目的  在细胞和动物水平考察蒲公英醇提物抗呼吸道合胞病毒（RSV）的作用，预测其作用机制并进行实验验证。

方法  通过细胞病变效应（CPE）结合MTT法，以治疗指数（SI）为指标考察蒲公英醇提物的体外抗病毒作用。利用小鼠RSV感染模型，以体重变化率、肺指数、肺组织切片、肺部病毒载量为指标考察蒲公英醇提物的体内抗病毒作用。通过网络药理学预测蒲公英醇提物抗RSV的作用机制，RT-qPCR技术检测表皮生长因子（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、信号转导与转录激活因子3（STAT3）、白细胞介素（IL）-6的表达水平，ELISA法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，Western Blot法检测核因子κB（NF-κB）蛋白表达水平，对网络药理学预测的靶点和通路结果进行验证。

结果  体外实验结果表明，蒲公英醇提物半抑制浓度（IC50）为0.005 mg/mL，SI值＞200.2，且随质量浓度增加，抗RSV效果越明显。体内实验结果表明，蒲公英醇提物显著缓解RSV感染带来的小鼠体重下降，降低肺病毒载量及EGFR、STAT3、MAPK3、NF-κB、TNF-α水平，改善肺部病症情况。网络药理学结果筛选到蒲公英的57个化学成分和RSV疾病靶点1 507个，取交集后得到55个共同靶点。蛋白互作网络分析得到EGFR、MAPK3、STAT3、IL-6等核心靶点。GO功能和KEGG通路富集分析得到程序性死亡受体1（PD-1）/程序性死亡配体-1（PD-L1）、IL-17等信号通路。RT-qPCR结果显示，蒲公英醇提物能够降低EGFR、STAT3、MAPK3 mRNA水平。ELISA检测结果显示，蒲公英醇提物能够降低TNF-α水平。Western Blot结果显示，蒲公英醇提物能够降低NF-κB蛋白表达水平。

结论  蒲公英醇提物具有较好的体内外抗RSV作用，其作用机制可能是通过作用于EGFR、MAPK3、STAT3、IL-6等靶点，并通过PD-1/PD-L1、IL-17等信号通路，影响NF-κB、TNF-α等炎症因子的水平发挥抗RSV效果。

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是一种能够引起呼吸道感染的合胞体单链RNA病毒，该病毒是全球范围内引起各类人群急性下呼吸道疾病的主要病原体之一[1]，具有发病性急、传染性强等特点[2]。据统计，这种病毒每年在全球范围内会导致3 000万次急性下呼吸道感染[3]，大约25%因RSV住院的患者需要重症监护，其中6.6%的住院患者发生死亡[4]。虽然目前已有疫苗在投入研究和使用，因其安全性仍存在一些隐患[5]，中医药作为中国传统医学的重要组成部分，具有毒副作用小、资源丰厚、抗病毒功效强等特点[6]，同时秉持着整体观和辨证论治理念在抗病毒治疗中有着独特的优势[7]。

蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand. -Mazz.、碱地蒲公英Taraxacum borealisinense Kitam. 或同属数种植物的干燥全草[8]。作为我国药食同源中药材之一，蒲公英中富含黄酮类、酚酸类、萜类等成分，具有清热解毒、抗炎、抗氧化和调节免疫等多种功效[9]。依据现有文献和研究[10-11]，蒲公英的主要成分及其药理活性见表1。

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  表格1 蒲公英的主要成分及其药理活性

  Table 1.Table 1. The main constituents of Dandelion and their pharmacological activities

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体外研究发现，蒲公英提取物具有显著的抗RSV活性[12]，且具有良好的生物安全性。但该提取物抗RSV的机制尚未清楚，本研究综合采用多种策略，深入探讨蒲公英的抗RSV特性。具体而言，结合细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）和MTT法评估蒲公英醇提物体外抗RSV的作用，同时利用RSV感染小鼠模型进一步探究蒲公英醇提物的体内抗RSV的作用。为深入揭示蒲公英抗RSV的作用机制，本文利用网络药理学技术和RSV感染小鼠模型探讨蒲公英抗RSV的作用机制，以期为蒲公英抗RSV的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

