目的  探究烟酰胺核糖（NR）在羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）所诱导的R28细胞氧化应激损伤模型中的保护作用。

方法  使用4 μmol/L CCCP诱导R28细胞产生氧化应激，并使用400 nmol/L NR进行干预，CCK-8实验检测细胞活力，Annexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，蛋白质印记法检测细胞色素C、半胱氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸蛋白酶-9表达水平以评估细胞凋亡；同时用四甲基罗丹明乙酯检测线粒体膜电位（MMP），MitoSOX检测线粒体活性氧（mtROS）水平，三磷酸腺苷（ATP）试剂盒检测ATP生成能力以评价线粒体功能。

结果  CCCP处理R28细胞后，细胞活力下降，凋亡蛋白水平和凋亡率上升，MMP下降，mtROS生成增加（P＜0.05）；NR预处理后，细胞活力上升，凋亡蛋白水平和细胞凋亡率下降，MMP上升，mtROS生成减少（P＜0.05）。

结论  NR通过抑制氧化应激反应，保护线粒体功能，从而增强细胞活性，降低凋亡蛋白的表达，最终减少视网膜神经节细胞凋亡。

视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell, RGCs）凋亡是许多神经退行性疾病的共同病理改变，包括青光眼、阿尔茨海默症[1]和视神经炎等，最终引起视神经的永久性损害和不可逆的视功能丧失[2]。因此，有效地减少RGCs凋亡，保护视神经已成为亟待解决的临床问题[3]。RGCs代谢活跃、含有丰富的线粒体，易受到氧化应激导致的损伤[4-5]，因而RGCs的线粒体功能障碍在视神经退行性疾病的发病过程中发挥着重要作用[6]。烟酰胺核糖（nicotinamide riboside, NR）是一种维生素B3，具有强大的抗氧化能力和良好的安全性。其代谢物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）参与了体内包括氧化还原反应在内的多种代谢活动，是代谢活动重要的组成部分[7-8]。本研究通过构建视网膜前体细胞（R28细胞）氧化应激损伤模型，并用NR进行干预，观察其是否具有线粒体保护作用从而达到减少凋亡、保护视神经的目的。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

CelMate系列CO ₂恒温培养箱（新加坡ESCO公司）；VICTOR Nivo型多功能酶标仪（芬兰珀金埃尔默公司）；CytoFLEX型流式细胞仪（美国贝克曼公司）；SVE-2型SDS-PAGE电泳仪（中国赛维尔公司）；75007203型离心机（美国赛默飞公司）；5200型全自动化学发光图像分析系统（中国天能公司）；IX73型荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.2 主要药品与试剂

羰基氰化物间氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP，货号：HY-100941）、NR（货号：HY-123033）均由中国MedChemExpress公司提供；胎牛血清（货号：FBS500-H）、DMEM/F12培养基（货号：A11330500T）、CCK-8试剂盒（货号：HYCCK8）均由中国HYCezmbio公司提供；Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒（美国碧迪公司，货号：556570）；RIPA裂解液（中国赛维尔公司，货号：G2002）；细胞色素C（Cytochrome C，货号：A13430）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，货号：A25309）、半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9，货号：A18676）和GAPDH（货号：AC001）、HRP标记的羊抗兔或鼠的二抗IgG（货号：AS014，AS003）均由中国爱博泰克公司提供；ATP检测试剂盒（中国碧云天公司，货号：S0026）；MitoSOX（美国赛默飞公司，货号：M36008）；四甲基罗丹明乙酯（tetramethylrhodamine ethyl ester，TMRE，中国爱必信公司，货号：abs42028262）；R28细胞来源于中南大学湘雅医学院第二附属医院江冰实验室。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及药物处理

R28细胞系为SD大鼠视网膜的永生化视网膜前体细胞[9]。用含10%胎牛血清的DMEM/ F12培养基培养，置于37℃、5% CO ₂恒温培养箱中，细胞密度达到80%~90%时，按照1 : 4的比例进行传代。实验分组：分别用含0，0.5，1，2，4，8  μmol/L CCCP的培养液孵育R28细胞24  h，其中0 μmol/L为对照（Ctrl）组；分别用含0，100，200，400，800，1 000 nmol/ L NR的培养液孵育R28细胞48 h，其中0 μmol/ L为对照（Ctrl）组；用含4 μmol/L CCCP、400  nmol/L NR的培养液分别或联合孵育R28细胞，分别命名为：对照（Ctrl）组、CCCP组、NR组、CCCP+NR组。

