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目的 基于灰色关联度和逼近理想解排序（TOPSIS）法探讨配伍不同比例的知母对石膏中钾（K）、钛（Ti）、锶（Sr）、钡（Ba）、钙（Ca）、镁（Mg）6种无机元素溶出的影响，为临床提供一定参考。
方法 建立电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法同时分析石膏-知母药对中K、Ti、Sr、Ba、Ca、Mg 6种无机元素含量，并用灰色关联度法和TOPSIS综合分析，与不同比例知母配伍前后，石膏中6种无机元素溶出的变化。
结果 ICP-MS法测定石膏-知母药对中无机元素的线性、精密度、重复性和稳定性试验结果良好，平均加样回收率为81.78%~104.13%，RSD为2.10%~4.62%（n=6）。与不同比例知母配伍后石膏中6种无机元素的溶出均显著高于石膏单煎（P＜0.05），石膏-知母30 ∶ 9配伍比例时石膏中6种无机元素溶出得分最高。
结论 ICP-MS法灵敏度高、准确性好，可用于石膏-知母药对中K、Ti、Sr、Ba、Ca、Mg等6种无机元素的溶出量测定。石膏-知母最佳配伍比例为30 ∶ 9时，可有效提高石膏中6种无机元素的溶出，为两者进一步的配伍研究提供依据。
石膏（Gypsum Fibrosum）为硫酸盐类矿物石膏族石膏，主要成分为含水硫酸钙（CaSO4·2H2O），味甘辛，性大寒，具有清热泻火、除烦止渴的功效[1]。除含有大量的Ca元素外，还含有钾（K）、钛（Ti）、锶（Sr）、钡（Ba）、镁（Mg）等丰富的无机元素[2-3]。知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge的干燥根茎，味苦甘，性寒，具有清热泻火、滋阴润燥的功效。石膏-知母为临床常用药对，两药相配，清热泻火、滋阴生津作用更强。临床用药以饮片配伍煎煮入药[4]，中药配伍具有促进、抵消或消弱疗效的作用，且能降低或消除某些不良反应[5-6]，故掌握中药方剂的配伍溶出规律对于中药质量研究、新药研究及中药配方颗粒的应用均有重大意义[7]。药对配伍研究是一个极其复杂的过程，药对之间可能会发生酸碱中和、水解、氧化还原及螯合等反应[8]。
近年来，许多学者对药对的化学成分、药理作用等做了大量研究[9-10]，但对药对中无机元素的研究较少。中药无机元素与中药的药效及不良反应密切相关。电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）法是目前应用较为广泛的无机元素分析方法，具有高精确度、高灵敏度及分析时间短等特点，能同时测定多种无机元素的含量。本研究采用ICP-MS法同时测定石膏-知母药对中K、Ti、Sr、Ba、Ca、Mg 6种无机元素的溶出，参考《伤寒论》中白虎汤和参母石膏汤以及临床用药配伍使用习惯[11-12]，考察石膏-知母不同的配伍比例对石膏中无机元素溶出的影响，并进一步构建灰色关联度和逼近理想解排序（technique for order preference by similarity to an ideal solution, TOPSIS）法模型，对不同配伍比例下石膏中无机元素溶出进行综合评分优选，为石膏-知母药对临床应用及进一步研究提供一定的参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器
ICP-Q电感耦合等离子体质谱仪（赛默飞仪器有限公司）；DRN-41微波消解仪（意大利米尔斯通）；VfaB24 PLUS石墨消解仪（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）；ME204E万分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）；Milli-Q Direct超纯水系统（默克股份有限公司）。
1.2 材料
Ba单元素标准溶液[浓度: 100 μg·mL-1，批号：GBW（E）080243]、Sr单元素标准溶液[浓度：100 μg·mL-1，批号：GBW（E）080242]、Ti单元素标准溶液（浓度：100 μg·mL-1，批号：NIM-RM3041）均购自中国计量科学研究院；氯化钙（CaCl2）标准溶液（浓度：75 000 μg·mL-1，批号：BWZ7038-2016）购自北京世纪奥科生物技术有限公司；K单元素标准溶液（浓度：1 000 μg·mL-1，批号：GBW（E）083296）、Mg单元素标准溶液[浓度：100 μg·mL-1，批号：GBW（E）083298]购自北京北方伟业计量技术研究院；内标溶液锗（Ge，浓度：1 000 μg·mL-1，批号：19121035）、内标溶液铟（In，浓度：1 000 μg·mL-1，批号：19041135）、内标溶液铋（Bi，浓度：1 000 μg·mL-1，批号：19120435）均购自钢铁研究总院；硝酸（优级纯，广州化学试剂厂）；氢氟酸[优级纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司]；水为超纯水。