Spectra Max M5型酶标仪（美国Molecular Device公司）；BSC-150011B2-X型生物安全柜（济南鑫贝西生物科技有限公司）；YAMATO细胞恒温培养箱和TDD5M型台式离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；CKX53型倒置显微镜（日本Olympus公司）；A51638实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔生物科技有限公司）；Tanon 4600全自动化学发光分析系统（上海天能生命科学有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

蒲公英产地安徽毫州（安徽孚明中药饮片有限公司，批号：230901），经鉴定为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand. -Mazz的干燥全草；利巴韦林（北京索莱宝科技有限公司，批号：1023A021）；DMEM培养液（批号：6124153）和MTT（批号：40206ES7）购自百赛生物技术有限公司；0.25% EDTA胰酶（美国Gibco公司，批号： 17892）；二甲基亚砜（DMSO，美国AMresco公司，批号：231227）；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，批号：202412）检测试剂盒购自上海源桔生物科技中心；SPARKeasy组织/细胞RNA快速提取试剂盒（含基因组DNA清除柱，货号：AC0202-A）、SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit（with gRNA Earser，货号：AG0304-A）、2×SYBR Green qPCR Mix（with ROX，货号：AH0104-A）均购自山东思科捷生物科技有限公司。

1.3 细胞及病毒毒种

人非小细胞肺癌（A549）细胞购自上海生博生物医药科技有限公司；RSV由山东省医学科学院基础医学研究所提供，保存于山东中医药大学青岛中医药科学院实验室。

1.4 动物

4周龄BALB/c雌性小鼠36只，体重13~15 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）2017-0022，本研究经山东中医药大学海洋中药研究院审批通过（伦理批件号：SDUTCM20240810625）。

1.5 蒲公英醇提物制备

取200 g蒲公英饮片置于圆底烧瓶中，加10倍量50%乙醇，加热回流提取1 h，提取2次，收集提取液合并，离心（425×g，10 min），抽滤，减压浓缩（温度75~85℃、真空度-0.08~-0.09 Mpa），冷冻干燥48 h，即得蒲公英醇提物的干浸膏粉。

1.6 体外抗病毒作用研究

1.6.1 细胞培养

将A549细胞自-80℃取出后，置于37℃水浴环境中进行快速解冻。以106×g、3 min对细胞悬液进行离心处理。离心结束后，去除上清液，向细胞沉淀中加入新鲜配置的细胞培养液，轻柔地吹打细胞团块，使其分散成单个细胞。将细胞悬液转移至细胞培养皿中，并在标准培养条件下培养6 h。更换新鲜的培养液，继续培养细胞。当观察到细胞达到约80%的单层汇合度时，按照1 ∶ 3的比例进行传代培养，以扩增细胞数量[13]。

1.6.2 病毒扩增

在A549 细胞的汇合度达到大约70%时，移除当前培养基，使用PBS冲洗1遍细胞，加入200  μL病毒液（RSV），轻轻摇动培养皿以确保病毒溶液分布均匀，将细胞置于恒温培养箱中培养。期间每15 min轻摇1次培养皿。2 h后弃去含有病毒液的培养基，使用PBS冲洗1遍细胞，加入10 mL含2%胎牛血清的DMEM培养液。48  h内，每日使用显微镜观察细胞状态。培养结束后，将培养皿密封起来进行多次（3~4次）冻融循环，以释放细胞内的病毒颗粒。完成冻融循环后，将培养皿中的内容物转移至离心管中，106×g离心3  min，收集上清液并分装，在-80℃下保存备用。

1.6.3 病毒毒力测定

将A549细胞均匀接种于96孔板中，并置于预设条件（温度37℃、5% CO₂、相对湿度75%）的细胞培养箱中培养12 h。将“1.6.2”项下病毒液按照10倍比稀释7个浓度，逐一加入细胞中，每种稀释度设置6个重复孔，并将整个96孔板重新置于细胞培养箱中培养48 h。培养期间，密切关注并记录细胞的病变情况，最终按照Reed-Muench公式计算各病毒滴度半数细胞感染量（50% tissue culture infective dose，TCID₅₀）。

1.6.4 细胞毒性测定

在培养12 h后的A549细胞中加入按照3倍比稀释8个浓度的蒲公英醇提物，设置空白对照组，并且每个处理组均进行了3次重复实验。48 h后观察细胞病变情况，MTT法检测细胞活性。用酶标仪在490 nm处检测光密度（OD）值，并用GraphPad Prism 5软件作图拟合药半数细胞毒性浓度（concentration of cytotoxicity 50%，CC50）。

