目的  高效液相一测多评（HPLC-QAMS）法测定食凉茶中10种成分，并联合多元统计分析和加权优劣解距离（E-TOPSIS）法评价其综合质量。

方法  色谱柱为COSMOSIL®5 C18-MS-Ⅱ柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，流速为1.0 mL·min^-1，检测波长为360 nm和222 nm。以芦丁为参照，结合QAMS法，对18批食凉茶中东莨菪苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、滨蒿内酯、槲皮素、山柰酚和夏蜡梅碱的含量进行测定。运用统计软件对18批食凉茶的含量数据进行化学计量分析；用E-TOPSIS法对食凉茶质量进行综合评价。

结果  10个成分均实现良好分离，并在各自的范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＞0.999 0）；平均加样回收率为96.98%~100.12%，RSD＜2.0%（n=9）。芦丁与其他9个成分的平均相对校正因子分别为2.115 7、2.592 4、0.553 1、0.897 6、0.780 7、1.159 3、0.693 6、1.458 3和0.601 7，RSD＜2.0%（n=6），QAMS法和常规外标法的定量结果显示两者无显著差异。多元统计分析结果显示，2个主成分的累计方差贡献率为83.886%，变量重要性投影值大于1的为山柰酚-3-O-芸香糖苷、芦丁和紫云英苷。E-TOPSIS分析结果显示，最优解的欧氏贴近度在0.180 4~0.739 4之间。

结论  建立的方法简便、准确且经济实用，可全面反映食凉茶的质量差异性，能较好地控制该品种质量。

食凉茶为蜡梅科植物柳叶蜡梅Chimonanthus Salicifolius S. Y. Hu和浙江蜡梅Chimonanthus Zhejiangensis M. C. Liu的干燥叶[1]，是畲族习用中药材，在整个畲医药系统中具有独特性和民族特性。其主要成分为挥发油、黄酮类、生物碱类、香豆素类等[2-4]。食凉茶具有祛风解表、清热解毒、理气健脾、消导止泻之功效，临床用于风热表证、脾虚食滞、泄泻、胃脘痛、嘈杂、吞酸。食凉茶收载于《浙江省中药炮制规范》2015年版[1]，但标准较为简单，含量测定项只有对挥发油的测定。中药因其多成分、多靶点的作用优势，在防治疾病方面具有独特疗效，仅靠挥发油去评价中药材的整体质量存在一定的片面性。因此，建立一个科学快捷的质量评价方法，对食凉茶的整体质量进行系统地评价具有重要意义。本试验建立了同时测定18批食凉茶中东莨菪苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、滨蒿内酯、槲皮素、山柰酚、夏蜡梅碱10个成分的HPLC一测多评（quantitative analysis of multi-components with a single-marker, QAMS）含量测定方法，并联合多元统计分析[5-6]和加权优劣解距离法（entropy-technique for order preference by similarity to ideal solution, E-TOPSIS）[7-8]对其化学成分进行差异性研究，可为食凉茶的整体质量和品质的综合评价奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；FA2004G型电子天平（上海花潮实业有限公司）；4020P型超声波清洗器（韩国JAC公司）。

1.2 试药

对照品：东莨菪内酯（批号：110768-202105，含量99.7%）、异嗪皮啶（批号：110837-202009，含量99.8%）、滨蒿内酯（批号：111511-201704，含量99.9%）、槲皮素（批号：100081-201610，含量99.1%）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（批号：112007-202103，含量94.0%）、山柰酚（批号：110861-202214，含量97.4%）、芦丁（批号：100080-202012，含量91.6%）均购自中国食品药品检定研究院；东莨菪苷（批号：CFS202201，含量≥98.0%）、紫云英苷（批号：CFS202202，含量≥98.0%）和夏蜡梅碱（批号：CFS201701，含量≥98.0%）均购自武汉天植生物技术有限公司；食凉茶样品信息见表1；乙腈和磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为自制纯化水。