1.3.2 CCK-8实验检测细胞活性

将5×10³个R28细胞接种到96孔板中，NR组进行48 h药物处理，CCCP组待细胞融合度达到70%时进行24 h的药物处理，随后向每孔添加10 μL CCK-8溶液，并在37℃避光条件下孵育2 h，采用酶标仪于450 nm波长处测量光密度（OD）值，并计算细胞活力，公式如下：细胞活力=（OD _{加 药}-OD _空白）/（OD _对照-OD _空白）。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡

利用Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。将R28细胞消化后，重悬于缓冲液中，混匀后加入5 μL Annexin-V/PI，避光染色15 min后终止反应，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3.4 蛋白质印迹法检测蛋白表达水平

RIPA裂解液提取总蛋白，使用SDS-PAGE电泳，转膜后用含5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入Cytochrome C、Caspase-3、Caspase-9（稀释比例1 ∶ 1 000）和GAPDH（稀释比例1 ∶ 10 000），4℃孵育过夜，HRP标记的羊抗兔或鼠的二抗IgG（稀释比例1 ∶ 2 000）；室温孵育2 h后，采用ECL发光，以GAPDH为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.3.5 ATP测定

每孔加入200 μL ATP裂解液静置冰上5  min，之后在4℃、12 000×g条件下离心5 min并取上清；96孔板中每孔加入100 μL ATP检测工作液，室温静置5 min，加入20 μL样品，3  min内用化学发光仪检测相对光强度（RLU）值。RLU值高低与ATP含量成正相关。

1.3.6 MitoSOX检测线粒体活性氧

MitoSOX是一种选择性地检测线粒体中的活性氧的荧光探针，荧光越高代表线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species, mtROS）水平越高。每孔加入500 μL MitoSox（3 μmol/L）工作液，在37℃孵育15 min；去除工作液后，用PBS润洗，4%多聚甲醛室温固定10 min，抗荧光封片剂封片；采用荧光显微镜拍照，Image J软件分析荧光强度。

1.3.7 TMRE测定线粒体膜电位

TMRE的荧光强度与线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）成正比，其变化可反映线粒体功能状态。TMRE工作液（10  μmol/L）加入细胞培养板中，37℃避光孵育15 min；PBS洗涤细胞2~3次，加入500 μL无血清培养基，30 min内使用荧光显微镜检测TMRE荧光，Image J软件分析荧光强度。

1.4 统计分析

采用GraphPad 9.0软件对数据进行统计分析。本研究各项实验均重复3次，数据以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCCP对R28细胞活性的影响

分别用不同浓度的 CCCP处理R28细胞24 h。CCK-8结果显示，与Ctrl组相比，2，4，8 μmol/ L CCCP组的细胞活力显著降低（P＜0.05），其中4 μmol/L CCCP处理24 h后，细胞存活约为50%，故本研究将4  μmol/ L CCCP处理24 h作为建模条件。具体见图1。

• 
  图1 CCCP对R28细胞活性的影响 (n=3)

  Figure 1.Effect of CCCP on the cell viability of R28 cells (n=3)

  注：与Ctrl组相比，aP＜0.05，bP＜0.01。

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2.2 CCCP对R28细胞凋亡的影响

与Ctrl组相比，CCCP组细胞凋亡率明显增加（P＜0.01，图2A），凋亡相关蛋白Cytochrome C、Caspase-3、Caspase-9的表达水平均升高（P＜0.05，图2B）。

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  图2 R28细胞凋亡率及凋亡蛋白表达水平（n=3）

  Figure 2.Apoptosis rate and expression levels of apoptotic proteins in R28 cells (n=3)

  注：A.细胞凋亡（Q1-UR表示晚期凋亡或坏死细胞，Q1-LL表示活细胞，Q1-LR表示早期凋亡细胞）；B.Cytochromec、Caspase-3及Caspase-9的蛋白表达；与Ctrl组比较，aP＜0.05，bP<0.01。

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2.3 CCCP对R28细胞线粒体功能的影响

与Ctrl组相比，CCCP组TMRE的荧光强度明显减弱（P＜0.05，图3A），提示MMP降低，MitoSOX的荧光强度明显增强（P＜0.01，图3B），提示mtROS生成增加。

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  图3 R28细胞线粒体膜电位和活性氧水平（n=3）

  Figure 3.The MMP and mtROS levels in R28 cells (n=3)

  注：A.MMP水平；B.mtROS水平；与Ctrl组比较，aP<0.05，bP<0.01。

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2.4 NR对R28细胞活性的影响

使用不同浓度NR处理R28细胞48 h，并检测其细胞活性，结果显示：与Ctrl组相比，100，200，400 nmol/L NR对R28细胞活性差异无统计学意义（P＞0.05，图4），因此，后续实验中选定对细胞活性无影响的最大浓度400 nmol/L NR处理48 h作为处理条件。