1.6.5 抗病毒活性测定

在培养12 h后的A549细胞中加入按照3倍比稀释8个浓度的蒲公英醇提物，感染病毒，设置空白对照组和模型组，每组设置3个复孔，置于细胞培养箱中培养48 h，观察细胞病变情况，MTT法检测细胞活性，酶标仪检测OD值，最后通过GraphPad Prism 5软件作图拟合药物半最大效应浓度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）。

1.7 CPE 实验

A549细胞经过胰酶消化后，重悬，接种于96孔板中。设置空白对照组、模型组、阳性药物组（利巴韦林）和蒲公英醇提物组，每个处理组设置3个复孔，置于细胞培养箱中培养24 h后，PBS冲洗，药物组加药液（每孔100 μL），模型组和空白对照组加同体积培养液，培养48 h后观察各组CPE情况并采集图像。

1.8 体内抗病毒作用和初步机制研究

1.8.1 造模及给药

将BALB/c小鼠随机分成6组，每组6只，分别标记为空白对照组、模型组、阳性药物组（利巴韦林）、蒲公英醇提物低、中、高剂量组。给予小鼠3 d适应期后，按照既定治疗方案给药，阳性药物组和蒲公英醇提物各剂量组每天灌胃相应的药物0.2  mL/次，2次/d，模型组和空白对照组灌胃等体积生理盐水。在给药第1天，所有小鼠均使用异氟烷进行麻醉处理，滴鼻给予病毒100 μL（1.2×10⁸ TCID₅₀/mL），连续滴鼻2 d，空白对照组滴鼻等体积对照培养液。

1.8.2 小鼠体重变化率的测定

每天上午9 ∶ 00检测小鼠体重作为小鼠当天体重，连续检测5 d，记录小鼠的体重变化率。

1.8.3 样品处理和指标检测

于灌胃第5天末次给药1 h后，称重并经眼球取血。脱颈处死，解剖取肺，称定肺重，计算肺指数。取部分肺组织保存在-80℃，用于RT-PCR检测；另取部分浸入4%多聚甲醛，供制作组织切片使用[14]。

1.8.4 肺组织切片的制备

将肺组织用多聚甲醛固定，经乙醇梯度脱水，二甲苯透化，石蜡包埋后制片。烘干切片，进行HE染色，最后在显微镜下观察病变情况。

1.8.5 RT-qPCR检测小鼠肺组织中病毒载量

经SPARKeasy组织/细胞RNA快速提取试剂盒（含基因组DNA清除柱）提取总RNA，并利用微量分光光度计测定RNA的浓度与纯度，通过SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit对所提RNA进行逆转录，得到的cDNA产物经2×SYBR Green RT-qPCR Mix试剂盒进行扩增。反应条件设置为为94℃、2~3 min初始变性以及40个扩增循环（94℃、10 s、和60℃、30 s）。以肽基脯氨酰异构酶A（peptidylprolyl isomerase A，PPIA）为内参，通过2^-ΔΔCT法计算和分析各实验组病毒mRNA相对表达水平，实验中使用的引物序列如表2所示。

1.8.6 RT-qPCR检测小鼠肺组织中表皮生长因子、信号转导与转录激活因子3、丝裂原活化蛋白激酶3和白细胞介素6水平

取“1.8.5”项下所得的cDNA产物经2×SYBR Green qPCR Mix试剂盒进行扩增。反应条件为94℃、2~3 min初始变性以及40个扩增循环（94℃、10 s和60℃、30 s）。以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，通过2^-ΔΔCT法计算和分析各实验组基因mRNA相对表达水平，实验中使用的引物序列如表2所示。

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  表格2 引物序列

  Table 2.Primer sequence

  注：EGFR：表皮生长因子（epidermal growth factor receptor）；STAT3：信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3）；MAPK3：丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3）；IL：白细胞介素（interleukin）。

