.Source information of Shangke Dieda tablets

  注：“—”代表标准中未记载规格项。

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2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C₁₈（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色谱柱；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表2）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：230  nm；进样量：5 μL。

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  表格2 梯度洗脱程序

  Table 2.Gradient elution program

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2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液

精密称取芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、木香烃内酯、去氢木香内酯、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成每1 mL各含10 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取本品，研细，取约0.25 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超声（功率：300 W，频率：40 kHz）处理30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液

按工艺方法分别制备缺白芍、枳壳、青皮、木香、大黄的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 指纹图谱研究

2.3.1 精密度试验

精密吸取“2.2.2”项制备的同一供试品溶液（甘肃中天金丹，批号：220502）5 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定 6 次，以橙皮苷峰为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD ＜0.8%（n=6），相对峰面积RSD＜1.5%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取“2.2.2”项制备的同一供试品溶液（甘肃中天金丹，批号：220502），分别在室温放置0、8、16、24、36、42、48 h时取样，按“2.1”项下色谱条件进样分析，以橙皮苷峰为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD＜0.6%（n=7），相对峰面积RSD＜1.4%（n=7），结果表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取同一批号伤科跌打片（甘肃中天金丹，批号：220502），按“2.2.2”项方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样分析，以橙皮苷峰为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD＜1.1%（n=6），相对峰面积RSD＜2.4%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立

随机取 10 个生产企业的供试品各1批，按“2.2.2”项下方法制备 10 批伤科跌打片供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，采用中药指纹图谱相似度系统评价软件（2012.1版）对伤科跌打片样品的UPLC色谱图进行分析，以时间窗为0.1 min，采用平均数法、经多点校正进行峰匹配，生成对照指纹图谱（R），10批伤科跌打片UPLC指纹叠加图谱见图1。以橙皮苷为参照峰，分别计算10批样品与对照指纹图谱的相似度，结果见表3，相似度均＞0.90。

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  图1 10批样品的UPLC指纹图谱及对照指纹图谱

  Figure 1.UPLC fingerprints of 10 batches of samples and the reference fingerprint

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  表格3 10批样品的相似度比较

  Table 3.Comparison of the similarities of 10 batches of samples

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2.3.5 主要色谱峰的鉴定

分别取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，并按“2.1”项下色谱条件进样分析，将生成的色谱峰与伤科跌打片样品指纹图谱相应峰进行对比，并用DAD检测器进行确认，对10个特征峰进行了色谱峰的指认。结果发现色谱峰分别与各对照品相对应，样品指纹图谱中分别鉴定为芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、大黄素甲醚，具体见图2。

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  图2 伤科跌打片UPLC指纹图谱主要色谱峰鉴定

  Figure 2.Identification of the main characteristic peaks in the UPLC fingerprints of Shangke Dieda tablets

  注：1. 芍药苷；2. 柚皮苷；3. 橙皮苷；4. 新橙皮苷；5. 芦荟大黄素；6.  大黄酸；7. 大黄素；8. 木香烃内酯；9. 去氢木香内酯；10. 大黄素甲醚。

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2.3.6 主要色谱峰的归属

分别制备大黄（制）、三七、牡丹皮、当归、延胡索（醋制）、红花、五灵脂（制）、莪术（制）、青皮、香附（醋制）、蒲黄、防风、白芍（炒）、木香、乌药、柴胡、枳壳（炒）各单味药样品，以及缺白芍、缺枳壳、缺青皮、缺木香、缺大黄的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备各单味药供试品溶液和“2.2.3”项下方法制备各阴性样品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样分析，与样品的指纹图谱进行对比分析，并以各色谱图峰的保留时间以及DAD光谱图为鉴定标准，进行色谱峰的归属，结果见图3和图4。

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  图3 伤科跌打片的UPLC指纹图谱归属

  Figure 3.Attribution of the main characteristic peaks in the UPLC fingerprints of Shangke Dieda tablets

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  图4 伤科跌打片与阴性样品对照

  Figure 4.Comparison of Shangke Dieda tablet and negative samples

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2.4 10个成分的含量测定

2.4.1 线性关系考察

分别精密称取对照品芍药苷9.03 mg、柚皮苷11.31 mg、橙皮苷10.18 mg、新橙皮苷10.62 mg、木香烃内酯9.06 mg、去氢木香内酯10.70 mg、芦荟大黄素9.68 mg、大黄酸11.79 mg、大黄素11.41 mg、大黄素甲醚10.41 mg，加甲醇分别配制成对照品储备溶液。精密吸取各单一对照品储备溶液适量，制成每1 mL分别含芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木香烃内酯、去氢木香内酯1、10、50、100、200、300 μg，含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素0.4、4、8、20、40、60 μg，含大黄素甲醚0.2、2、4、10、20、30 μg的混合对照品溶液。取上述混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件进样分析，以进样质量浓度（X，μg/mL）对峰面积（Y）进行线性回归，回归方程、相关系数及线性范围见表4。结果表明，在线性范围内进样浓度与峰面积有良好的线性关系。

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  表格4 对照品标准曲线、相关系数及线性范围

  Table 4.Criteria curves, correlation coefficients and linearity ranges of reference substances

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2.4.2 系统适用性试验

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，在与对照品色谱峰相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，而阴性样品溶液则无干扰，表明该方法专属性良好，具体见图5。

