目的  研究长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5（LncRNA GAS5）通过抑制Wnt/β连环蛋白（β-catenin）信号通路的异常激活保护冠状动脉性心脏病（CHD）大鼠心肌组织机制。

方法  根据不同模型，将60只清洁级健康SD大鼠分为对照组、CHD组及GAS5过表达组，每组各20只。对照组大鼠转染空载体质粒，CHD组和GAS5过表达组构建CHD模型，在此基础上，GAS5过表达组静脉注射pcDNA3.1-GAS5，每天1次，连续5 d。应用RT-qPCR检测3组大鼠心肌组织中生长停滞特异性转录本5（GAS5）、Wnt- 1、β-catenin和c-Myc的mRNA表达水平；模块化DPP自动生化分析仪测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）的表达水平；采用邻苯三酚自氧化法检测心肌组织氧化应激指数和超氧化物歧化酶（SOD）水平；ELISA检测大鼠血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白I（cTnI）、丙二醛（MDA）、GAS5的表达水平；Western bloting法检测大鼠心肌组织中Wnt-1、β-catenin和c-Myc的蛋白表达水平。

结果  与对照组大鼠相比，CHD组TC、TG、HDL-C、MDA、CK-MB和cTnI水平均明显升高（P＜0.05），而GAS5 mRNA、SOD和LDL-C水平明显降低（P＜0.05）。与CHD组大鼠相比GAS5过表达组血清TC、TG、HDL-C、MDA、CK-MB和cTnI水平均明显降低（P＜0.05），而SOD和LDL-C水平明显升高（P＜0.05）。与对照组大鼠相比，CHD组Bax蛋白以及Wnt-1、β-catenin、c-Myc的蛋白和mRNA表达均显著增加（P＜0.05）；而Bcl-2蛋白显著减少（P＜0.05）。与CHD组大鼠相比，GAS5过表达组心肌组织Bax蛋白表达以及Wnt-1、β-catenin、c-Myc的蛋白和mRNA表达均（P＜0.05）显著减少，而Bcl-2蛋白显著增加（P＜0.05）。

结论  过表达GAS5可减轻CHD大鼠心肌氧化应激损伤，抑制心肌细胞凋亡，其机制可能是通过抑制心肌组织中Wnt/β-catenin信号通路异常激活实现对心肌的保护作用。

冠状动脉性心脏病（coronary artery heart disease，CHD）是心血管系统常见的疾病，又称冠心病或缺血性心脏病，作为心血管病第二大死因，2020年中国农村居民CHD死亡率为135.88  /10万人，自2012年以来CHD死亡率呈持续上升状态 [1]。CHD发病诱因众多，包括糖尿病、高血压病、肥胖、吸烟、遗传及精神压力等，虽目前药物、经皮冠状动脉介入等治疗技术日益改进，但CHD高致死率仍是临床面临的重大挑战 [2]。因此，CHD早期诊断及治疗尤为重要。在左心室功能不全前得到诊治的CHD患者预后明显较好。伴随对CHD病理机制研究的深入，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）与CHD的关系受到高度关注。lncRNA不但在多种细胞发育过程中起到关键作用，同时还参与调控巨噬细胞、减轻血管炎症及调节代谢等[3-5]。研究显示，lncRNA可能与CHD的发病有关[6]。Li等[7]研究发现，CHD大鼠存在血清LncRNA生长阻滞特异性转录本5（lncRNA growth arrest-specific transcripts 5，LncRNA GAS5）下调，而GAS5的过表达可抑制CHD大鼠心肌组织中Wnt/β连环蛋白（β-catenin）信号通路的异常激活。LncRNA GAS5与乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤密切相关[8-10]。龙曼云等 [11]研究发现，lncRNA在CHD患者中表达明显下调，有望作为CHD敏感的生物标志物。目前，Wnt/ β-catenin信号通路被证实与CHD发生、心肌梗死心肌愈合等均有着重要影响，但GAS5是否通过Wnt/β-catenin信号通路发挥心肌保护作用尚不清楚[12]。本研究通过构建大鼠CHD模型，探讨lncRNA GAS5在CHD发病过程中可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

DPP自动生化分析仪（Roche Diagnostics瑞士）；QuantStudio 6 Flex System实时荧光定量PCR仪（Life Tecnology）。

