目的  检测长链非编码RNA（lncRNA）PCAT19在胃癌组织和细胞株中的表达水平，并探讨其对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及作用机制。

方法  采用RT-qPCR检测胃癌组织及3种胃癌细胞株（MKN-45、BGC-823、MGC-803）中lncRNA PCAT19的表达水平。对胃癌组织中lncRNA PCAT19的表达水平与患者临床病理特征进行相关性分析。通过si-PCAT19转染干扰MGC-803细胞中lncRNA PCAT19表达，CCK-8实验检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western blotting实验检测对增殖和凋亡相关蛋白表达的影响。

结果  与癌旁组织相比，胃癌组织中lncRNA PCAT19的表达水平明显升高（P＜0.05），且其表达水平与胃癌浸润程度呈正相关（P＜0.05）。与人胃黏膜上皮细胞GES-1相比，3株胃癌细胞中lncRNA PCAT19的表达水平均明显升高（P＜0.05）。与si-NC组比较，si-PCAT19组MGC-803细胞的增殖能力降低（P＜0.05），凋亡能力升高（P＜0.05），细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白表达降低（P＜0.05），天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶9（Caspase-9）蛋白表达升高（P＜0.05）。

结论  lncRNA PCAT19在胃癌组织和细胞中高表达，下调lncRNA PCAT19能抑制胃癌细胞增殖并促进凋亡，其机制可能和调控Cyclin D1、Caspase-9蛋白表达有关。

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，也是全球发病率和病死率较高的恶性肿瘤之一[1-2]。我国是胃癌高发国家，发病和死亡人数约占全球的50%以上 [3]。虽然我国在胃癌的早期筛查和诊断方面已经取得了较大的进步，但总体情况仍不容乐观，患者的5年生存率仍低于27.4%[4]。近来研究表明，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在胃癌的增殖、侵袭、转移以及血管生成等过程中发挥重要的调控作用，有望成为新的治疗靶点[5-6]。本研究通过检测lncRNA PCAT19在胃癌组织与细胞系中的表达差异，并通过抑制lncRNA PCAT19在人胃癌细胞株MGC-803中的表达，从而探讨lncRNA PCAT19对胃癌细胞可能的作用机制研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象

纳入2020年11月至2022年12月武汉市第一医院病理结果检测确诊为胃癌的患者，收集患者术后癌旁组织（距胃癌组织边缘超过5  cm）样本。纳入标准：①经术后病理诊断为胃癌；②术前未进行放疗和化疗；③临床资料和病理组织样本相对完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；② 患有精神疾病或严重慢性病者。本研究中所有患者均知情同意，研究经武汉市第一医院医学伦理委员会审批通过（伦理审批号：W2023-07-01）。

1.2 材料与试药

1.2.1 主要仪器

MCO-18AIC型细胞培养箱（日本三洋公 司）；LB941多功能酶标仪（德国Berthold公司）；ABI7500荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；ECLIPSE Ts2倒置显微镜（日本Nikon公司）；T100梯度PCR仪、PowerPac Universal型电泳仪、ChemiDoc™ 凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2.2 主要药品与试剂

人胃黏膜上皮细胞GES-1及3株人胃癌细胞系（MKN-45、BGC-823、MGC-803）购于中科院上海细胞库；RNA提取试剂盒（批号：AL258376）、反转录试剂盒（批号：AL61920A）与实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒（批 号：AL92668A）均购自TAKARA公司；Lipofectamine 3000转染试剂（批号：2048060）购自美国Invitrogen公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒（批号：20230813）、Annexin V-FITC/PI双染凋亡试剂盒（批号：20231105）及Western blotting相关试剂购自上海碧云天生物技术公司；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（批 号：GR567814- 1）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗体（批号：GR37682-5）、天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶9（Caspase-9）抗体（批号：GR67218-6）、β-肌动蛋白β-actin抗体（批号：GR1173521-12）均购自于美国Abcam公司；干扰序列由上海吉玛公司设计并合成，si-PCAT19-1序列为5'-UGUGUUAUUUAUUGCUAUGGU-3'，si-PCAT19-2序列为5'-AGAUUGUGAAUAAAU ACUGCU-3'，阴性对照si-NC序列为5'-UU CUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；PCR引物由上海华大基因公司合成，lncRNA PCAT19引物序列为上游引物5'-CAGAACAGGATGGCAGAG-3'、下游引物5'-GGACTACTTGGATGGCTAAT-3'，U6引物序列为：上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及转染

