目的  建立乌药汤冻干粉超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱，表征其共有峰的化学成分，采用生信分析技术探讨乌药汤冻干粉治疗原发性痛经的物质基础和潜在作用机制。

方法  建立乌药汤冻干粉的UPLC指纹图谱，采用液质联用技术对共有峰进行结构表征。应用网络药理学构建“化学成分-靶点-通路”关系网络，参考文献资料对其治疗原发性痛经的潜在活性成分及作用机制进行预测，最后采用Autodock Vina分子对接验证。

结果  建立了10批乌药汤冻干粉基准样品UPLC指纹图谱，对17个共有峰进行了结构指认；从上述成分中筛选得到乌药汤治疗原发性痛经的6个关键成分、12个核心靶点和10条信号通路，KEGG通路分析显示肿瘤坏死因子（TNF）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路参与度高；分子对接结果显示香叶木素等化学成分能与磷酸肌醇-3-激酶催化亚基α肽（PIK3CA）等蛋白稳定结合。

结论  香叶木素、羟基蓍含蓍素、阿魏酸、波尔定碱、槐黄醇和臭灵丹酸可能是乌药汤缓解原发性痛经的潜在活性成分，并作用于PIK3CA、雌激素受体1（ESR1）等核心靶点蛋白，通过调控TNF、PI3K/Akt、MAPK等信号通路，共同发挥治疗原发性痛经的作用，初步探讨了乌药汤在治疗原发性痛经中的潜在机制，为缓解原发性痛经提供多成分、多靶点、多通路的干预策略。建立的UPLC指纹图谱及其化学成分分析为后续药效学的深入研究奠定了基础。

原发性痛经是指伴随月经发生的周期性下腹疼痛而无生殖器官器质性病变的疾病。通常在月经开始前不久或开始时发生小腹痉挛性疼痛，并伴有头痛、嗜睡、乏力、乳房胀痛、小腹下坠、腰酸背痛等症状，个别患者还会出现食欲不振、恶心、呕吐和腹胀、腹泻等胃肠道症状，是最常见的妇科疼痛性疾病之一[1-2]。在中医临床上，以血瘀、湿滞、寒凝症状常见，辨证以气滞血瘀证、寒凝血滞证、湿热瘀结证等多见。从西医角度看，该病的发病诱因及产生机制较复杂，如患者子宫形态的改变、内分泌激素水平的高低、精神心理和社会因素等都可能是其影响因素[3]。目前该病的治疗现状，西医多对症治疗，采用具有抗炎作用的非甾体抗炎药；用于调节内分泌、缓解子宫平滑肌异常收缩等作用的口服避孕药、钙通道阻滞剂、维生素。但以上药物长期使用会对人体肾、肝等器官产生药物不良反应。而中医药治疗原发性痛经方法较多，尤其是一些经典名方或临床经验方，疗效确切且不良反应少，越来越受到广大患者的青睐。

2018年国家公布的《古代经典名方目录（第一批）》中，乌药汤位列其中。该方出自金·李东垣《兰室秘藏》：“当归、甘草、木香各五钱，乌药一两，香附子二两，治妇人血海疼痛。”乌药汤的现代临床应用广泛，现代研究表明，该方可用于治疗月经不调、痛经、乳房胀痛、乳腺增生等疾病，临床效果显著[4]，前期虽有文献[5]对乌药汤治疗原发性痛经的网络药理学进行了初步预测研究，发现其作用机制是由多成分、多靶点、多通路发挥药效，但并未对乌药汤的基准样品进行分析，所得的活性成分在汤剂中含量较少，进入人体血液的可能性较小，有可能并非其发挥药理作用的物质基础，其具体的潜在活性成分及机制尚待进一步深入研究。

网络药理学是利用生物分子网络分析方法，系统性探究中药与疾病之间的相关作用机制的一种较为成熟的方法。现已广泛应用于有效成分发现、作用机制研究和临床前研究等领域[6-7]。本研究在前期工艺筛选的基础上[8]，采用随机组合的方法制备了10批乌药汤物质基准样品冻干粉，建立UPLC指纹图谱，并进行相似度评价，得到共有峰，然后采用液相色谱高分辨质谱联用技术对其共有峰进行结构表征；基于结构确证的化学成分，再结合网络药理学方法，筛选潜在活性成分、作用靶点和通路之间的关系，分析预测乌药汤冻干粉治疗原发性痛经的潜在药效成分及可能的机制，最后进行分子对接的相关验证，以期为乌药汤冻干粉的质量控制及治疗原发性痛经提供科学依据与参考。

