目的  建立液相色谱-三重四极杆质谱联用技术（HPLC-QqQ/MS）测定金丝桃苷在大鼠血浆中的含量，对比分析黄蜀葵花直服饮片与传统饮片中的金丝桃苷在正常大鼠与肾病综合征（NS）大鼠体内的药代动力学特征。

方法  血浆经乙酸乙酯萃取后，采用Agilent Poroshell 120 EC C₁₈色谱柱（100 mm×3 mm，2.7 µm），以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾离子化源负离子模式检测，利用DAS 2.0软件计算达峰时间（T_max）、峰浓度（C_max）、药时曲线下面积（AUC）、药物平均滞留时间（MRT）、表观清除率（CL/F）等药代动力学参数。

结果  与黄蜀葵花传统饮片比较，灌胃直服饮片后正常组大鼠T_max显著缩短，C_max显著升高，模型组大鼠C_max显著降低（P＜0.05）。与正常组大鼠比较，模型组大鼠灌胃黄蜀葵花直服饮片和传统饮片后AUC_0-t和AUC_0-∞极显著升高，V/ F显著降低，CL/F极显著降低（P＜0.05）；灌胃直服饮片后T_max极显著延长，平均滞留时间MRT_0-t显著延长（P＜0.05）；灌胃传统饮片后C_max极显著升高（P＜0.01）。

结论  灌胃黄蜀葵花直服饮片或传统饮片后，金丝桃苷在正常大鼠和NS大鼠体内药代动力学特征存在较大差异，直服饮片在正常状态下吸收更迅速、达峰时间更短；在NS模型状态下血药浓度峰值更低、波动更小，安全性优于传统饮片；NS模型可显著升高药物AUC_0-t和AUC_0-∞，显著降低CL/F与V/F，推测与肾脏清除受损、血浆蛋白结合改变相关。

肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是一种由肾小球滤过屏障通透性增加引起的肾脏疾病，其临床特征表现为蛋白尿、低白蛋白血症、水肿和高脂血症[1]。我国为NS高发地区，常见于学龄儿童及青少年，发病率为3.0~16.9/10万[2]。NS患者可能发生多种并发症，包括血栓形成、感染、血脂异常和肾功能不全等[3]。目前临床治疗NS的一线疗法为糖皮质激素，然而长期应用激素类药物可能导致NS演变为激素依赖性NS和频复发性NS，结果导致患儿出现肥胖、生长抑制、白内障、高血压病、糖尿病、骨质疏松等不良反应[4]。

黄蜀葵花为锦葵科植物黄蜀葵[Abelmoschus manihot（L.）Medic.]的干燥花冠。最早见于《嘉佑本草》，具有利尿通淋、活血止血、消肿解毒的功效。黄蜀葵花在临床上被广泛应用于糖尿病肾病[5]、慢性肾小球肾炎[6]、慢性肾病、肾小球硬化、NS[7-8]等肾脏疾病，而以其为主要药物研制的中成药黄葵胶囊同样在治疗肾脏疾病中获得较好的疗效。黄蜀葵花治疗肾脏疾病主要的药效物质基础为总黄酮[7]，其中占比最高的成分为金丝桃苷，有研究表明金丝桃苷对糖尿病肾病大鼠的肾脏组织具有保护作用[8]，对脂多糖所致的急性肾损伤同样具有保护作用[9]，促进NS大鼠肾细胞自噬活性，减轻NS大鼠足细胞损伤等[10]。

黄蜀葵花直服饮片为传统的黄蜀葵花饮片经低温超微粉碎后可直接饮用的粉体，经粉碎后粉体粒径可达到1~10 μm[11]，具有较好的溶解性、分散性、吸附性等特点。本研究以金丝桃苷为检测指标，对比黄蜀葵花直服饮片与传统饮片的粉末在正常大鼠与NS模型大鼠体内的药代动力学。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Shimadzu LC-40-AB SCIEX API 4500液质联用系统（日本岛津公司）；Spectra Max190型全自动酶标仪（美国Molecular Devices公司）；5804R型台式低温离心机（德国Eppendorf公司）；CPA225D型十万分之一电子天平（德国Sarturius公司）；Option S7+purelab flex型超纯水系统（法国Veolia公司）；MD200-2型氮吹仪（中国奥盛公司）。