人胃癌细胞MGC-803、MKN-45、BGC-823与胃黏膜上皮细胞GES-1培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，当细胞融合约70%时胰酶消化，并用PBS清洗，室温200×g离心5  min后按照1 ∶ 4比例传代。按照Lipofectamine 3000说明书分别将阴性对照序列（si-NC）和干扰序列（si-PCAT19）转染到MGC-803细胞，使得干扰序列终浓度为100 nmol/L，转染24 h后收集细胞，用于后续实验。

1.3.2 RT-qPCR检测mRNA

采用TRIzol法检测mRNA[7]。反转录条件为：42 ℃ 15  min，85℃ 5 s，4℃5 min。严格按照试剂盒进行PCR荧光定量检测，反应条件为：95℃1  min，95℃ 10 s，55℃ 40 s，72℃ 1  min，施行40个循环；72℃ 5 min。内参为U6基因，相对表达量采用2-ΔΔCt公式进行计算。

1.3.3 CCK-8法测定细胞增殖

将转染si-NC和si-PCAT19的MGC-803细胞分别接种到96孔细胞培养板，待细胞贴壁后，分别在0、24、48、72 h加入10 μL的CCK-8试剂，继续孵育2 h后采用酶标仪检测各孔样品在450 nm处的吸光度（OD）值，随后绘制细胞增殖曲线。

1.3.4 流式细胞检测细胞凋亡

将转染si-NC和si-PCAT19的MGC-803细胞，用预冷PBS清洗后200×g离心5 min去上清。按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书，首先加入100 μL的结合缓冲液重悬细胞，随后加入Annexin-FITC 5 μL和PI 10 μL，轻摇混匀，避光孵育10 min，加入400 μL的结合缓冲液混匀后通过流式细胞仪进行检测。

1.3.5 Western blotting检测蛋白表达

用蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取30 μg总蛋白加入到含有5%浓缩胶和10%分离胶的SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。浓缩胶60 V电泳30 min，分离胶120  V电泳70  min，常规湿转法100 V转膜70 min，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入1 ∶ 1 500稀释的一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入1 ∶ 1 500稀释二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光显影。图像软件分析各蛋白条带的灰度值，并计算目的蛋白的相对表达水平。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计数资料采用χ²检验，计量资料符合正态分布，以表示，两组比较采用t检验，多组比较采用ANOVA检验，组间两两比较采用LSD法。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

研究共纳入36例患者，男性20例，女性16例，平均年龄（53.73±9.47）岁。RT-qPCR结果表明，与癌旁组织lncRNA PCAT19的表达量（5.545±2.484）相比，胃癌组织中lncRNA PCAT19的表达量（7.991±3.452）明显升高（P＜0.05）。具体见图1。

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  图1 lncRNA PCAT19在胃癌组织及对应癌旁组织中的表达（n=36）

  Figure 1.The expression of lncRNA PCAT19 in gastric cancer tissues and adjacent tissues (n=36)

  注：A. lncRNA PCAT19表达量；B. 胃癌组织病理图；与癌旁组织比较，aP＜0.001。

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2.2 lncRNA PCAT19表达与胃癌患者临床病理特征的关系

根据lncRNA PCAT19的表达水平，将患者分为低表达组和高表达组，分析结果显示，两组性别、年龄、病理分级、淋巴结转移及远距离转移方面差异均无统计学意义（P＞0.05），而lncRNA PCAT19低表达组中胃癌浸润程度T1-T2患者的占比高于高表达组（P＜0.05）。具体见表1。

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  表格1 lncRNA PCAT19表达与胃癌患者临床病理特征的关系

  Table 1.Correlation between lncRNA PCAT19 expression and clinicopathological characteristics in gastric cancer patients

  