1 材料

1.1 主要仪器

Agilent 1290型超高压液相色谱仪和Agilent 6530型高分辨质谱仪购自美国安捷伦科技有限公司；RE-52型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；BSA2245-CW型电子天平（瑞士赛多利斯科学仪器有限公司）；MH-1000型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）；WP-Z-UV型超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）；BK-360B型超声提取机（济南巴克超声波科技有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

乙腈和甲酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水（屈臣氏公司）。

乌药汤由当归、木香、甘草、乌药、香附5味中药组成，中药饮片经河北中医药大学药学院侯芳洁副教授鉴定，当归（产地：甘肃岷县）为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，木香（产地：云南大理）为菊科植物木香Aucklandia lappa Decne.的干燥根，甘草（产地：内蒙古乌兰察布）为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎，乌药（产地：浙江台州）为樟科植物乌药Lindera aggregata（Sims）Kos-term.的干燥块根，香附（产地：山东泰安）为莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根茎，凭证标本存放于河北中医药大学药学院中药炮制学教研室。采用“RANDBETWEEN”函数生成随机数在Excel中生成随机组合表，结果见表1。

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  表格1 乌药汤冻干粉饮片随机组合信息

  Table 1.Random combination information of Wuyao decoction lyophilized powder pieces

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2 方法与结果

2.1 指纹图谱的建立

2.1.1 供试品溶液的制备

按日处方量，分别称取乌药8 g，香附16 g，甘草4 g，香附4 g，木香4 g，参考“上㕮咀，每服五钱，水二大盏，去滓”制法[8]，将上述处方剂量饮片粉碎，过10目筛，置2 000 mL圆底烧瓶，加水1 080 mL，浸泡0.5 h，回流提取，先武火（功率：300 W）1 h，后保持微沸状态2  h，趁热滤过，滤液65℃减压浓缩至稠浸膏，再冷冻干燥成干粉。取冻干粉约0.2 g，精密称定，加入75%甲醇5 mL，再次精密称定，超声（功率：250 W，频率：40 kHz）提取30 min后，放冷，精密称定，用75%甲醇补足重量，13 680×g离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，即得。

2.1.2 色谱条件

色谱条件：以Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100  mm×2.1 mm，1.8 μm）为色谱柱；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~40  min，15%~50% A；40~45 min，50%~90% A；45~50 min，90% A；50~50.5  min，90%~15% A；50.5~55 min，15% A）；流速为0.3  mL/ min；柱温为35 ℃；检测波长为254  nm；进样量为5 μL。

2.1.3 精密度试验

取同一份供试品溶液（编号：S1），按“2.1.2”项下色谱条件连续进样6次，以甘草酸色谱峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.32%~0.56%、0.68%~1.74%（n=6），均＜3.0%，结果表明该仪器精密度良好。

2.1.4 重复性试验

取同一样品（编号：S1），按“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，以甘草酸色谱峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.87%~1.29%、1.21%~1.74%（n=6），均＜3.0%，结果表明该方法重复性良好。

2.1.5 稳定性试验

取同一份供试品溶液（编号：S1），室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h时按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，以甘草酸色谱峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.23%~0.62%、0.51%~0.66%（n=6），均＜3.0%，结果表明供试品溶液在室温条件24 h内稳定性良好。

2.1.6 相似度评价

根据表1各饮片的随机组合，按“2.1.1”项下方法制得10批供试品溶液，再按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A版），以供试品S1图谱作为参照图谱（R），再采用中位数法多点校正和色谱峰匹配，得到10批样品指纹图谱叠加图（图1），并计算相似度，表2结果显示，S1~S10样品的相似度范围在0.967~0.998，均＞0.96，表明乌药汤样品质量稳定，均一性良好。

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  图1 10批乌药汤冻干粉的指纹图谱叠加图

  Figure 1.Overlay diagram of fingerprint chromatograms for 10 batches of Wuyao decoction lyophilized powder

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  表格2 10批乌药汤冻干粉指纹图谱相似度

  Table 2.Similarity of fingerprint chromatograms of 10 batches of Wuyao decoction lyophilized powder

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2.1.7 共有峰表征

色谱条件：以Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）为色谱柱；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~40  min，15%~50% A；40~45 min，50%~90%  A；45~50 min，90% A；50~50.5  min，90%~15% A；50.5~65 min，15% A）；流速为0.3  mL/ min；柱温为35℃；检测波长为254 nm；进样量为1 μL。