1.2 主要药品与试剂

腹腔注射垂体液（安徽宏业药业有限公司，批号：H34022977）；pcDNA3.1-GAS5质粒（温州科淼生物科技有限公司，批号：KM1036772）；1%戊巴比妥钠（批号：P3761）、血清肌酸激酶同工酶（creatine kinase-myocardial band，CK-MB）和肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）检测试剂盒（批号：MAK116）均购自Sigma-Aldrich；Trizol试剂盒（Thermo Fisher Scientific，批号：15596026CN）；邻苯三酚自氧化法检测试剂盒（上海瓦兰生物科技有限公司，批号：WS8410F）；丙二醛（malondialdehyde，MDA，批号：MAK568）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，批 号：CEA597Ge）检测试剂盒购自南京赛泓瑞生物科技有限公司；B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl- 2，批号：ab32124）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax，批号：ab32503）、Wnt-1（批号：ab15251）、β-catenin（批号：ab16051）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批 号：ab8226）和相应二抗（批号：ab6721）均购自Abcam；c-Myc（Cell Signaling Technology，批 号：9402S）；BCA蛋白检测试剂盒[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号：23225]；牛蓝白蛋白（Sigma-Aldrich，批号：A7906）。

1.3 动物

清洁级健康SD大鼠60只，体重（230±20）g，购自重庆恩斯维尔生物科技有限公司，许可证号：SYXK（渝）2022-0074，严格饲养于齐齐哈尔医学院第一附属医院实验中心SPF级动物房。采用标注啮齿动物饲料和灭菌二级超纯水饲养，饲养环境为明暗12 h循环，温度22~25℃，相对湿度50%~70%。本实验经齐齐哈尔医学院第一附属医院动物伦理委员会批准[伦理审批号：2023伦理研第（38）号]。

1.4 方法

1.4.1 动物分组与造模

将大鼠随机分为对照组（n=20）和CHD组（n=40）。CHD大鼠模型采用高脂饮食和腹腔注射垂体液相结合方法建立。具体方法：CHD模型大鼠给予高脂饮食（2%胆固醇、10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠和87.3%基础饲料），并自由饮水8周。最后3 d，大鼠腹腔注射垂体液30 U/kg，每日1次。对照组大鼠饲喂普通基础饲料，自由饮水8周。将40只模型大鼠按体重立即编号后随机分为CHD组和GAS5过表达组  （静脉注射pcDNA3.1-GAS5 50 mg/kg，每日1次，连续5 d），每组20只。

各组大鼠采用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。提取大鼠股动脉血液用于生化指标检测。抽取颈静脉血5 mL，静置30 min后，2 000 ×g离心10  min，上清置于-70℃冰箱中，检测血清指标。取仰卧位固定后，暴露大鼠心脏，从主动脉根部切断。取适量心尖部心肌组织置于预先标记的冷冻管中，快速放入液氮中。最后转移至-80℃冰箱备用。

1.4.2 血清生化指标检测

使用模块化DPP自动生化分析仪测定总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL-C）和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL-C）的水平。采用邻苯三酚自氧化法检测心肌组织氧化应激指数MDA和SOD水平；采用试剂盒检测CK-MB和cTnI水平。

1.4.3 RT-PCR检测

采用Trizol一步法提取心肌组织的总RNA，通过紫外分析和甲醛变性电泳检测得到高质量的RNA。经禽成髓细胞病病毒逆转录酶分析，获得了1 μg RNA和互补DNA （cDNA）。PCR采用SYBR Green法。PCR引物由Invitrogen公司设计合成，引物序列见表1。PCR反应体系为cDNA 1.0  μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，正向引物（10  μmol/L） 0.5 μL，反向引物（10 μmol/L）0.5  μL，RNase游离水8 μL，以β-actin作为内参。PCR扩增条件：94℃变性40 s，60℃退火1 min，72℃扩展1 min，共40个循环，最后72℃扩展10  min。手动获得每个反应管的阈值循环（Ct）值，采用2^-△△Ct方法分析各组靶基因表达的比例关系。

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  表格1 各基因PCR引物序列

  Table 1.PCR primer sequences for each gene

  注：F代表正向；R代表反向。

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1.4.4 Western blotting检测

组织标本剪碎后加入RIPA裂解缓冲液，放置于冰溶解30 min，超声波碎片后经12 000 ×g离心15 min，提取上清液同时加入缓冲十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）样品在95℃金属浴10 min。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，蛋白样品通过SDS-PAGE分离，随后转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，放置在5%牛蓝白蛋白1 h。一抗（稀释比例1 ∶ 100）滴至PVDF膜上孵育过夜，抗体包括Bax、Bcl- 2、Wnt- 1、β-catenin及c-Myc。然后，用HRP偶联的二抗（稀释比例1 ∶ 1 000）在37℃下包膜2 h。使用电生化学发光溶液进行显影，β-actin作为内参，使用Image J软件分析目标条带的灰度值。

