目的  建立桂附地黄丸（浓缩丸）的HPLC指纹图谱及多指标成分含量测定方法，为该制剂的质量评价与标准研究提供参考依据。

方法  色谱柱为Welch Ultimate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱；流速为1.0  mL/ min；柱温为30 ℃；检测波长0~45 min为240 nm，45~85 min为205 nm。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）对17批样品的HPLC指纹图谱进行相似度评价，同时对方中莫诺苷、马钱苷、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、乙酰泽泻醇B 6种成分进行含量测定。

结 果  建立17批桂附地黄丸（浓缩丸）的指纹图谱相似度均大于0.95，确认了15个共有峰，并指认出6个主要特征峰，分别为莫诺苷、马钱苷、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚和乙酰泽泻醇B，以上6种成分分别在一定浓度范围内线性关系良好（r≥0.999 4），平均回收率分别为97.7%（RSD=1.9%）、96.5%（RSD=2.7%）、97.6%（RSD=1.3%）、98.4%（RSD=2.6%）、97.2%（RSD=2.0%）和96.2%（RSD=2.4%）（n=6）。17批样品中6种成分的含量分别为0.559~1.349、1.042~1.693、0.836~1.424、0.110~0.455、1.608~2.639、0.202~0.309 mg/g。

结 论  本方法所提供的HPLC指纹图谱和含量测定操作简便，且具有较好的灵敏度和重复性，对桂附地黄丸（浓缩丸）质量标准的修订有参考意义。

桂附地黄丸来源于《金匮要略》，其功效主要是温补肾阳[1]。桂附地黄丸（浓缩丸）与前者处方完全相同，肉桂、附子为君药，熟地、山茱萸、山药为臣药，茯苓、泽泻、牡丹皮为佐药，具温补肾阳的功效，用于肾阳不足等证。桂附地黄丸中8味药，粉碎成细粉，过筛，混匀后制成水蜜丸或蜜丸；而浓缩丸制法繁琐，8味药中，泽泻、茯苓粉碎成粗粉，加水煎煮后取滤液浓缩成清膏；熟地黄切片，加水煎煮取滤液浓缩成清膏；山茱萸及部分牡丹皮照渗漉法用70%乙醇为溶剂进行渗漉，收集漉液回收乙醇，浓缩成清膏，剩余的牡丹皮及肉桂、附子（制）和山药粉碎成细粉，与上述各清膏混匀，制成浓缩丸。由于制法复杂，投料饮片中的指 标成分损失大小不一，因此桂附地黄丸（浓缩丸）的质量控制难度远大于桂附地黄丸，现行版标准仍收载于卫生部颁药品标准（中药成方制剂第08册）（WS3-B-1600-93），鉴别部分仅有对以粉入药的4种饮片进行显微鉴别，含量测定用的是UV法，仅对牡丹皮中的丹皮酚进行定量。鉴于当前标准的质量控制方法较为简单落后，而复方制剂各药材指标成分较多，检测其中任何一种化学成分均未能准确反映其整体质量，中药指纹图谱具有整体性和模糊性 [2- 3]，因此本研究首先对桂附地黄丸（浓缩丸）进行HPLC指纹图谱研究，并对其中主要有效成分莫诺苷、马钱苷、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、乙酰泽泻醇B进行含量测定，采用多指标从多维度进行质量控制，以此完善桂附地黄丸（浓缩丸）的质量标准。

1 材料

1.1 主要仪器

1200高效液相色谱仪（包括G1316A柱温箱和G1314B VWD检测器）和1260高效液相色谱仪（包括G1316A-TCC柱温箱和G4212B-DAD检测器）均购自美国安捷伦科技有限公司；BP211D电子天平（德国赛多利斯公司）；SK5200G超声仪（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

莫诺苷（批号：110708-201908，纯度96.8%）、马钱苷（批号：111640-201808，纯 度 99.0%）、芍药苷（批号：110736-202145，纯 度94.6%）、桂皮醛（批号：110710-202022，纯度99.5%）、丹皮酚（批号：111998-202104，纯度99.8%）和23-乙酰泽泻醇B（批号：111846-202006，纯度98.3%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水；17批桂附地黄丸（浓缩丸）样品规格均为每8丸相当于原生药3 g，来源及批号信息见表1。

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  表格1 样品信息

  Table 1.Information of samples

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2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用HPLC法，色谱柱：Welch Ultimate AQ-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（梯度洗脱程序见表2）；检测波长：0~45 min为240 nm，45~85 min为205 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

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  表格2 梯度洗脱条件

  Table 2.Conditions of gradient elution

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2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液