质谱条件：一级质谱选用质谱成像模式，质量扫描范围为m/z 100~1 700；二级质谱选用选择离子监测模式；碰撞电压为10、20、40 eV；干燥气温度为300 ℃；干燥气流速为6 L/min；雾化气压力为30 psi；毛细管电压为3 500 V（正离子模式）和3 000 V（负离子模式）；碰撞电压为150 V；采用Agilent MassHunter软件，采集正、负离子模式下的质谱信息。

得到乌药汤冻干粉供试品溶液的UPLC-UV色谱图和UPLC-TOF-MS总离子流图（正、负离子模式）后，将采集数据导入Qualitative Analysis 10.0软件，设置方法，建立化合物鉴定流程，将样品中的特征峰进行提取和分析，拟合出可能的分子式，并将碎片信息与成都普思生物科技股份有限公司自建的 个人化合物数据库与谱库（personal compound database and library，PCDL）二级数据库进行匹配，过滤质量偏差＞7.5 ppm、匹配得分＜80分的结果；同时，用在线数据库SIRIUS 5.8.5版本匹配二级碎片结果，选择匹配得分＞80分、Finger ID＜50的化合物，获得最终测试报告结果。具体见图2和表3。

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  图2 乌药汤冻干粉指纹图谱共有峰及正、负离子模式下的质谱离子流图

  Figure 2.Common peaks in the fingerprint chromatogram of Wuyao decoction lyophilized powder and mass spectrometry ion-flow diagrams in positive and negative

  注：A. 正离子模式；B. 负离子模式；C. 乌药汤冻干粉指纹图谱。

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  表格3 乌药汤冻干粉指纹图谱共有峰信息

  Table 3.Information of the common peaks in the fingerprint chromatogram of Wuyao decoction lyophilized powder

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2.2 网络药理学预测分析

2.2.1 乌药汤-原发性痛经共同靶点预测

将液质表征鉴定出的17个指纹图谱共有峰成分作为潜在活性成分，其中儿茶素和洋川芎内酯I的作用靶点由相似性集成方法（Similarity Ensemble Approach，SEA）数据库（https://sea.bkslab.org/）和中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）进行预测筛选；洋川芎内酯H在SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）、SEA数据库和TCMSP数据库均未预测到作用靶点，故舍弃。其余14个成分均在SwissTargetPrediction数据库中进行预测。疾病靶点以“primary dysmenorrhea”为检索词，于在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库（https://www.omim.org/）、GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、DisGeNET（Disease Gene Network）数据库（https://www.disgenet.org/）中进行检索。将成分靶点蛋白信息和疾病靶点蛋白信息通过UniProt（Universal Protein）数据库（https://www.uniprot.org/）进行标准化处理成统一的基因名，删除UniProt数据库中不包含、非人类和未经实验验证的基因，合并去重后，收集到成分靶点434个、疾病靶点368个和“成分-疾病”共同靶点55个，利用Venny 2.1.0软件将表征出的14个潜在活性成分靶点和原发性痛经相关靶点进行韦恩图映射，得到两者共同的交集靶点。结果见图3。

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  图3 “乌药汤-原发性痛经”共同靶点韦恩图

  Figure 3.Venn diagram of common targets between Wuyao decoction and primary dysmenorrhea

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2.2.2 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与分析

将“成分-疾病”交集靶点导入到STRING数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl），物种设置为“Homo sapiens”，蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）参数评分值设为“high confidence＞0.9”，隐藏游离节点，将结果保存为tsv格式文件并导入Cytoscape 3.9.1软件构建PPI网络（图4）。PPI网络中每个节点的直径大小和颜色深浅均代表一定的度（degree）值，直径越大，颜色越深，degree值越大。利用Cytoscape 3.9.1软件中的“Analyze Network”功能对PPI网络进行拓扑参数分析并以中位数为临界值，将符合degree值＞3、介数中心性＞0.004  492，并且接近中心度＞0.319 7的靶点列为核心靶点，经筛选得到12个核心靶点，结果见表4。

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  图4 “乌药汤-原发性痛经”共同靶点PPI网络构建图

  Figure 4.Construction diagram of PPI network of common targets in "Wuyao decoction-primary dysmenorrhea"

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  表格4 “乌药汤-原发性痛经”关键靶点信息

  Table 4.Key target information of "Wuyao decoction-primary dysmenorrhea"

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2.2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