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  表格1 样品采集地信息

  Table 1.Information of sample collection places

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2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用HPLC法，色谱柱为COSMOSIL^®5 C₁₈-MS-Ⅱ柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）[9-11]，梯度洗脱（0~ 12 min，15.0%A；12~22 min，15.0%→18.0%A；22~34 min，18.0%→43.0%A；34~46 min，43.0%→57.0%A；46~53 min，57.0%→65.0%A；53~60 min，65.0%→15.0%A）；检测波长：0~46 min，360 nm检测东莨菪苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、滨蒿内酯、槲皮素和山柰酚[12-15]，46~60 min，222 nm检测夏蜡梅碱[16]；流速为1.0 mL·min^-1，柱温为30℃，进样体积为10 µL。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取各对照品，用70%甲醇溶解并制成每mL分别含东莨菪苷0.112 0 mg、东莨菪内酯0.276 0 mg、异嗪皮啶0.928 0 mg、芦丁4.120 0 mg、山柰酚-3-O-芸香糖苷6.730 0 mg、紫云英苷2.956 0 mg、滨蒿内酯0.414 0 mg、槲皮素0.732 0 mg、山柰酚0.328 0 mg、夏蜡梅碱0.840 0 mg的对照品贮备液；再将对照品贮备液用70%甲醇稀释20倍制得每mL含东莨菪苷5.60 μg、东莨菪内酯13.80 μg、异嗪皮啶46.40 μg、芦丁206.00 μg、山柰酚-3-O-芸香糖苷336.50 μg、紫云英苷147.80 μg、滨蒿内酯20.70 μg、槲皮素36.60 μg、山柰酚16.40 μg和夏蜡梅碱42.00 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取食凉茶粉末（过4号筛）约1.0 g，置锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声（功率：400 W，频率：40 kHz）提取30 min，放冷，70%甲醇补足重量，摇匀，过滤，取续滤液即得。

2.4 外标法方法学考察的建立

2.4.1 系统适用性试验

分别精密量取空白溶剂（70%甲醇）、混和对照品溶液和供试品溶液各10 µL，按“2.1”项下方法进样测定，记录色谱图。结果东莨菪苷等10个组分与其他组分的色谱峰分离度符合要求，供试品溶液的保留时间、峰型与对照品溶液保持一致，HPLC色谱图见图1。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatograms

  注：1.东莨菪苷；2.东莨菪内酯；3.异嗪皮啶；4.芦丁；5.山柰酚-3-O-芸香糖苷；6.紫云英苷；7.滨蒿内酯；8.槲皮素；9.山柰酚；10.夏蜡梅碱

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2.4.2 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下对照品贮备液，经70%甲醇适当稀释，得到6个系列浓度的混合对照品工作液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以待测成分质量浓度为横坐标（X，µg·mL^-1），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表2。东莨菪苷等10个成分在各自的线性范围内与峰面积的线性关系良好。

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  表格2 各组分线性关系

  Table 2.Linear relationships of various constituents

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2.4.3 精密度试验

称取同一份食凉茶（编号：S1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行进样6次，结果东莨菪苷等10个成分峰面积的RSD依次为1.49%，1.32%，1.12%，0.89%，0.68%，0.96%，1.27%，1.14%，1.23%，1.08%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验

称取6份食凉茶（编号：S1），分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，用外标法计算东莨菪苷等10个成分的平均含量，分别为0.105 1，0.277 7，1.080 3，4.760 8，8.974 3，3.958 6，0.432 2，0.768 9，0.332 0，0.974 6 mg·g^-1，各成分含量的RSD依次为1.51%，1.33%，1.13%，0.85%，0.67%，0.97%，1.26%，1.17%，1.19%，1.10%（n=6），表明该法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验

取同一份供试品溶液（编号：S1），于制备后0，2，4，7，12，18，24，36 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果东莨菪苷等10个成分峰面积的RSD依次为1.89%，1.67%，1.48%，1.16%，1.29%，1.35%，1.69%，1.56%，1.78%，1.41%（n=8），表明食凉茶供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收试验

精准称取9份已知含量的食凉茶（编号：S1）细粉（过4号筛）0.5 g，分别按80%，100%，120%的3个不同水平精密加入混合对照品溶液（取东莨菪苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、滨蒿内酯、槲皮素、山柰酚、夏蜡梅碱对照品适量，用70%甲醇制成质量浓度分别为0.057 1，0.141 0，0.531 8，2.359 0，4.480 8，1.932 0，0.215 9，0.374 1，0.160 7，0.489 2 mg·mL^-1的混合溶液），再按“2.3”项方法制备供试品溶液，每个水平3份；按“2.1”色谱条件进样，结果10个成分的平均加样回收率分别为96.98%（RSD=1.44%），97.78%（RSD=0.95%），99.05%（RSD=1.02%），100.12%（RSD=0.73%），99.86%（RSD=0.89%），100.03%（RSD=0.86%），98.35%（RSD=1.13%），99.48%（RSD=0.96%），97.30%（RSD=1.02%），100.01%（RSD=1.32%）（n=9）。