精密称取对照品莫诺苷11.77 mg、马钱苷11.78 mg、芍药苷13.89 mg、丹皮酚18.26 mg分别置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度；再精密称取对照品桂皮醛21.65 mg、23-乙酰泽泻醇B 11.64 mg分别置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度；得到6种成分的单个对照品溶液；分别精密量取莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚对照品溶液2 mL，桂皮醛、23-乙酰泽泻醇B对照品溶液1 mL混合均匀，即得混合对照品溶液，其中莫诺苷、马钱苷、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B的浓度分别为113.93、116.62、131.40、43.08、182.03、22.88 μg/mL。

2.2.2 供试品溶液

精密称取本品粉末2 g，置于具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声（功率：500 W，频率：35 kHz）处理30 min，冷却后用甲醇补足重量，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液

根据桂附地黄丸（浓缩丸）制备工艺，分别制备不含山茱萸、牡丹皮、肉桂和泽泻的阴性样品，按供“2.2.2”项下方法制得阴性样品溶液。

2.3 指纹图谱研究

2.3.1 精密度试验

取同一供试品溶液（编号：S1），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以12号峰丹皮酚为参照峰[4]，计算得共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于1.5%（n=6），结果表明该仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取同一样品（编号：S1），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，以12号峰丹皮酚为参照峰，计算得共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.1%（n=6），结果表明该法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一供试品溶液（编号：S1），分别在室温放置0、2、4、8、12、18、24 h后按“2.1”项下色谱条件进样测定，以12号峰丹皮酚为参照峰，计算得共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%（n=7），结果表明供试品溶液在24  h内稳定性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立及共有峰指认

取17批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图；并将17批样品HPLC色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）进行分析[5-9]，得到样品指纹图谱叠加图，结果见图1。以S1为参照图谱，时间宽度为0.1，对色谱图进行多点校正，自动匹配，选择吸收信号较强、峰形明显、稳定性好的共有峰进行标定，定位了15个共有峰[3]，具体见图2。其中4号峰（莫诺苷）和5号峰（马钱苷）来自山茱萸，6号峰（芍药苷）和12号峰（丹皮酚）来自牡丹皮，10号峰（桂皮醛）来自肉桂，13号峰（23-乙酰泽泻醇B）来自泽泻。

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  图1 17批样品的HPLC指纹图谱

  Figure 1.HPLC fingerprint of 17 batches of samples

  

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  图2 17批桂附地黄丸（浓缩丸）HPLC对照特征图谱

  Figure 2.HPLC control characteristic chromatogram of 17 batches of Guifu Dihuang pills (concentrated pill)

  注：4. 莫诺苷；5. 马钱苷；6. 芍药苷；10. 桂皮醛；12. 丹皮酚；13. 23-乙酰泽泻醇B。

  

2.3.5 指纹图谱相似度评价

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），以17批桂附地黄丸（浓缩丸）的HPLC指纹图谱生成的对照指纹图谱为参照，进行整体相似度评价，结果见表3，各批次样品的相似度均在0.976~0.998之间，表明不同厂家不同批次的桂附地黄丸（浓缩丸）差异较小，具有较好的质量一致性[3]。

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  表格3 桂附地黄丸（浓缩丸）相似度

  Table 3.Similarity of Guifu Dihuang pills (concentrated pill)

  

2.4 桂附地黄丸（浓缩丸）样品中6种指标成分的含量测定

2.4.1 专属性及系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图3）。结果表明，在相同的保留时间，供试品色谱图与对照品色谱图有相同的色谱峰，且阴性样品无相同保留时间色谱峰干扰。6种成分与其他峰分离较好，分离度均大于1.5，理论塔板数均不低于8 000。

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  图3 HPLC色谱图

  Figure 3.HPLC chromatograms

  注：A.混合对照品溶液；B. 供试品溶液；C. 缺山茱萸的阴性样品溶液；D. 缺牡丹皮的阴性样品溶液；E. 缺肉桂的阴性样品溶液；F. 缺泽泻的阴性样品溶液；1. 莫诺苷；2. 马钱苷；3. 芍药苷；4. 桂皮醛；5. 丹皮酚；6. 23-乙酰泽泻醇B。

  

2.4.2 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液1、4、8、10、12、15 μL，按色谱条件进样测定，记录峰面积。分别以进样量为横坐标（X， μg）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得到6种成分的线性回归方程，结果见表4。结果表明，6种成分在各自的检测质量范围内线性关系良好。

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  表格4 回归方程与线性范围

  Table 4.Regression equations and linear ranges

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2.4.3 精密度试验

取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续测定6次，计算得莫诺苷、马钱苷、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚和23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD分别为0.4%、1.5%、1.1%、0.2%、0.3%、0.5%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验

取同一样品（编号：S1），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得莫诺苷、马钱苷、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚和23-乙酰泽泻醇B的平均含量为1.349、1.693、1.201、0.455、1.995、0.232  mg/ g，RSD分别为2.0%、1.4%、2.1%、0.9%、0.9%、1.4%（n=6），结果表明该法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验