利用DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）数据库（https:// david.ncifcrf.gov/）对12个核心靶点展开GO富集分析和KEGG通路富集分析，设置属性为“Homo sapiens”，以P≤0.05为筛选条件进行筛选。GO富集分析共得到132条相关生物过程，包括111条生物过程（biological process，BP）、9种细胞功能（cellular component，CC）和12种分子功能（molecular function，MF），分别选取BP、CC、MF中前10个条目进行可视化分析（图5）。GO分析结果表明，BP主要涉及雌二醇反应、基因表达负调控和凋亡过程正调控等；CC主要富集在细胞质、质膜、大分子复合物和板状伪足等区域；MF主要涉及相同蛋白质结合、蛋白激酶结合和酶结合等分子作用功能。通过KEGG通路富集分析，得到了87条相关通路，选取排名前10条通路（P≤0.01）进行可视化分析，结果见图6。结果显示：12个核心靶点主要通过调节TNF、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）-Akt、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、雌激素、IL^-17和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等信号通路，共同起到治疗原发性痛经的作用。

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  图5 “乌药汤-原发性痛经”共同靶点GO功能富集分析

  Figure 5.GO function enrichment analysis of common targets in "Wuyao decoction-primary dysmenorrhea"

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  图6 “乌药汤-原发性痛经”共同靶点KEGG信号通路（前10）

  Figure 6.KEGG signaling pathways (top 10) of the common targets in "Wuyao decoction-primary dysmenorrhea"

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2.2.4 “成分-核心靶点-通路”网络

将16个化学成分、核心靶点和KEGG富集分析前10条通路导入Cytoscape 3.9.1软件中，构建“成分-核心靶点-通路”网络（图7），其中绿色代表通路、蓝色代表成分、黄色代表核心靶点。对其进行拓扑参数分析，发现香叶木素（degree值=5）、羟基蓍含蓍素（degree值=4）、阿魏酸（degree值=4）、波尔定碱（degree值=3）、槐黄醇（degree值 =3）、臭灵丹酸（degree值 =3）的dgree值较高，为乌药汤的关键活性成分，可用于进行分子对接验证。

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  图7 “成分-核心靶点-通路”网络图

  Figure 7."Component-core target-pathway" network diagram

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2.2.5 分子对接验证

利用TCMSP数据库、PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载关键活性成分的小分子结构并以OpenBabelGUL软件转换为.mol2格式，通过PPI网络分析确定度值排名前6位的核心靶点，从Protein Data Bank（PDB，https://www.rcsb.org/）中获取其三维晶体结构.pdb文件。运用AutoDockTools1.5.6对受体分子进行去水分子、加氢操作，通过AutoDock Vina进行分子对接检测配体与受体的结合能力，结合能越小，配体与受体的结合能力越强。利用PyMOL软件对分子对接结果中6个核心靶点和关键活性成分最稳定的构象进行可视化，其可视化结果见图8，分子对接具体结果见表5。乌药汤中筛选的6种关键活性成分与核心靶点的结合能均＜ -5.0  kcal/ mol，有较强的结合能力，其中结合能＜ -7.0 kcal/mol的有16组，具有强烈的结合活性；羟基蓍含蓍素和臭灵丹酸与6个核心靶点蛋白对接结合能均＜ -7.0 kcal/mol，可进行高质量的分子对接，其中羟基蓍含蓍素与PIK3CA和ESR1的对接活性最高。以上结果表明乌药汤中香叶木素、羟基蓍含蓍素、阿魏酸、波尔定碱、槐黄醇和臭灵丹酸6种关键活性成分可与核心靶点蛋白结合，共同发挥治疗原发性痛经的作用。

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  图8 部分分子的“蛋白-分子”作用模式图

  Figure 8."Protein-molecule" interaction pattern diagrams of some molecules

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  表格5 分子对接结果

  Table 5.Molecular docking results

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3 讨论

中药复方的化学成分复杂，饮片的质量影响因素较多。本实验根据不同产地和不同批号进行随机组合，确保乌药汤物质基础的一致性。同时在UPLC指纹图谱试验中，对流动相组成和比例、色谱柱型号、样品制备方式等多方面进行考察，以期确定最适宜的色谱条件及供试品制备方法。最终建立了10批乌药汤冻干粉基准样品的UPLC指纹图谱，筛选出17个共有峰，并利用成都普思生物科技股份有限公司自建的PCDL二级数据库及对照品保留时间进行比对和指认，再运用网络药理学预测了上述17个化学成分对原发性痛经治疗作用的靶点预测和通路富集分析。