1.2 主要药品与试剂

黄蜀葵花直服饮片与传统饮片购于扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司（产地：成都，批号：19042701），经四川省中医药科学院药学研究所陈雏研究员鉴定为锦葵科植物黄蜀葵[Abelmoschus manihot（L.）Medic.]的干燥花冠；金丝桃苷对照品（成都普斯生物科技有限公司，批号：PS013544，纯度≥98.5%）；内标大黄素对照品（成都普菲德生物科技有限公司，批号：18022605，纯度≥98%）；阿霉素（美国MCE生物科技有限公司，批号：251055）；Easy II Protein Quantitative Kit（BCA）试剂盒（北京TransGen生物科技有限公司，批号：20230623）；甲醇和甲酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水（自制）。

1.3 动物

SPF级雄性SD大鼠，鼠龄7~8周，体重（250±20）g，由北京斯贝福生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2019-0008，饲养四川省中医药科学院动物实验中心，温度为（20±2）℃，12 h循环光照条件下饲养，使用许可证号：SYXK（川）2023-0100。本实验经四川省中医药科学院伦理委员会批准（伦理批号：DWSYLL-2024-102）。

1.4 方法

1.4.1 色谱与质谱条件

色谱条件：Agilent Poroshell 120 EC C1₈色谱柱（100 mm×3 mm，2.7 µm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~1 min，22%→28% B；1~5.5 min，28%→38% B；5.5~15 min，38%→60% B；15~20 min，60%→100% B；20~25 min，100% B；25~30 min，22% B）；流速：0.4 mL/min；柱温：40℃；进样量：0.5 μL。

质谱条件：采用电喷雾离子化源负离子多反应监测模式；喷雾电压：-4 500 V；离子源温度：550℃；气帘气：35 psi；雾化气：55 psi；加热气：55 psi。待检测成分及内标用于定量分析的离子分别为金丝桃苷m/z 463.0 [M-H]-、大黄素m/z 269 [M-H]-。

1.4.2 动物建模与分组

将SD大鼠尾静脉注射阿霉素溶液（6.5 mg/kg）构建NS模型。造模10 d后，收集大鼠24 h尿液，采用BCA法检测尿蛋白含量。若尿蛋白含量高于100 mg/24 h，则判定为造模成功[12]。取20只造模成功的大鼠随机分为2组：黄蜀葵花直服饮片模型组（NS1）和黄蜀葵花传统饮片模型组（NS2），每组10只。另取20只正常大鼠随机分为2组：黄蜀葵花直服饮片正常组（N1）和黄蜀葵花传统饮片正常组（N2），每组10只。鉴于造模过程中存在动物死亡情况，最终各组纳入统计学分析的有效样本量均为6只。

1.4.3 药液配制与对照品、内标溶液配制

本实验设计依据相同浓度的金丝桃苷在正常大鼠和NS大鼠体内药代动力学的变化。黄蜀葵花直服饮片药液：称取黄蜀葵花直服饮片适量，用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成浓度分别为0.072 5 g/mL的药液。黄蜀葵花传统饮片药液：粉碎后过四号筛，取粉末适量煎煮浓缩为浓度0.056 2 g/mL的药液。二者的金丝桃苷含量均为5 mg/kg，所制得的两种药液均用于后续灌胃实验。

精密称取金丝桃苷适量，加入甲醇稀释配制成浓度为2、8、20、40、80、200、400 ng/mL的金丝桃苷对照品溶液。称取内标大黄素适量，加入甲醇稀释配制成浓度为10 ng/mL的大黄素内标溶液。

1.4.4 颈静脉插管手术

麻醉后，依次用碘伏和酒精消毒颈部皮肤。随后，分别于颈前（近心端）和颈后（远心端）各剪开一小口，将插管的一端插入颈静脉，远心端以缝线结扎，另一端从颈后穿出，用伤口夹固定。手术结束后向插管内依次注入肝素溶液（抗凝）和甘油（封管），最后用鱼线封用管口。术后腹腔注射青霉素钠预防感染，大鼠单笼饲养。所有手术器械均于使用前经高压蒸汽灭菌处理。

1.4.5 给药和样品采集

颈静脉手术恢复3 d后，对N1与N2组大鼠给予5%羧甲基纤维素的PBS溶液，NS1与NS2组大鼠分别给予黄蜀葵花直服饮片药液或黄蜀葵花粉末药液进行灌胃给药，给药体积为10 mL/kg[13]。给药前禁食12 h，给药前采集空白血浆，并于给药后0.083、0.16、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12 h经颈静脉插管采血300  μL，置于肝素钠抗凝离心管中，于4℃条件下以1 000×g离心10 min，分离上层血浆，保存于-80℃冰箱备用。