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1.8.7 TNF-α的测定

将小鼠的血液样本置于4℃过夜后在4℃、956×g条件下离心20 min，取上清，ELISA法检测血清中TNF-α水平。

1.8.8 NF-κB蛋白表达水平的测定

取“1.8.3”项下小鼠肺组织，置于研磨机充分研磨，加入裂解液置于冰上裂解30 min，离心，收集上清液。加入蛋白缓冲液，置于沸水中变性5  min，进行SDS-PAGE电泳（70 V电泳30  min，120 V电泳60 min）转移至预活化的PVDF膜上。封闭15 min，TBST清洗3次。封闭后的PVDF膜置于一抗（稀释比例1 ∶ 3 000）中，4℃过夜，回收一抗，TBST清洗。加入二抗（稀释比例1 ∶ 5 000）孵育60 min，回收液体后，用TBST清洗。随后滴加显影液，置于全自动化学发光分析仪中成像，最后使用Image J软件分析条带灰度值。

1.9 统计学分析

通过Graphpad Prism 5软件进行two-way ANOVA分析，数据用表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.10 网络药理学

1.10.1 蒲公英活性成分筛选

根据蒲公英活性成分的现有研究[15]，结合中药与化学成分数据库（https://organchem.cs db.cn/ssdb/main/tcm_introduce.asp）进行活性成分筛选，检索词为“蒲公英”。

1.10.2 潜在靶点预测

将“1.10.1”获取的化学成分导入SwissTargetPrediction平台进行蒲公英活性成分的靶点预测。在GeneCards（https://www.Genecards.org/）和Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM，https://www.omim.org/）数据库检索“respiratory syncytial virus”并收集RSV靶点数据；将靶点上传至Venny平台（https://biomarker.bioinfo.cnio.es/tools/venny/）绘制韦恩图，得到蒲公英和RSV的相关靶点[16]。

1.10.3 蛋白互作网络

将蒲公英和RSV的相关靶点导入String数据库（https://string-db.org/），进行蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析，将数据导入Cytoscape 3.7.2软件，进行可视化，获取度（degree）值大于中位数的靶点，制备PPI网络图。

1.10.4 富集分析

在Matescape平台（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）中进行GO和KEGG 富集分析，排序后筛选前10的条目，导入微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化处理[17]。

2 结果

2.1 蒲公英醇提物体外抗病毒结果

2.1.1 病毒毒力结果

以A549为宿主细胞，测得RSV的毒力为 1.2×10⁸ TCID₅₀。

2.1.2 蒲公英醇提物的体外抗病毒结果

图1为不同质量浓度的蒲公英对A549细胞的细胞毒性和抗RSV的药效结果。通过GraphPad Prism 5软件作图拟合其CC50＞1  mg/ mL，表明蒲公英醇提物对A549细胞的细胞毒性较低，IC50=0.005 mg/mL，SI＞200.2，蒲公英醇提物具有较宽的有效、安全浓度范围。

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  图1 蒲公英醇提物体外抗RSV药效（n=3）

  Figure 1.The anti-RSV effect of Dandelion alcohol extract（n=3）

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2.1.3 CPE 结果

图2结果显示，质量浓度为0.125 mg/mL的蒲公英醇提物组与模型组相比CPE数目明显减少，表明其对RSV感染细胞有较强的抑制作用。

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  图2 CPE

  Figure 2.CPE

  注：A. 蒲公英醇提物组；B. 阳性药物组；C. 空白对照组；D. RSV病毒模型组。

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2.2 蒲公英醇提物的体内抗病毒结果

2.2.1 小鼠体重变化率

根据每天记录的小鼠体重数据计算体重变化率。结果显示，空白对照组小鼠体重持续增长，而其他组小鼠在感染后第2天起体重显著降低，这一趋势持续至第3天。此后，各组小鼠体重均开始恢复（图3）。

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  图3 小鼠体重变化率曲线（n=6）

  Figure 3.The curve of mice weight change rate (n=6)

  注：与空白对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

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2.2.2 小鼠肺指数变化

模型组小鼠肺指数较空白对照组显著升高（P ＜0.05）；经药物治疗后，蒲公英醇提物组和阳性药物组小鼠肺指数均明显降低（P ＜0.05）。具体见图4。

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  图4 蒲公英醇提物对小鼠肺指数的影响（n=6）

  Figure 4.Effect of Dandelion alcohol extract on lung index of mice (n=6)