试验所用药材经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定，石膏（批号：S1，产地：山东临沂）为硫酸盐类矿物石膏族石膏Gypsum Fibrosum，知母（批号：Z1，产地：河北保定）为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge的干燥根茎。
2 方法与结果
2.1 石膏-知母药对的制备
分别称取石膏、知母饮片不同比例（30 g ∶ 0 g、30 g ∶ 3 g、30 g ∶ 9 g、30 g ∶ 15 g、30 g ∶ 50 g），并平行制备3份。按照中药饮片标准汤剂制备流程[13]对石膏-知母药对进行合煎，加入400 mL水，浸泡30 min，武火煮沸后文火保持微沸，至煎液量剩余200 mL时，200目筛网趁热过滤，即得。
2.2 阴性样品的制备
按照上述方法，分别称取知母饮片适量 （3，9，15，50 g），平行3份，按“2.1”项下方法制备缺石膏的阴性样品。
2.3 ICP-MS测定条件
等离子体射频功率为1.3 kW；扫描方式为跳峰；冷却气流速为 15.00 L·min-1；辅助气流速为 1.2 L·min-1；采样锥孔径1.1 mm；截取锥孔径0.9 mm；延迟时间为3 s；重复次数3 次；以Ge、In、Bi为内标，监测信号的变动情况。
2.4 溶液的制备
2.4.1 内标溶液
分别精密量取Ge、In、Bi标准储备液适量，用2%硝酸溶液稀释成每1 mL分别含Ge、In、Bi为0.05 μg的溶液。
2.4.2 对照品溶液
分别精密量取Mg、K、Ti、Sr、Ba、Ca标准溶液适量，用2%硝酸溶液稀释，制成每1 mL含Mg为20，10，5，1，0.5，0.2 μg，含K为40，20，5，1，0.5 μg，含Ti为1，0.5，0.1，0.05，0.01，0.001 μg，含Sr为2，1，0.5，0.1，0.01 μg，含Ba为5，2，1，0.5，0.1，0.05 μg，含Ca为375，250，150，75，37.5，25 μg的标准溶液，取2%硝酸溶液作空白对照溶液。
2.4.3 供试品溶液和阴性样品溶液
取石膏-知母药对、缺石膏阴性样品溶液1 g，精密称定，置消解管中，精密加入5 mL的氢氟酸-硝酸（2 ∶ 1）混合溶液，置微波消解仪中，180℃消解1 h，放冷，取出内罐，置石墨消解仪180℃，蒸发30 min，再加入1 mL硝酸溶液，重复操作1次，加入硝酸溶液5 mL，密封，置微波消解仪中，180℃消解30 min，冷却，将消解液转移至50 mL量瓶中，用水洗涤容器，洗液合并于量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液和阴性样品溶液。同法制备试剂空白溶液。
2.5 方法学考察
2.5.1 线性关系考察
以标准溶液质量浓度为横坐标（X，μg·mL-1），待测元素计数与内标元素计数比值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，取空白对照溶液，按“2.3”项下条件进行测定。以连续测定3次空白溶液仪器响应值的3倍与10倍标准偏差所对应的各待测元素浓度作为检测限和定量限。结果见表1。
2.5.2 精密度试验
取对照品溶液适量，按“2.3”项下条件连续测定6次，Mg、K、Ca、Ti、Sr、Ba含量的RSD分别为3.12%，2.53%，2.13%，4.51%，4.01%，3.76%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.5.3 重复性试验
取同一份[石膏-知母（30 ∶ 3）]样品，平行6份，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下条件进样测定，Mg、K、Ca、Ti、Sr、Ba的平均含量分别为27.26，234.86，2 135.21，0.46，1.63，9.46 μg·g-1，RSD分别为3.52%，3.21%，3.05%，4.89%，3.58%，4.03%（n=6），表明该方法重复性良好。