1.4.6 样品处理

取血浆50 μL，加入20 μL大黄素溶液（10 ng/mL），再加入1.5 mL乙酸乙酯，涡旋30 s后离心10 min（1 000×g）取上清。重复上述乙酸乙酯提取步骤一次，合并两次上清液。合并液在40℃条件下用氮气吹干（气体流速10 L/min），然后再用200 μL甲醇水（50 ∶ 50）复溶，按“1.4.1”项下条件进行检测。

1.4.7 方法学考察

① 专属性。取给药前采集的空白血浆、加入金丝桃苷对照品的空白血浆，以及大鼠灌胃黄蜀葵花直服饮片与传统饮片后的含药血浆，按“1.4.6”项下方法处理，并按“1.4.1”项下条件进样检测。

② 标准曲线和定量限。取大鼠空白血浆50 μL，分别加入50 μL浓度为2、8、20、40、80、200、400 ng/mL的金丝桃苷对照品溶液，再加入20 μL内标大黄素溶液（10 ng/mL），加入1.5 mL乙酸乙酯，涡旋30 s后离心10 min（1 000×g）取上清。重复上述乙酸乙酯提取步骤1次，合并两次上清液。合并液在40℃条件下用氮气吹干（气体流速10 L/min），然后再用200 μL甲醇水（50 ∶  50）复溶，得到浓度为0.5、2、5、10、20、50、100 ng/mL的系列标准溶液，按“1.4.6”项下方法处理，并按“1.4.1”项下条件进样检测。采用加权最小二乘法（权重系数W=1/X2）拟合并计算标准曲线回归方程。以仪器信噪比为10时对照品浓度作为定量限。

③ 精密度与准确度。精密吸取空白血浆50 μL，分别加入浓度为8、80、200 ng/mL的金丝桃苷对照品溶液，再各加入20 μL内标大黄素溶液（10 ng/mL），加入1.5 mL乙酸乙酯，涡旋30 s后离心10 min（1 000×g）取上清。重复上述乙酸乙酯提取步骤一次，合并两次上清液。合并液在40℃条件下用氮气吹干（气体流速10 L/min），然后再用200 μL甲醇水（50 ∶ 50）复溶，得到金丝桃苷浓度分别为2、20、50 ng/mL的低、中、高3个质量浓度水平的质控溶液，按“1.4.6”项下方法处理，并按“1.4.1”项下条件连续进样6次，连续测定3 d，分别计算日内精密度和日间精密度。将测定值代入随行标准曲线，分别计算各物质的浓度，并以实际测定浓度与理论浓度的比值表示准确度。

④ 基质效应与提取回收率。取大鼠空白血浆和给药血浆各50 μL，按“1.4.6”项下方法处理，分别加入8、80、200 ng/mL的质控溶液，并按“1.4.1”项下条件进样检测，分别得到峰面积A1和A2；分别取浓度为2、20、50 ng/mL的对照品溶液，按“1.4.1”项下条件进样检测，得到峰面积A3。计算基质效应（A1/A3×100%）和提取回收率（A2/A3×100%）。

⑤ 稳定性。精密吸取空白血浆50 μL，分别加入浓度为8、80、200 ng/mL的质控溶液，每个浓度平行制备3份。将溶液分别于室温放置6 h、-20℃冷冻放置72 h、自动进样器中（8℃）放置24 h，以及反复冻融3次。处理完毕后进样检测，考察溶液的稳定性。

1.5 统计学分析

采用DAS 2.0软件计算药代动力学参数。用SPSS 25.0软件进行统计分析，所有数据均以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差不齐则选用非参数检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 8软件绘图。

2 结果

2.1 方法学考察

①专属性结果。金丝桃苷和内标大黄素的保留时间分别为7.03 min和19.77 min。金丝桃苷和内标均未受到血浆中杂质及内源性物质的干扰，且金丝桃苷与内标可实现完全分离，表明所建立的方法专属性良好。具体见图1。

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  图1 专属性考察色谱图

  Figure 1.Chromatogram for specific attribute examination

  注：A. 空白血浆；B. 空白血浆+对照品；C. 含药血浆（黄蜀葵花直服饮片）；D. 含药血浆（黄蜀葵花传统）；E. 内标。

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②线性关系考察结果。金丝桃苷的标准曲线方程为Y=235.235 29X+13.000 81（r=0.999 8），结果表明金丝桃苷在0.5~100 ng/mL浓度范围内线性关系良好，定量限为0.5 ng/mL。

③ 精密度与准确度结果。精密度与准确度考察结果表明，金丝桃苷高、中、低质量浓度质控溶液的日内精密度RSD分别为2.74%、2.29%、8.21%（n=6），日间精密度为3.28%、2.29%、1.07%（n=6），日内、日间RSD均小于10%，日内和日间准确度的相对误差均在±15%之内，符合精密度、准确度生物样品定量分析指导原则的要求[14]。