2.5 相对校正因子的建立与考察

分别精准量取“2.4.2”项下6个混合对照品工作液，按“2.1”项下色谱条件进样，以芦丁为内参物，按以下公式计算芦丁与其他组分间的相对校正因子（f_is）：f_is=W_iA_s/W_sA_i，其中W_i和W_s分别代表内参物和其他待测组分的质量浓度，A_i和A_s分别代表内参物和其他待测组分的峰面积。相对校正因子结果见表3。

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  表格3 样品中待测组分的相对校正因子

  Table 3.The relative correction factors of the component to be measured in the sample

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2.6 相对校正因子重现性考察

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，考察3种色谱柱（COSMOSIL^®5 C₁₈-MS-Ⅱ、Venusil XBP C₁₈和Lichrospher C₁₈）分别在Waters e2695型和Agilent 1200型高效液相色谱仪不同条件下检测对相对校正因子的影响，以芦丁为内参物，计算芦丁与另外9个组分的相对校正因子（表4）。结果表明上述色谱仪和色谱柱对相对校正因子无显著影响。

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  表格4 仪器及色谱柱对相对校正因子的影响

  Table 4.Effects of instruments and chromatographic columns on the relative correction factors

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2.7 待测成分色谱峰定位选择

记录“2.6”项下测定的10个成分色谱峰保留时间，以内参物芦丁色谱峰为基准峰，计算以另外9个待测成分与芦丁的相对保留时间，对比考察仪器和色谱柱对相对保留时间的影响（表5）。结果表明相对保留时间的均值可用于对目标组分色谱峰进行准确定位（RSD均小于2.0%）。

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  表格5 仪器及色谱柱对相对保留时间的影响

  Table 5.Effects of instruments and chromatographic columns on the relative retention time

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2.8 HPLC-QAMS法与外标法含量测定比较

精密吸取18批食凉茶（编号：S1~S18）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，分别运用外标法和相对校正因子计算含量，再运用SPSS 26.0软件中独立样本t检验对各组分两种方法所得数据进行统计分析（表6），结果显示两种方法差异无统计学意义（P＞0.05）。

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  表格6 两种方法测定结果比较（mg·g-1，n=3）

  Table 6.Comparison of results by two methods(mg·g-1, n=3)

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2.9 食凉茶化学计量学质量分析的建立

2.9.1 主成分分析

以18批食凉茶样品中10个成分的HPLC-QAMS法测定的含量数据为变量，运用SPSS 26.0软件和SIMCA 14.1软件进行主成分分析（principal component analysis, PCA），构建PCA图（图2）。结果显示前2个主成分特征值均大于1，累计方差贡献率达83.886%，显示同一产地的食凉茶分布较为接近。由食凉茶主成分因子负荷矩阵（表7）可知，主成分1解释了东莨菪苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶、芦丁、紫云英苷、滨蒿内酯、山柰酚色谱峰的信息，主成分2解释了山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素和夏蜡梅碱的信息。

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  图2 18批食凉茶得分散点图

  Figure 2.PCA scatter plot of 18 batches of Shiliang tea

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  表格7 因子负荷矩阵

  Table 7.Component matrix

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2.9.2 偏最小二乘法-判别分析分析不同产地食凉茶的质量差异志物

将18批食凉茶中10个成分HPLC-QAMS法测定的含量数据作为变量，以“2.9.1”项下各批次分类情况为依据，运用SIMCA 14.1软件构建偏最小二乘法-判别分析（partial least squares method-discriminant analysis, PLS-DA）模型，结果18批食凉茶的分类更集中（图3）。所建模型的变量解释度R²X=0.957，R²Y=0.924，模型预测度Q²=0.867（R²X和R²Y分别表示多元统计量分析建模时在X轴和Y轴方向上的累积解释率，Q²表示模型对分组的预测能力），表明此模型稳定、可靠。进一步对变量重要性投影（variable importance in the projection, VIP）值进行分析，提取模型中的各变量VIP值，以VIP值＞1为标准，共筛选出3个成分，图4显示山柰酚-3-O-芸香糖苷（VIP=2.145 0）、芦丁（VIP=1.451 0）、紫云英苷（VIP=1.238 0）可能是区分不同产地食凉茶的标志性成分。

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  图3 不同产地食凉茶的PLS-DA模型得分图

  Figure 3.PLS-DA model scatter of Shiliang tea from different production areas

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  图4 PLS-DA模型中10个成分含量结果的VIP值