2.5.4 稳定性试验
精密吸取同一份[石膏-知母（30 ∶ 3）]样品，于0，2，4，8，12 h按“2.3”项下条件进样测定，测得Mg、K、Ca、Ti、Sr、Ba含量的RSD分别为3.23%，2.52%，2.02%，4.75%，4.70%，1.72%（n=5），表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.5.5 加样回收率试验
精密称取[石膏-知母（30 ∶ 3）]样品0.5 g，平行6份，精密加入一定量标准溶液，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下条件进样测定，计算回收率，结果Mg、K、Ca、Ti、Sr、Ba元素平均加样回收率分别为87.39%，99.03%，99.16%，81.78 %，93.63 %，104.13 %，RSD分别为4.12%，3.12%，2.10%，4.53%，3.63%，4.62%（n=6）。
2.6 样品测定
选取Ge、In、Bi为内标，按“2.4.3”项下方法制备不同配伍比例石膏-知母药对供试品溶液和缺石膏阴性样品溶液，按“2.3”项下条件进样测定，取3次读数的平均值，根据标准曲线计算相应样品的质量浓度，扣除相应缺石膏的阴性样品的质量浓度，计算K、Ti、Sr、Ba、Ca、Mg元素的含量。采用Miscrosoft Excel 2007 软件处理原始数据，SPSS 20.0 软件进行统计学分析，计量资料以表示，采用t检验对比不同配伍比例石膏-知母药对中石膏的无机元素含量与石膏单煎的无机元素含量，P＜0.05为差异有统计学意义。结果见表2。
结果显示，配伍后石膏中Mg的溶出量均显著高于石膏单煎样品，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同配伍比例对石膏中K、Ca、Ti、Sr、Ba溶出影响较大且无明显规律，当石膏知母配伍比例为30 ∶ 9时，石膏中K、Ba离子溶出最大。
为更直观地表示石膏-知母不同配伍比例下石膏无机元素溶出的差异性，以测得的不同配伍比例药对石膏中K、Ti、Sr、Ba、Ca、Mg 6种无机元素的溶出量作为评价指标，采用Origin软件归一化处理后进行热图分析，结果见图1。热图条带颜色的变化体现各无机元素含量的高低，红色越深代表含量越高，蓝色越深代表含量越低，白色为含量均值。
2.7 灰色关联度分析
参考相关文献[14]，以灰色决策分析理论为基础，建立不同配伍比例条件下石膏-知母对石膏中金属元素溶出的相对关联度，并进行质量排序。
2.7.1 参考序列的选择
设有m个样品，每个样品有n项的评价指标，则组成一个评价单元序列{Xik}（i=1，2，3…m；k=1，2，3…n；在本研究中i=5，k=6）。
2.7.2 原始数据规格化处理
鉴于评价指标数据差异较大，需对原始数据进行变换处理，以均值化最为常用，公式为Yik=Xik/Xk（Yik为规格化处理后的数据，Xik为原始数据，Xk为第m个样品第k个指标的均值)。结果见表3。
2.7.3 关联系数的计算
用灰色关联度进行评价时，应选择其参考序列。最优参考序列和最差参考序列分别为{XSK}和{Xtk}（k=1，2，3…n）。设最优参考序列的各项指标是n个样品对应指标的最大值，即{XSK}；最差参考序列的各项指标是n个样品对应指标的最小值，即{Xtk}。计算各评价单元相对于最优、最差参考序列的关联系数。相对于最优参考序列的关联系数计算公式如下：
式中，
，
，（i=1，2，3…m）；ρ为分辨系数，一般取值为0.5即可。相对于最差参考序列的关联系数计算公式如下：
式中，
，
，（i=1，2，3…m）；ρ为分辨系数，一般取值为0.5即可。
2.7.4 关联度和相对关联度的计算
计算各评价单元相对于最优、最差参考序列的关联度，即求每个样品其n项评价指标关联系数的均值。相对于最优参考序列的关联度为：
相对于最差参考序列的关联度为：
如果评价单元与最优参考序列关联程度最大而同时与最差参考序列关联程度最小，则说明所评价单元序列的结果越理想，为最佳评价单元。由此将评价单元序列同时相对于最优参考序列和最差参考序列的相对关联度定义为公式（5），根据相对关联度的大小对评价单元序列进行排序，得到最终评价结果。评价单元的相对关联度计算公式如下：
根据相对关联度的大小对评价单元序列进行排序，最终得到优劣评价结果。相对关联度越大，该样品的综合评价越高，结果见表4。石膏-知母30 ∶ 9比例下石膏中无机元素含量的相对关联度为0.518，综合评价最高。
2.8 熵权TOPSIS分析