2.3 lncRNA PCAT19在胃癌细胞中表达升高

RT-qPCR结果显示，与人胃黏膜上皮细胞GES-1中lncRNA PCAT19的相对表达量（1.000±0.649）相比，胃癌细胞MKN-45（1.522±0.172）、BGC-823（2.603±0.138）、MGC-803（4.007±0.235）中lncRNA PCAT19的表达量均明显升高，且4组细胞间lncRNA PCAT19的表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。随后选择lncRNA PCAT19表达量最高的MGC-803细胞进行后续实验。具体见图2。

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  图2 lncRNA PCAT19在胃癌细胞及GES-1细胞中的表达水平（n=9）

  Figure 2.The expression levels of lncRNA PCAT19 in gastric cancer cells and GES-1 cells (n=9)

  注：与GES-1比较，aP＜0.05。

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2.4 si-PCAT19对MGC-803细胞中lncRNA PCAT19的抑制作用

RT-qPCR结果显示，lncRNA PCAT19在各组细胞中的表达量分别为空白组（1.000±0.051）、si-NC组（0.990±0.042）、si-PCAT19-1组（0.651±0.060）、si-PCAT19-2组（0.462±0.043）、si-PCAT19-1+2组（0.596±0.037），5组间lncRNA PCAT19的表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。与si-NC组相比，si-PCAT19-1、si-PCAT19-2及si-PCAT19-1+2组中lncRNA PCAT19表量均明显降低（P＜0.05），而空白组和si-NC组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。随后选择抑制效果最明显的si-PCAT19-2进行后续实验。具体见图3。

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  图3 lncRNA PCAT19在不同组MGC-803细胞中的表达水平（n=9）

  Figure 3.The expression levels of lncRNA PCAT19 in different groups of MGC-803 cells（n=9）

  注：与si-N比较，aP＜0.05。

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2.5 下调lncRNA PCAT19抑制胃癌细胞MGC-803的增殖

CCK-8细胞增殖实验显示，3组细胞间的增殖差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白组及si-NC组比较，si-PCAT19-2组细胞在24 h、48 h及72 h的得增殖能力明显降低，而空白组和si-NC组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。具体见图4。

• 
  图4 CCK-8实验检测lncRNA PCAT19对MGC-803细胞增殖的影响（n=9）

  Figure 4.Effect of lncRNA PCAT19 on the proliferation of MGC-803 cells detected by CCK-8 assay (n=9)

  注：与si-PCAT19比较，aP＜0.05。

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2.6 下调lncRNA PCAT19促进胃癌细胞MGC-803的凋亡

流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，各组细胞的凋亡率分别为空白组（13.17±2.27）%、si-NC组（14.83±4.35）%、si-PCAT19-2组（27.40±5.05）%，3组间的细胞凋亡差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白组及si-NC组比较，si-PCAT19-2组细胞的凋亡能力明显升高（P＜0.05），而空白组和si-NC组之间无统计学差异（P＞0.05）。具体见图5。

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  图5 流式细胞术检测lncRNA PCAT19对MGC-803细胞凋亡的影响（n=9）

  Figure 5.Effect of lncRNA PCAT19 on the apoptosis of MGC-803 cells detected by flow cytometry (n=9)

  注：与si-PCAT19比较，aP＜0.05。

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2.7 下调lncRNA PCAT19对Cyclin D1、Caspase-9蛋白表达的影响

Western blotting结果显示，Cyclin D1蛋白在各组细胞中的表达量分别为空白组（1.000±0.083）、si-NC组（0.998±0.046）、si-PCAT19-2组（0.667±0.083），3组间的Cyclin D1蛋白表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白组及si-NC组比较，si-PCAT19-2组的Cyclin D1蛋白表达量明显降低（P＜0.05），而空白组和si-NC组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。Caspase-9蛋白在各组细胞中的表达量分别为空白组（0.611±0.052）、si-NC组（0.565±0.068）、si-PCAT19-2组（1.031±0.127），3组间的Caspase-9蛋白表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白组及si-NC组比较，si-PCAT19-2组的Caspase-9蛋白表达量明显升高（P ＜0.05），而空白组和si-NC组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。具体见图6。

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  图6 Western blot检测MGC-803细胞中Cyclin D1、Caspase-9蛋白表达（n=9）