④ 基质效应与提取回收率。基质效应考察结果表明，高、中、低质控样品浓度的金丝桃苷的基质效应RSD分别为5.17%、2.07%、9.89%（n=6），均小于15%，受内源性物质影响较小，符合相关指导原则要求[14]。

提取回收率考察结果显示，高、中、低质控样品浓度的金丝桃苷提取回收率的RSD分别为8.39%、11.33%、5.38%（n=6），提取回收率RSD≤15%，说明该提取方法结果稳定，适用于本实验中生物样品处理。

⑤稳定性。稳定性考察结果显示，血浆中3种质控样品浓度的金丝桃苷在室温下放置6 h、-20℃放置72 h、在自动进样器（8℃）放置24 h、反复冻融3次后RSD分别为9.48%、9.18%、5.16%、5.27%，均小于15%，说明血浆样品在上述条件下均稳定，符合相关指导原则要求。

2.2 NS模型鉴定

建模10 d后，对正常组大鼠和模型组大鼠进行观察，结果发现正常组大鼠毛色光滑、精神状态良好、体重持续增加，模型组大鼠则毛色无光泽、精神萎靡不振、出现腹泻导致体重降低，以及出现眼鼻部血性分泌物、尾部溃烂等现象。

大鼠尿液蛋白结果如表1所示，与正常组比较，模型组尿量明显增加（P＜0.05）；尿蛋白显著高于正常组（P＜0.05），且NS1、NS2组24 h尿蛋白＞100 mg，提示NS模型造模成功。

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  表格1 各组大鼠24 h尿液蛋白（x ± s，n=6）

  Table 1.24 h urine protein of rats in each group (x ± s, n=6)

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2.3 药代动力学分析

正常与NS模型大鼠口服给予黄蜀葵花直服饮片及传统饮片后金丝桃苷的药代动力学参数见表2。与黄蜀葵花传统饮片比较，直服饮片在正常组大鼠体内T_max显著缩短、C_max显著升高（P ＜0.05），表明直服饮片在正常生理状态下吸收速度更快，吸收程度更高。直服饮片在模型组大鼠体内的C_max显著降低（P＜0.01），表明在NS模型状态下，直服饮片的血药浓度峰值显著低于传统饮片。

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  表格2 黄蜀葵花粉末及直服饮片中的金丝桃苷在正常组和模型组大鼠体内的药代动力学参数（x ± s，n=6）

  Table 2.Pharmacokinetic parameters of hyperoside from directly taken decoction pieces and traditional decoction pieces of Abelmoschus manihot (L.) Medic. flowers in normal and model groups of rats（x ± s, n=6）

  注：AUC0-t：从给药开始到t时刻的药-时曲线下面积；AUC0-∞：从给药开始到所有原形药物全部消除为止时的曲线下总面积；Tmax：达峰时间；t1/2；半衰期；Cmax：峰浓度；MRT0→t：药物在体内的平均滞留时间，计算范围是从给药开始到采样时间点结束；MRT0-∞；药物在体内的平均滞留时间，计算范围是从给药开始到无限时间（即药物完全从体内清除）；V/F：表观分布容积与生物利用度比值；CL/F：表观清除率；NS1与N1、NS2与N2比较，aP＜0.05，bP＜0.01；N2与N1、NS2与NS1比较，cP＜0.05，dP＜0.01。

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与空白组比较，模型组大鼠灌胃黄蜀葵花直服饮片和传统饮片后AUC_0-t和AUC_0-∞都极显著升高（P＜0.01），表明NS模型状态下的体内系统暴露水平显著增加；V/F都显著降低（P ＜0.05和P＜0.01），表明NS模型状态下的体内分布范围有所减小。CL/F都极显著降低（P ＜0.01），表明NS模型状态下的体内清除速率显著减慢。灌胃直服饮片后T_max极显著延长（P＜0.01），表明病理模型状态下直服饮片的吸收速度有所减慢，平均滞留时间MRT_0-t显著延长（P＜0.05），表明病理模型状态下直服饮片在体内的作用时间有所延长。灌胃传统饮片后C_max极显著升高（P ＜0.01），表明病理模型状态下传统饮片的吸收程度显著增加，血药浓度峰值大幅上升。