1.5 统计学分析

所有数据采用SPSS 21.0软件进行分析。计量资料符合正态分布，采用表示，两组间比较采用t检验，多组间比较经方差分析后，采用LSD-t进行两两比较。所有检验均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GAS5在不同组大鼠中的表达水平

RT-qPCR检测3组不同大鼠中GAS5 mRNA表达水平，结果显示，CHD组大鼠GAS5的表达明显低于对照组（P＜0.05），尾静脉注射pcDNA3.1-GAS5的CHD大鼠其GAS5的表达结果明显升高（P＜0.05），提示过表达GAS5成功。具体见图1A。

使用模块化DPP自动生化分析仪测定TC、TG、HDL-C和LDL-C的水平。结果显示，与对照组大鼠相比，CHD组大鼠血清中TC、TG和HDL-C水平均明显升高（P＜0.05），而LDL-C水平明显降低（P＜0.05）；与CHD组大鼠相比，GAS5过表达组TC、TG和HDL-C水平均明显降低（P ＜0.05），而LDL-C水平明显升高（P＜0.05）。具体见图1B。  

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  图1 GAS5过表达对CHD大鼠GAS5 mRNA及血脂水平的影响（n=20）

  Figure 1.Effect of GAS5 overexpression on GAS5 mRNA and serum lipid levels in CHD rats (n=20)

  注：A. GAS5 mRNA表达水平；B. 血脂水平；aP<0.05。

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2.2 GAS5对CHD大鼠心肌CK-MB、cTnI、MDA的影响

ELISA结果显示，与对照组大鼠相比，CHD组大鼠CK-MB和cTnI水平均明显升高（P＜0.05）；与CHD组大鼠相比，CHD过表达组大鼠CK-MB和cTnI水平均明显降低（P＜0.05）。与对照组大鼠相比，CHD组大鼠血清中MDA水平均明显升高（P＜0.05），SOD水平明显降低（P＜0.05）；与CHD组大鼠相比，GAS5过表达组大鼠血清中MDA水平均明显降低（P＜0.05），SOD水平明显升高（P ＜0.05）。具体见图2。

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  图2 过表达GAS5抑制CHD大鼠心肌氧化应激反应损伤（n=20）

  Figure 2.Overexpression of GAS5 inhibits myocardial oxidative stress injury in CHD rats (n=20)

  注：A. CK-MB和cTnI表达水平；B. MDA和SOD表达水平；aP<0.05。

  

2.3 GAS5对冠心病大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的影响

Western blotting检测结果显示，与对照组大鼠相比，CHD组大鼠心肌组织中Bax蛋白表达明显升高（P＜0.05），而Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与CHD组大鼠相比，GAS5过表达组大鼠心肌组织中Bax蛋白表达明显降低（P ＜0.05），而Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P ＜0.05）。具体见图3。

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  图3 过表达GAS5抑制冠心病大鼠心肌细胞凋亡（n=20）

  Figure 3.Overexpression of GAS5 inhibits cardiomyocyte apoptosis in rats with coronary heart disease (n=20)

  注：aP<0.05。

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2.4 GAS5过表达抑制CHD大鼠心肌组织Wnt/β-catenin信号通路异常激活

应用RT-qPCR检测3组大鼠心肌组织中Wnt-1、β-catenin和c-Myc的mRNA表达水平，结果显示，与对照组大鼠相比，CHD组大鼠心肌组织中Wnt-1、β-catenin和c-Myc的mRNA表达水平均显著增加（P＜0.05）；与CHD组大鼠相比，GAS5过表达组大鼠心肌组织中Wnt-1、β-catenin和c-Myc的mRNA表达水平均显著减少（P＜0.05），具体见图4A。Western blotting检测结果显示，与对照组大鼠相比，CHD组大鼠心肌组织中Wnt-1、β-catenin和c-Myc的蛋白水平均显著增加（P＜0.05）；与CHD组大鼠相比，GAS5过表达组大鼠心肌组织中Wnt-1、β-catenin和c-Myc的蛋白表达水平均显著减少（P＜0.05）。具体见图4B。

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  图4 GAS5过表达抑制CHD大鼠心肌组织Wnt/β-catenin信号通路异常激活（n=20）

  Figure 4.GAS5 overexpression inhibits aberrant activation of Wnt/β-catenin signaling pathway in myocardial tissues of CHD rats (n=20)

  注：A. Wnt/β-catenin信号通路mRNA表达水平；B. Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达水平；aP<0.05。