  Figure 6.Expression of Cyclin D1 and Caspase-9 proteins in MGC-803 cells analyzed by Western blot assay (n=9)

  注：与si-NC比较，aP＜0.05。

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3 讨论

lncRNAs是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，其通过信号、诱饵、导向及脚手架等功能模式与蛋白质、DNA或RNA相互作用调控基因表达，从而参与基因转录、信号传导、表观遗传学修饰等多种生物学过程[8-9]。研究表明，多种lncRNAs在胃癌发生发展的过程中发挥重要作用，以类似原癌基因或抑癌基因的方式参与胃癌细胞的生物学行为，包括细胞增殖、分化、凋亡、转移、上皮间质转化及肿瘤血管生成等，如：lncRNA H19在胃癌患者中高表达，能够促进胃癌细胞增殖和转移[10-11]；lncRNA HOTAIR通过调控细胞间黏附分子-1、基质金属蛋白酶-1等肿瘤转移相关基因的表达，从而促进胃癌的迁移和侵袭[12]。此外，部分在胃癌组织或血液中表达的lncRNAs分子与胃癌的分期、预后等临床特征密切相关，可作为胃癌诊断和判断预后的重要辅助性标志物[13- 14]。因此，研究lncRNAs与胃癌的关系对提高胃癌的诊断、治疗和研究具有重要意义。

lncRNA PCAT19属于PCAT家族成员，在甲状腺癌、喉癌、胶质瘤、肺癌等多种肿瘤组织中高表达并发挥原癌基因的角色。研究表明，lncRNA PCAT19在甲状腺组织中高表达，并通过靶向miR-143-3p分子调控磷脂酰肌醇3-激酶 /蛋白激酶B信号通路，从而促进甲状腺细胞的增殖并抑制凋亡[15]。高表达的lncRNA PCAT19与喉癌患者预后呈负相关，其机制可能与调控miR-182/丙酮酸脱氢酶激酶4信号通路影响细胞代谢平衡，从而促进喉癌细胞的增殖有关[16]。抑制lncRNA PCAT19能够明显降低胶质瘤细胞增殖和侵袭的能力，并通过靶向miR-142-5p分子调控母系胚胎亮氨酸拉链激酶而增加细胞凋亡[17]。此外，lncRNA PCAT19也能通过靶向调控p53基因而促进肺癌细胞的增殖和侵袭[18-19]。然而，lncRNA PCAT19在鼻咽癌组织中低表达，且上调lncRNA PCAT19能够抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭能力[20]。以上研究表明，lncRNA PCAT19能够发挥原癌基因和抑癌基因的双重角色，其功能的发挥可能存在肿瘤组织特异性。

为了明确lncRNA PCAT19在胃癌中的表达情况，本研究检测了胃癌组织中lncRNA PCAT19的表达，从而证实了LncRNA PCAT19在胃癌组织中高表达，且其表达表达水平与胃癌的浸润程度成正相关。通过瞬时干扰实验发现，下调lncRNA PCAT19表达能够抑制MGC-803细胞的增殖并促进细胞的凋亡，说明PCAT19在胃癌细胞中发挥癌基因的作用，但其机制尚不明确。研究表明，Wnt信号通路在胃癌中过度激活，其下游靶基因的异常表达，是肿瘤细胞过度增殖和凋亡减少的重要原因[21-22]。作为Wnt信号通路的关键性分子，Cyclin D1主要推动细胞从G1期进入到S其期，过度表达导致细胞恶性增殖[23]；而Caspase- 9主要参与线粒体凋亡途径，在胃癌组织中表达降低[24]。本课题组发现，下调lncRNA PCAT19的表达将导致MGC-803细胞中Cyclin D1表达降低和Caspase-9表达升高，这说明lncRNA PCAT19促进胃癌细胞增殖和抑制凋亡的作用可能是通过调控Cyclin D1、Caspase-9蛋白来实现的。

综上所述，lncRNA PCAT19在胃癌组织中高表达，且与胃癌细胞浸润程度呈正相关，其发挥促进增殖和抑制凋亡的作用机制可能和调控Cyclin D1、Caspase-9蛋白有关。

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