2.4 药时曲线

正常与NS模型鼠口服给予黄蜀葵花直服饮片/传统饮片后金丝桃苷的药时曲线见图2，但模型组大鼠的状态对黄蜀葵花直服饮片和传统饮片产生了不同程度的影响。黄蜀葵花直服饮片和传统饮片在正常组大鼠中均出现了双峰吸收现象，进一步提示NS模型影响机体的吸收；黄蜀葵花直服饮片在正常组大鼠体内0.16 h迅速到达第1个血药浓度高峰，0.75 h到达第2个高峰；黄蜀葵花直服饮片在正常组大鼠体内0.25 h迅速到达第1个血药浓度高峰，1 h到达第2个高峰；黄蜀葵花传统饮片在正常组大鼠体内0.16 h迅速到达第1个血药浓度高峰，0.75 h到达第2个高峰；黄蜀葵花传统饮片在正常组大鼠体内0.25 h迅速到达血药浓度高峰；与正常组相比，模型状态下黄蜀葵花直服饮片和传统饮片的首吸收峰T_max延迟、次吸收峰出现时间延后，提示病理状态可能延缓了饮片的早期溶出与吸收进程。

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  图2 黄蜀葵花直服饮片及传统饮片中的金丝桃苷在正常和模型大鼠体内的血药浓度-时间曲线

  Figure 2.Blood concentration-time curve of hyperoside from directly taken decoction pieces and traditional decoction pieces of Abelmoschus manihot (L.) Medic. flowers in normal and model rats

  注：A. 黄蜀葵花直服饮片；B. 黄蜀葵花传统饮片。

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3 讨论

目前临床治疗NS以糖皮质激素为一线药物，根据患者的不同症状辅以血管紧张素转换酶抑制剂、利尿、降脂类药物，然而长期服用激素类药物易出现并发症及副作用，对患者的身心健康和生活带来压力。研究发现黄蜀葵花及其制剂黄葵胶囊对NS疾病表现出较好的疗效[15]。

已有研究发现金丝桃苷通过激活AMP活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/unc-51样自噬激活激酶1（AMP-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin/unc-51 like autophagy activating kinase 1，AMPK/mTOR/ULK1）通路促进肾细胞自噬活性，减轻NS大鼠的足细胞损伤等肾病变 [10]；对内毒素所致的小鼠急性肾损伤也具有一定的保护作用[16]；降低胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS- 1）磷酸化水平，激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 -kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路，减轻糖尿病肾病大鼠肾组织病理损伤[8]。因此，本研究以金丝桃苷作为检测指标，比较黄蜀葵花直服饮片与黄蜀葵花粉末在正常大鼠与NS大鼠体内药代动力学差异。

已有研究建立了测定黄蜀葵花中7种黄酮类成分含量的方法[17]；本研究建立了采用HPLC-QqQ/MS测定金丝桃苷在大鼠血浆中血药浓度的分析方法，并对比分析了金丝桃苷在正常和NS大鼠体内的药代动力学特征。药代动力学参数表明，黄蜀葵花直服饮片正常状态下吸收更快、达峰更早；在NS病理状态下血药浓度峰值更低、波动更小，在保证有效暴露的同时安全性更优；且药代变化规律稳定、可预测性更强，更利于临床给药方案的精准调整。此外病理模型可显著改变药物体内药代特征，两种饮片均表现为AUC显著升高、CL/F与V/F显著降低，提示模型状态可能通过降低肾脏清除能力、改变血浆蛋白结合及影响胃肠道吸收功能，导致药物体内暴露增加、分布减少、清除减慢。两种饮片消除半衰期无明显差异，提示其核心消除通路未受模型显著影响。药时曲线进一步提示，正常与 NS 模型大鼠口服黄蜀葵花直服饮片与传统饮片后，病理状态对两种饮片的体内吸收行为产生了明显差异。黄蜀葵花直服饮片与传统饮片在正常大鼠体内均呈现双峰吸收特征，提示金丝桃苷在体内可能存在肝-肠循环过程；此外模型状态下黄蜀葵花直服饮片和传统饮片的首吸收峰达峰时间延迟、次吸收峰出现时间延后，提示病理状态可能延缓了饮片的早期溶出与吸收进程。综合可见，黄蜀葵花直服饮片具有正常状态下吸收更快、达峰更早；NS模型状态下血药峰值更低、波动更小，安全性优于传统饮片，更适合临床持续给药，为其临床合理应用提供了可靠的药代动力学依据。

综上所述，黄蜀葵花直服饮片与黄蜀葵花粉末代谢趋势一致，但吸收程度、吸收、代谢的快慢以及在体内的滞留时间上表现出不同差异；黄蜀葵花直服饮片总体评价优于黄蜀葵花粉末，为临床用药指导提供一定参考；其次，正常组与模型组在吸收和代谢中也表现出了差异，推测可能原因为病理状态下体内环境改变进而导致吸收和代谢过程发生变化。

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