商权TOPSIS法是一种简便高效的多指标综合评价方法，能较大程度规避主观随意性[15]，以TOPSIS法来评价石膏-知母对石膏中金属元素溶出的影响，能较好地反映其质量。
2.8.1 建立初始决策矩阵
假设有m个样本（1，2，3，…m），每个目标有n个决策属性（1，2，3…n）。样本Ai（1，2，3，…m）在指标Bj（1，2，3…n）下的测量值为Xij，初始判断矩阵V的计算公式如下：
2.8.2 建立归一化决策矩阵
设有多个指标决策的样品Mj对指标Ci的值为xij（i=1，2，3…m；j=1，2，3…n），那么形成的多指标决策矩阵为：X=（x）n×m。
由于多指标决策分析中各指标存在较大差异，因此需要对原始数据进行归一化处理，并建立标准化决策矩阵。计算公式见（7），数据处理结果见表5。
2.8.3 熵值法确定各指标评价权重
多指标决策分析中评价指标的权重会影响最终结果的科学性及合理性，因此需要对各种评价指标进行合理赋权。信息熵是系统无序程度的度量，如果某指标的信息熵H越小，则其指标能提供的信息量越多，在综合评价中起到的作用就越大，权重越高。评价指标的信息熵H定义为式（8），第j个指标的熵权即可定义为式（9）。
2.8.4 决策矩阵的构建及最优向量、最差向量的确定
构建加权矩阵见公式（10），其中最优向量为Z+，最差向量为Z-。
2.8.5 计算每个评价对象与最优方案的贴近程度Ci
根据欧式距离，采用公式（11）计算各个方案对最优解的贴近度：
其中
，
。
2.8.6 计算欧式贴近度
根据Ci对评价对象进行排序。Ci在[0, 1]区间，越接近1表示该评价对象越接近理想，越接近0则越差。欧式贴近度越大，该样品的综合评价越高。结果见表6。石膏-知母30 ∶ 9条件下石膏中无机元素含量的欧式贴近度为0.61，其综合评价最高。
3 讨论
对石膏-知母样品的前处理方式进行考察，考察了氢氟酸的溶剂用量（1，2，3，5 mL）对6种无机元素含量的影响，结果发现，当氢氟酸溶剂用量3 mL时，6种无机元素已基本提取完全，为保证试验的重复性，故选择5 mL氢氟酸进行消解；考察了石墨和微波两种消解方式，发现微波消解6种无机元素的溶出量远远高于石墨消解，最终选择微波消解。
目前，中药质量评价主要以指标成分含量测定评价、指纹/特征图谱评价、谱效关系评价及药理评价。灰色关联度分析与TOPSIS模型比较适合对于化学成分复杂的中药材进行质量评价[14]。灰色关联度利用其“灰色思维”的思想和中医药理论特点相契合，可以实现对中药质量的综合评价。TOPSIS法[15]是根据评价目标与理想化目标的接近度进行优选的一种分析方法，可以有效解决中药质量评价时多指标不统一的问题。
中药本身成分较多，而配伍后的成分更为复杂，药物间的相互关系也异常复杂。本研究考察不同配伍比例的石膏-知母石膏中无机元素含量的变化，通过将多指标按照合理的权重转化为1个综合指标，降低进一步分析的复杂性，提高了分析的科学性与准确性，实现了对石膏-知母不同配伍比例下石膏中无机元素含量的综合评价，并初步筛选石膏-知母最优配比。
石膏-知母配伍，出自《伤寒论》中的白虎汤，是治疗热在气分的重要药对。石膏-知母不同配伍比例下（30 ∶ 3，30 ∶ 9，30 ∶ 15，30 ∶ 50）石膏中的K、Ti、Sr、Ba、Ca、Mg 6种无机元素含量与单煎（30 ∶ 0）存在一定差异，原因可能为知母中的某种化学成分与无机元素发生络合[16]，进而促进无机元素的溶出，另一方面可能由于知母用量增加改变了水煎液的pH，进而改变了无机元素的溶出效果。
根据《伤寒论》中的白虎汤石膏-知母配比为30 ∶ 9，参母石膏汤中石膏-知母配比为30 ∶ 10。石膏-知母临床应用配伍比例，接近30 ∶ 9时，使用频率较高。本文结果提示，石膏与知母药对比例为30 ∶ 9时，石膏中6种无机元素的溶出在上述5种配伍比例中溶出最高，说明以此比例配伍，最能促进石膏中无机元素的溶出，结果进一步验证了石膏-知母临床配伍应用的合理性。因此方剂中不宜盲目增加某单味药的用量而应有适当的配伍比例[17]。中药指标性成分并不是引起药效作用发生变化的唯一原因，中药煎煮过程是一个复杂的水溶平衡体系[18]，各种无机元素及多种化学形态共同存在，其药效还需要进一步研究阐明。
本研究建立了ICP-MS法同时测定石膏-知母药对中6种无机元素的溶出，方法重复性、准确度及稳定性良好，可用于石膏-知母药对质量控制。本研究进一步测定石膏-知母不同配伍比例下石膏中6种无机元素的溶出变化，并采用灰色关联度与TOPSIS模型分析进行综合评价。结果表明石膏-知母药对30 ∶ 9时，最有利于石膏中6种无机元素的溶出，可为临床石膏-知母药对的使用提供参考。
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