  注：与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

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2.2.3 小鼠肺组织切片

各组小鼠的肺部特征呈现出显著差异，空白对照组的小鼠肺泡结构清晰，肺泡腔内未见渗出物（图5A），表明肺处于正常状态。模型组小鼠呈现显著的病理改变，包括肺泡壁增厚，肺泡腔缩小乃至近乎消失，以及肺泡腔内及肺间质有明显出血，伴有炎性细胞浸润（图5B）。蒲公英醇提物低、中、高剂量组与阳性药物组小鼠肺泡壁增生情况有所缓解，肺泡形态趋于正常，肺泡腔出血情况减轻，炎性细胞浸润情况减轻（图5C~5F）。

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  图5 小鼠肺组织切片

  Figure 5.Lung tissue slice of mice

  注：A. 空白对照组；B. 模型组；C. 阳性药物组；D. 蒲公英醇提物低剂量组；E. 蒲公英醇提物中剂量组；F. 蒲公英醇提物高剂量组。

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2.2.4 小鼠肺病毒载量

模型组小鼠肺组织病毒含量较空白对照组显著增加（P ＜0.05）；蒲公英醇提物中、高剂量组和阳性药物组小鼠肺组织中病毒载量较模型组明显降低（P ＜0.05）。具体见图6。

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  图6 小鼠肺组织病毒载量（n=6）

  Figure 6.The virus load of mice lung tissue (n=6)

  注：与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

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2.3 网络药理学

2.3.1 蒲公英活性成分和靶点筛选结果

在中药与化学成分数据库中检索“蒲公英”，获得57个化学成分，将这些成分导入SwissTargetPrediction数据库，去重后得到608个靶点。

2.3.2 RSV靶点

在GeneCards和OMIM数据库中检索“respiratory syncytial virus”，分别得到1 341和186个疾病靶点，将靶点进行去重处理，最终得到1 507个去重靶点。

2.3.3 PPI网络

如图7所示，韦恩图揭示了蒲公英成分靶点和RSV靶点的交集，共确定了55个共同靶点。PPI网络包含55个节点，439条边，根据Cytoscape 3.7.2软件分析结果，筛选出了大于degree值中位数（15.96）的13个基因（图8）。PPI网络中，较大的目标靶点和更深的颜色与更高的degree值有关。EGFR、PRKCA、IL-6、STAT3、MAPK3等基因在网络中占据核心位置，表明其可能是蒲公英抗RSV的核心靶点。

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  图7 蒲公英和RSV的关键靶点韦恩图

  Figure 7.Venn diagram of key target for Dandelion in the treatment of RSV

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2.3.4 富集分析结果

将蒲公英-RSV相关靶点导入DAVID数据库进行分析，取前10条在微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化，结果见图9。分析结果（FDR＜0.05）共涉及生物学过程800条目、细胞成分59条、条分子功能75。KEGG通路分析共识别出145条通路，主要与肿瘤中程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）的表达和程序性死亡配体-1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）检查点通路、IL^-17信号通路有关，提示上述信号通路可能为蒲公英抗RSV的核心通路。

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  图8 PPI网络

  Figure 8.PPI networks

  注：A. 交集靶点TSV文件；B. 交集靶点PPI网络；C. 核心靶点PPI网络。

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  图9 GO功能、KEGG功能富集分析

  Figure 9.Go and KEGG enrichment analysis

  注：A. GO功能；B. KEGG功能。

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2.4 体内实验验证

2.4.1 EGFR、STAT3、MAPK3、IL-6水平

PPI网络分析得到EGFR、STAT3、MAPK3、IL-6等核心靶点。如图10显示，模型组小鼠肺组织中EGFR、STAT3、MAPK3、IL-6 mRNA相对表达量较空白对照组显著升高（P＜0.05），表明小鼠感染RSV后可以引起EGFR、STAT3、MAPK3、IL-6mRNA水平的升高；与模型组相比，阳性药物组和蒲公英醇提物给药组能够降低EGFR、STAT3、MAPK3、IL-6 mRNA相对表达量（P＜0.05）。

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  图10 EGFR、STAT3、MAPK3、IL-6 mRNA表达水平（n=6）

  Figure 10.The mRNA expression levels of EGFR、STAT3 、MAPK3, and IL-6 mRNA (n=6)

  注：与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

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2.4.2 小鼠血清中TNF-α水平

与空白对照组相比，模型组小鼠血清TNF-α水平显著上升（P＜0.05）；与模型组相比，蒲公英醇提物给药组低、中、高剂量组和阳性药物组可显著降低小鼠血清中TNF-α水平（P＜0.05），且高剂量组与阳性药物组水平相当（图11）。以上结果表明，蒲公英醇提物可以显著降低RSV感染小鼠的炎症水平。