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3 讨论

现阶段，CHD发病具体分子机制已成为研究热点，其中LncRNA被证实与心血管疾病发病密切相关，LncRNA通过表观遗传调控（如染色质重塑、miRNA海绵作用）参与动脉粥样硬化、心肌纤维化等病理进程[6-8]，相关研究表明，多种LncRNA在诸如心肌肥厚、心肌梗死及心肌炎等心血管疾病中异常表达[9]，其中LncRNAGAS5涉及乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤的发生与发展[10]。Yu等[13]研究发现，GAS5能够通过靶向YBX1调控p21的表达，从而增强G1期肿瘤细胞的阻滞，抑制胃癌的发生发展。既往研究发现，LncRNAGAS5在CHD患者中表达明显下调，有望作为CHD敏感生物标志物[11-12]。最近，Wang等[14]研究提出，GAS5可以通过调节miR-21和磷酸酶和紧张素同源物（phosphatase and tensin homologue，PTEN）表达来抑制心肌纤维化，提示GAS5可能在心脏病中发挥保护作用。本研究结果显示，CHD大鼠心肌组织中GAS5表达明显下调；此外通过过表达GAS5结果发现，过表达GAS5大鼠的高脂血症得到明显改善，心肌损伤标志物表达明显减少，此外PCR和Western blotting结果均证实，过表达GAS5大鼠的心肌细胞凋亡标志物明显降低，同时MDA和SOD等氧化应激指标明显改善，提示过表达GAS5可减轻CHD大鼠心肌组织氧化应激损伤，同时减少心肌细胞凋亡。这一发现与Wang等[14]的研究形成互补，其报道GAS5通过miR-21/PTEN轴抑制心肌纤维化，而本研究表明GAS5可能通过抑制Wnt/β-catenin通路作用实现心肌保护。

Wnt/β-catenin信号通路在正常发育、基因表达、细胞增殖分化等生命过程中扮演重要角色，其异常激活与肿瘤、骨骼疾病等发病密切相关 [15]。Wnt/β-catenin通路的过度激活可促进心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，加速胶原沉积及心室重构[16]。本文结果还显示，CHD大鼠心肌组织中Wnt/β-catenin信号通路存在异常激活，Wnt/β-catenin信号通路在正常发育、基因表达、细胞增殖分化等生命过程中扮演重要角色，其异常激活与肿瘤、骨骼疾病等发病密切相关[15]。前期研究发现，GAS5能够与mTOR信号通路相互作用从而发挥其正常生物学功能，此外，GAS5还能参与miR-21介导的PTEN/基质金属蛋白酶-2信号通路，参与其抑制心脏组织中成纤维细胞异常活化，以及心脏纤维化等病理过程，最终调节高血压所致的心室重构[17]。既往研究表明，经典的Wnt/β-catenin信号通路可增强单核-内皮细胞黏附能力，导致周围细胞向脂肪系分化，可能与动脉粥样硬化及血管钙化等CHD病理改变密切相关[18]。本研究结果显示，过表达GAS5后大鼠心肌组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达明显下调，同时心肌细胞凋亡和损伤明显减轻，提示GAS5可能是通过抑制CHD大鼠心肌组织中Wnt/β-catenin信号通路异常激活发挥心肌保护作用。

先前研究已证实，GAS5能够抑制Wnt/β-catenin信号通路，增强乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性[19]。此外，GAS5还被发现能够抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而有效抑制结直肠癌的血管生成、侵袭和转移[20]。然而，在心肌纤维化领域中，GAS5对Wnt/β-catenin通路及心肌保护作用尚不明确。本研究验证了GAS5对Wnt/β-catenin通路的抑制作用，同时在动物实验中验证了GAS5对CHD大鼠心肌的保护作用，弥补了这部分研究的空白。然而，本研究存在一定局限性。本研究的实验层面仅停留在动物实验，缺乏临床标本验证和体外细胞实验验证。在后续研究中，本团队将继续深入挖掘GAS5对Wnt/β-catenin通路影响的深入分子机制。基于本研究的发现，未来可开展以下工作：一是开发GAS5检测试剂盒用于CHD早期筛查；二是构建心肌特异性GAS5过表达动物模型和细胞模型验证其长期疗效；三是探索GAS5与现有抗Wnt药物（如ICG-001）的联合治疗方案。

综上所述，过表达GAS5可减轻CHD大鼠心肌氧化应激损伤，抑制心肌细胞凋亡，可能是通过抑制心肌组织中Wnt/β-catenin信号通路异常激活实现心肌保护作用，提示GAS5有望作为CHD新的生物标志物和治疗靶点。

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