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  图5 伤科跌打片UPLC色谱图

  Figure 5.UPLC chromatograms of Shangked Dieda Tablet

  注：A. 阴性样品溶液；B. 混合对照品溶液；C. 供试品溶液；1.  芍药苷；2. 柚皮苷；3. 橙皮苷；4. 新橙皮苷；5. 芦荟大黄素；6. 大黄酸；7. 大黄素；8. 木香烃内酯；9. 去氢木香内酯；10. 大黄素甲醚。

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2.4.3 精密度试验

精密吸取供试品溶液（甘肃中天金丹，批号：220502），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。计算得芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.6%、1.3%、0.7%、1.0%、0.9%、1.6%、0.2%、0.5%、0.8%、0.3%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验

精密吸取供试品溶液（甘肃中天金丹，批号：220502），分别在放置0、8、16、24、36、42、48 h时取样，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。计算得芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.5%、0.9%、0.7%、0.9%、0.9%、1.0%、0.4%、0.9%、0.9%、0.4%（n=7），结果表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验

取同一样品（甘肃中天金丹，批号：220502），按“2.2.2”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。计算得供试品中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的平均含量为1.382 1、1.677 7、4.811 6、1.158  5、0.270  8、0.498 3、0.124 0、0.206 0、0.292 4、0.203  0  mg/g，RSD分别为1.0%、1.5%、1.2%、1.1%、1.4%、1.5%、1.7%、1.5%、2.0%、2.3%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验

精密称取已知准确含量的样品（甘肃中天金丹，批号：220502）6份，各0.13 g，分别置25  mL量瓶中，精密加入芍药苷对照品溶液2  mL（0.091 1 mg/mL）、柚皮苷对照品溶液2  mL（0.112  0  mg/mL）、橙皮苷对照品溶液6  mL（0.102  1  mg/mL）、新橙皮苷对照品溶液1.5 mL（0.105 5 mg/mL）、木香烃内酯照品溶液0.4  mL（0.081 3 mg/mL），去氢木香内酯照品溶液0.8  mL（0.085 3 mg/mL），芦荟大黄素对照品溶液1  mL（0.018 9 mg/mL）、大黄酸对照品溶液1  mL（0.028  1  mg/mL）、大黄素对照品溶液1 mL（0.037  2  mg/mL）、大黄素甲醚照品溶液0.4 mL（0.066 8 mg/mL），按“2.2.2”项下方法制备回收率试验的供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。计算得芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的平均回收率分别为 99.4%、104.0%、101.6%、102.9%、97.0%、104.2%、97.1%、102.7%、105.0%、105.1%，RSD分别为1.2%、1.2%、2.0%、0.4%、1.9%、1.0%、1.3%、1.7%、1.9%、1.2%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.4.7 样品含量测定

按“2.2.2”项下方法制备74批伤科跌打片供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得伤科跌打片中10个化学成分的含量，结果见图6和表5。

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  图6 样品含量测定结果频数分布直方图

  Figure 6.Histogram of frequency distribution of sample measurement results

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  表格5 74批伤科跌打片10个化合物的含量（mg/片，n=3）

  Table 5.The content of 10 compounds in 74 batches of Shangke Dieda tablets (mg/tables, n=3)

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3 讨论

3.1 检测波长的选择

将对照品溶液置于紫外-可见分光光度计中，从200~400 nm波段进行全波长扫描。结果表明最大吸收波长：芍药苷230 nm、柚皮苷 227  nm、橙皮苷227 nm、新橙皮苷227 nm、木香烃内酯209  nm、去氢木香内酯204 nm，其中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷最大吸收波长均在 230  nm左右，木香烃内酯、去氢木香内酯最大吸收波长均在 210 nm左右，但在紫外吸收末端，基线杂质峰较多，波长在230 nm处基线杂质峰少，且吸收值也相对较高，故检测波长定为230 nm。

3.2 流动相的选择

本研究考察了不同流动相系统，分别为甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%磷酸溶液。根据获得的色谱峰的峰形、色谱峰数目和分离度，结合所选取的检测波长，最终确定以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相。

3.3 指纹图谱分析

本研究建立了伤科跌打片的UPLC指纹图谱，共指认出10个指标性成分。10个企业的74批伤科跌打片的相似度在0.85~0.99，表明不同企业的伤科跌打片的质量存在差异，并且从相似度结果亦可发现同一企业的不同批次样品也存在一定的差异。参考《中国药典（2020版）》一部复方丹参滴丸【指纹图谱】，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90，此限度与平均值相比较，较合理。因此将伤科跌打片指纹图谱相似度定为不得低于0.90。

3.4 含量测定结果分析

所测定74批伤科跌打片中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄素甲醚的含量分别为0.028~0.653、0.042~0.931、0.591~3.978、0.021~0.593、0~0.157，0.009~0.231、0.006~0.078、0.022~0.593、0.029~0.143、0.035~0.132 mg/片，结果表明未在现行标准中控制的指标成分，其同一厂家不同批次的含量结果相差2~8倍，不同厂家的含量结果相差10~70倍，分析原因可能是投料用原药材的质量差异较大，也可能是不同厂家的生产工艺存在差别，本研究为控制有效成分的含量，提高药品质量标准提供参考。

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