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  图11 TNF-α水平（n=6）

  Figure 11.The level of TNF-α (n=6)

  注：与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

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2.4.3 NF-κB蛋白表达水平

与空白对照组相比，模型组小鼠肺组织中NF-κB蛋白表达水平显著上升（P＜0.05），表明小鼠感染RSV后可引起NF-κB蛋白的表达增加；与模型组相比，蒲公英醇提物给药低、中、高剂量组和阳性药物组都可以降低小鼠肺组织中NF-κB蛋白的表达（P＜0.05）（图12）。这一结果表明蒲公英醇提物可以影响NF-κB蛋白表达，进而改善肺部病症[18-19]。

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  图12 NF-κB蛋白表达水平（n=6）

  Figure 12.The expression level of NF-κB (n=6)

  注：与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

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3 讨论

黄芩和连翘作为传统的清热解毒类中药，在抗RSV作用领域已积累了较多成果，其作用机制和活性成分特征为理解蒲公英抗RSV作用提供了重要参照。同时，作为药食同源中药，蒲公英的安全性更高，且适用人群更加广泛。本研究表明，蒲公英具有体内外RSV效果。PPI网络分析结果显示，蒲公英可通过调控EGFR、MAPK3、STAT3及IL-6等关键分子靶点，从而发挥抗RSV的作用。RSV主要侵袭气道上皮细胞，感染后会导致该细胞出现显著的病理学改变 [20]。研究表明，EGFR的异常激活会削弱气道上皮细胞对病毒感染的防御能力。在RSV感染过程中，EGFR信号通路被激活，导致细胞间紧密连接蛋白的表达降低，同时促进黏蛋白MUC5AC的过度表达，进而损害气道黏膜屏障的完整性[21]。MAPK3属于MAPK家族，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞应激反应和黏附调控中发挥重要作用[22]，发挥着调节细胞生长分化、炎症反应等多种重要的细胞病理、生理过程的作用[23]。研究发现，抑制IL-6/STAT3通路可降低小鼠炎症反应、氧化应激和肺组织损伤，改善肺功能[24]。IL-6是成纤维细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞等促炎细胞因子，在慢性炎症、自身免疫、内皮细胞功能障碍、血管形成和纤维生成中发挥作用[25]。

基于KEGG信号通路分析结果，蒲公英醇提物抗RSV的机制可能涉及PD-L1/PD-1免疫检查点通路及IL-17等相关信号通路的调控。PD-1/PD-L1通路作为重要的免疫调节途径，可通过抑制T细胞的细胞毒作用参与免疫逃逸过程，这一机制在肿瘤微环境中已被广泛证实[26]。IL-17信号通路通过介导NF-κB的活化，首先激活核因子κB激活剂1，随后触发MAPK级联反应。这一信号转导过程最终促使细胞核内多种炎症相关因子的表达上调，包括促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、抗菌肽以及基质金属蛋白酶等 [27]。实验研究表明，IL-17基因缺陷型小鼠表现出中性粒细胞趋化能力显著降低，同时对细菌感染的易感性明显增加。这些发现为IL-17在炎症调控网络中的关键作用提供了直接证据[28]。本研究的ELISA检测结果显示，蒲公英醇提物可能是通过调控PD-1/PD-L1通路和IL-17通路，抑制TNF-α水平，从而发挥抗RSV的效果。

本研究通过对比RSV感染细胞与药物干预后细胞的CPE数量，探究了蒲公英醇提物有体外抗RSV的作用，还通过体内小鼠感染RSV模型，以小鼠体重变化率、小鼠肺指数、肺组织切片、肺部病毒载量为指标，证明了蒲公英醇提物具有体内抗RSV的作用，通过网络药理学预测了蒲公英抗RSV的关键靶点和相关通路，最后通过ELISA法检测血清中TNF-α水平，Western Blot法检测NF-κB蛋白表达水平，实时荧光RT-qPCR技术检测小鼠肺组织中EGFR、MAPK3、STAT3、IL-6 mRNA的相对表达量对预测通路和核心靶点进行实验验证。充分展现了蒲公英多成分、多靶点、多通路协调抗RSV的优势，对中药新药研发和抗RSV的研究具有参考意义。

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