  Figure 4.VIP values of 10 components in the PLS-DA model

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2.9.3 加权权优劣解距离法分析

加权优劣解距离（entropy-technique for order preference by similarity to ideal solution, E-TOPSIS）法首先对18批食凉茶中10个成分的HLPC-QAMS法测定的含量数据建立原始数据矩阵，进行归一化处理，进一步得到最优、最劣方案，再计算各评价对象的正理想解距离（D_i⁺）和负理想解距离（D_i^-），获得与最优方案的相对接近程度（C_i），C_i值越大，样品质量越优。结果见表8。

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  表格8 18批食凉茶E-TOPSIS评价结果

  Table 8.E-TOPSIS evaluation results of 18 batches of Shiliang tea

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3 讨论

3.1 色谱条件优化

在HPLC色谱分析上，流动相的选择至关重要，常规的有机相为乙腈和甲醇，水相通常为水或加酸、加碱、缓冲液体系。本试验首先对乙腈-0.1%磷酸溶液[9-11]、乙腈-0.4%磷酸溶液[12-13]、乙腈-0.2%磷酸溶液[14]、乙腈-0.1%甲酸溶液[17]、甲醇-0.1%磷酸溶液[18]等流动相体系进行考察，结果以乙腈-0.1%磷酸溶液体系得到的色谱峰基线平稳、峰形对称，分离度较好。进而摸索了有机相与水相的洗脱比例，最终以“2.1”项下色谱条件为最优。

3.2 供试品溶液制备方式筛选

本试验在筛选优化供试品溶液的制备方式时，试验前期考察了多种提取溶剂（70%甲醇[9-11]、70%乙醇[12]、80%甲醇[19]、100%甲醇[18]）对食凉茶中东莨菪苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、滨蒿内酯、槲皮素、山柰酚和夏蜡梅碱综合提取率的影响，结果显示70%乙醇提取时，东莨菪内酯、紫云英苷和槲皮素等成分提取率均低于30%，提取效果较差；甲醇优于乙醇，70%甲醇、80%甲醇和100%甲醇提取时，10个成分综合提取率无明显差异，各成分提取率均高于80%，同时甲醇浓度越高，杂质相对较多，故选取70%甲醇作为提取溶剂。对超声和加热回流提取方式以及提取时间30，45，60，70 min进行考察，结果显示超声和加热回流提取10个成分综合提取率无明显差异，但加热回流提取杂质增多，同时随着提取时间的延长，杂质也会明显增加，影响色谱峰的分离和检测结果的准确性，故选择70%甲醇超声提取30 min作为食凉茶供试品溶液的制备方法。本课题组曾对供试品溶液制备时采用的定容法和称重法进行了对比考察，结果显示两种方法所得结果无明显差异，考虑到食凉茶为蜡梅科植物柳叶蜡梅和浙江蜡梅的干燥叶，质地较轻，最终确定采用称重法。加样回收试验结果显示10个成分的平均加样回收率达到95%以上，符合中国药典规定要求，表明所筛选的方法可用于食凉茶供试品溶液的制备。

3.3 含量测定结果分析

分别采用外标法和HPLC-QAMS法测定食凉茶中东莨菪苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、滨蒿内酯、槲皮素、山柰酚、夏蜡梅碱的含量，结果显示东莨菪苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、滨蒿内酯、槲皮素、山柰酚和夏蜡梅碱含量均存在批间差异，其原因可能与产地、生长环境、采收期等有关。HPLC-QAMS法和外标法测定结果无显著差异，HPLC-QAMS法计算值略高于外标法，后续将扩大样品批次收集，积累数据，查找原因，进一步进行分析验证。

3.4 质量评价结果分析评价

PCA提取出2个主成分的累计方差贡献率达83.886%；PLS-DA分析结果显示山柰酚-3-O-芸香糖苷、芦丁和紫云英苷可作为食凉茶的特征判别成分。E-TOPSIS分析结果显示不同产地的食凉茶质量存在差异，S1~S8排名靠前，质量较优，其中S3质量最优，S14质量最差。

本研究系统全面地评价了食凉茶的综合品质，初步筛选出对产品质量具有特征性的化学成分，所建立的HPLC-QAMS法测定10个成分含量的方法稳定准确，结合多元统计分析及E-TOPSIS分析可用于提高和完善食凉茶的质量控制标准。本试验在不同条件下对所建立的相对校正因子进行了耐用性考察，结果显示不同色谱仪和色谱柱对相对校正因子无显著影响，本文定量检测的10个成分涵盖黄酮、香豆素、生物碱等多种类别，化学性质、色谱行为存在一定差异，后续将在更多型号色谱仪和色谱柱条件下，进一步验证相对校正因子的耐用性。

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