取同一供试品溶液（编号：S1），分别在室温放置0、2、4、8、12、18、24 h后按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得莫诺苷、马钱苷、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚和23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD分别为2.9%、0.7%、2.7%、1.6%、1.4%、2.2%（n=7），结果表明供试品溶液在24  h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验

分别精密量取莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚单个对照品溶液2 mL，桂皮醛、23-乙酰泽泻醇B单个对照品溶液1 mL，置于同一50  mL量瓶中，加甲醇定容至刻度得混合对照品溶液，摇匀；称取批桂附地黄丸（浓缩丸）（编号：S1）6份，每份约0.5 g，分别精密加入上述混合对照溶液（含莫诺苷、马钱苷、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B分别为22.79、23.32、26.28、8.62、36.45、4.58  μg/ mL）25 mL，按“2.2.2”项下方法制备加样回收率试验的供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得莫诺苷、马钱苷、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚和23-乙酰泽泻醇B的平均回收率分别为97.7%（RSD=1.9%）、96.5%（RSD=2.7%）、97.6%（RSD=1.3%）、98.4%（RSD=2.6%）、97.2%（RSD=2.0%）和96.2%（RSD=2.4%）（n=6），结果表明该法准确度良好。

2.4.7 样品的含量测定

取17批桂附地黄丸（浓缩丸）样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，数据代入线性方程计算各成分的含量，结果见表5。莫诺苷、马钱苷、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚和23-乙酰泽泻醇B的含量范围分别为0.559~1.349、1.042~1.693、0.836~1.424、0.110~0.455、1.608~2.639、0.202~0.309 mg/g，表明该方法适用于上述6种成分的含量定量。

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  表格5 样品测定结果（mg/g，n=3）

  Table 5.Results of content determination (mg/g, n=3)

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3 讨论

3.1 检测成分的选择

试验初期设计，由于在桂附地黄丸（浓缩丸）处方中熟地黄投料量较大，因此参照《中国药典》熟地黄的含量测定方法将地黄苷D作为熟地黄的指标成分来进行质量控制，地黄苷D对照品溶液在205 nm波长（《中国药典》规定为203 nm）处有较强吸收，峰形尚可，但17批次样品中地黄苷D色谱峰均较小，且与附近其他未知色谱峰之间无法完全分离，故难以定量，对该成分只能今后再探索更适合的方法进行研究。参照《中国药典》泽泻的含量测定方法同时将23-乙酰泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇C作为指标成分来进行质量控制，23-乙酰泽泻醇C对照品溶液在240 nm波长条件下有强吸收，峰形佳，分离度高，但由于23-乙酰泽泻醇C在泽泻饮片中含量低，且热稳定性差[10]，在桂附地黄丸（浓缩丸）制法中，泽泻需粉碎成粗粉后煎煮两次，23-乙酰泽泻醇C可能已被破坏，结果在17批次样品中均未检测到，无法定性定量，故选择23-乙酰泽泻醇B为指标成分。本文未采用化学模式识别分析，本研究尚存在一定的局限性，后续会逐步提高。

3.2 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器（G4212B-DAD检测器）在190~400 m波长范围内对莫诺苷、马钱苷、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B对照品溶液进行扫描，UV吸收光谱图显示莫诺苷、马钱苷、芍药苷对照品溶液在240 nm附近有加强吸收；而桂皮醛、丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B对照品溶液在240 nm附近吸收较弱，但在UV末端具有较强吸收，因此综合考虑确定洗脱时间在0~45  min选择240 nm波长检测莫诺苷、马钱苷、芍药苷，而洗脱时间在45~85 min选择205 nm波长检测桂皮醛、丹皮酚和23-乙酰泽泻醇B。

3.3 HPLC指纹图谱

按照中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算17批桂附地黄丸基准样品指纹图谱相似度均大于0.95，表明该桂附地黄丸（浓缩丸）具有较好的质量一致性。药材质量的优劣直接影响到患者治病用药的疗效，因此质量控制起着至关重要的作用，而中药成分复杂，现行标准中仅针对单一成分进行含量测定，复方制剂的内在质量无法充分反映，而中药生物指纹图谱对中药品种的鉴别意义较大，具有大规模、高通量的优点，指纹图谱能全面、定量地反映中药所包含的化学信息，是中药治疗控制的有效手段，可将生物指纹图谱技术与药效成分的测定一并用于中药质量控制[11-15]，故本研究通过建立该制剂的指纹图谱并同时测定多成分的含量，结果可靠，稳定性好，能够多靶点全面控制各药材质量，该方法可作为桂附地黄丸（浓缩丸）未来质量控制研究的参考标准之一。综上所述，本方法所提供的桂附地黄丸（浓缩丸）HPLC指纹图谱和含量测定操作简便，且具有较好灵敏度和重复性，在桂附地黄丸（浓缩丸）质量标准修订上有较好的参考意义。

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