通过“成分-核心靶点-通路”网络发现，香叶木素、羟基蓍含蓍素、阿魏酸、波尔定碱、槐黄醇和臭灵丹酸可作为治疗原发性痛经关键活性成分。PPI网络分析结果表明，PIK3CA、STAT3、Akt1、CTNNB1、TNF、ESR1、PTGS2、IL-6、CYP19A1、MMP-2、CASP3和mTOR是乌药汤治疗原发性痛经的核心靶点。KEGG通路分析结果显示，乌药汤治疗原发性痛经的作用机制，由多条信号通路的共同参与。如：TNF、PI3K-Akt、MAPK、IL-17、VEGF、雌激素等信号通路。PIK3CA是一种癌基因，具有重要的生理功能，如调节体细胞增殖、分化和存活等[9]，Akt1是丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员，在调节代谢、增殖和血管生成等发面发挥作用[10]，PIK3CA和Akt1是PI3K/Akt信号通路的重要组成部分，PI3K/Akt信号通路具有调控细胞的增殖和凋亡的功能，可促进子宫内PI3K、Akt磷酸化，调节子宫的血液供应，缓解缺血缺氧状态[11]，减轻痛经的症状。研究表明PIK3CA突变可能使PI3K/Akt通路的异常激活，导致肿瘤细胞增殖和侵袭能力升高而凋亡水平降低[12]；Akt1可参与调节细胞内的代谢过程，代谢的改变导致细胞内微环境的变化，影响到基因表达的调控网络，使得孕酮受体的表达受到抑制，间接影响孕酮受体的表达[13]。现代研究表明原发性痛经的发生与前列腺素F_2α的合成及释放密切相关，前列腺素F_2α的增加会促使子宫平滑肌发生强烈收缩，导致子宫血流供应不足，进而引起缺血和缺氧，导致痛经[14]。ESR1与雌激素结合后形成二聚体，可促进子宫合成前列腺素F_2α[15]，雌激素信号通路也可通过雌激素调节前列腺素的生成影响痛经的形成。PTGS2作为将花生四烯酸代谢途径转化为前列腺素类物质的关键合酶，能够促进炎性前列腺素的产生，导致痛经的发生[16]。此外，炎症在原发性痛经的发病过程中也占据重要地位。炎性细胞因子IL-6可引发炎症反应，致使子宫平滑肌缺血缺氧，导致痛经[17]，TNF促炎因子可通过激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路、促进前列腺素合成等途径引发原发性痛经[18]。MAPK信号通路可影响体内前列腺素含量改善子宫平滑肌痉挛收缩导致的子宫缺血缺氧[19]，在痛经时，子宫内膜中的IL-6、TNF-α等炎症因子增加，引发炎症反应，并与细胞膜上的酪氨酸激酶受体结合，激活MEK引发ERK的磷酸化，磷酸化后的ERK促进NF-κB转移至细胞核，与环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）基因启动子结合，调节COX-2的表达，COX-2是前列腺素合成的限速酶，可调控前列腺素F_2α的合成[20]。分子对接结果表明乌药汤中香叶木素、羟基蓍含蓍素、阿魏酸、波尔定碱、槐黄醇和臭灵丹酸可分别与 PI3K/Akt、MAPK、雌激素等信号通路中的核心靶点 PIK3CA、Akt1、ESR1、TNF等稳定地结合，进一步证明乌药汤可通过多成分、多靶点、多通路协同作用来治疗原发性痛经。

综上，本研究结果表明，乌药汤通过处方药味中的香叶木素、羟基蓍含蓍素、阿魏酸、波尔定碱、槐黄醇和臭灵丹酸等潜在活性成分，作用于PIK3CA、Akt1、TNF等12个核心靶点，干预调节PI3K/Akt、MAPK、雌激素等信号通路发挥治疗原发性痛经的作用，初步揭示了乌药汤治疗原发性痛经的多成分、多靶点、多通路协同作用机制。然而，本研究结果对乌药汤治疗原发性痛经后续研究意义的探讨仍存在局限性。尽管确定了部分潜在活性成分及核心靶点，但在这些活性成分于体内的吸收、分布、代谢、排泄过程以及其在复杂生物体内环境中如何精准调控靶点和信号通路的动态变化等方面，仍有待深入探究。在后续研究中，可基于本研究成果进一步开展体内药代动力学研究，深入了解活性成分的体内行为；同时，结合细胞实验与动物模型，深入剖析关键靶点与信号通路之间的相互作用网络及其在痛经病理过程中的时空特异性调节机制，更全面、深入地阐明乌药汤治疗原发性痛经的潜在活性物质基础及作用机制，为乌药汤质量标准的精细化建立以及创新性药物研发提供更为坚实的理论依据和实践指导。

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