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  图4 不同浓度NR对R28细胞活性的影响（n=3）

  Figure 4.Effect of NR on the cell viability of R28 cells (n=3)

  注：与Ctrl组比较，aP<0.01。

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2.5 NR降低了CCCP诱导的R28细胞凋亡水平上升

与CCCP组相比，CCCP+NR组细胞活性增强（P＜0.01，图5A），凋亡率显著降低（P ＜0.01，图5B），凋亡相关蛋白Cytochrome C、Caspase-3、Caspase-9的表达水平均显著降低（P ＜0.01，图5C）。

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  图5 各组细胞活性、凋亡率及凋亡蛋白表达水平的比较（n=3）

  Figure 5.Comparison of cell viability, apoptosis rate, and expression levels of apoptotic proteins among different groups (n=3)

  注：A.细胞活力；B.细胞凋亡；C.Cytochrome C、Caspase-3及Caspase-9的蛋白表达；与Ctrl组相比，aP<0.05，bP<0.01；与CCCP组相比，cP＜0.01。

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2.6 NR逆转了CCCP诱导的R28细胞线粒体功能下降

与CCCP组相比，CCCP+NR组MMP回升（P ＜0.05，图6A），mtROS水平下降（P＜0.05，图6B），ATP生成能力增强（P＜0.01，图6C），提示NR能有效保护线粒体功能。结合以上所有的实验结果，NR能有效抑制R28细胞内的氧化应激反应，保护线粒体功能，降低凋亡蛋白的表达，减少细胞凋亡。

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  图6 各组MMP水平、mtROS及ATP产能比较（n=3）

  Figure 6.Comparison of MMP, mtROS and ATP production among different groups (n=3)

  注：A.MMP水平；B.mtROS水平；C.ATP水平；与Ctrl组相比，aP<0.05，bP<0.01；与CCCP组相比，cP<0.05，dP<0.01。

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3 讨论

RGCs的凋亡是多种神经退行性疾病共有的病理改变。例如，在青光眼中，高眼压诱导的RGCs凋亡导致视功能的丧失[3]；在阿尔茨海默症中，β-淀粉样蛋白和Tau蛋白在视网膜中沉积，导致RGCs功能障碍和凋亡[10]。这些疾病的共同特征是RGCs的功能和结构受到损伤，通常伴有过度氧化应激和线粒体功能障碍，最终导致了不可逆的视功能丧失。因此，发展新的治疗方法保护视神经，已成为急需解决的临床问题。本研究探讨了NR在氧化应激状态下对R28细胞的保护作用，结果表明，NR处理可有效抑制CCCP诱导的R28细胞氧化损伤，保护线粒体功能，减少细胞凋亡。

RGCs胞体位于视网膜，其轴突汇集形成视神经，是传递视觉信号至大脑皮层的唯一通路。RGCs视网膜部无髓鞘，依靠大量的线粒体来为轴突运输提供能量[11]。由于代谢活跃，因此易受到氧化应激的影响[4,5,12]，过度的氧化应激会导致 RGCs胞体和轴突退化，最终导致不可逆的视功能丧失[12-13]。本研究也证明了线粒体功能障碍可导致RGCs细胞凋亡，提示线粒体功能障碍可能参与了RGCs疾病的发病过程。

由于RGCs与线粒体、氧化应激关系紧密，氧化应激导致的线粒体功能障碍可能参与了RGCs相关疾病的发病过程[14]，因此抗氧化损伤成为重要的临床干预手段[3,15]。有研究将健康线粒体移植到病变小鼠受损的RGCs中，可有效降低ROS水平，恢复线粒体功能，并增强视网膜的电生理活动[16]。此外，研究者通过腺病毒将携带有线粒体复合体I基因载体，导入到视神经病变模型的小鼠体内，能显著增强小鼠线粒体功能，并部分恢复其视功能[17]。以上研究均证明，通过保护线粒体，可以有效地保护RGCs功能[18]。

NR是一种维生素B3，因其强大的抗氧化作用而备受关注[7]。NR作为NAD+的有效前体可以提高细胞内NAD+的水平，NAD+参与能量代谢和多条代谢通路的调控，补充NAD+可缓解多种因素导致的代谢障碍[19]。在视网膜退化和青光眼小鼠模型中的研究显示，NR治疗能够保护RGCs细胞，防止视功能退化[20-21]。在同为神经退行性疾病的阿尔茨海默小鼠中，研究者发现NR能缓解患病小鼠大脑的炎症改变，减少DNA损伤，减缓细胞衰老[22]。此外，NR还可以保护乙醇引起的肝损伤[23]，并抑制心力衰竭中的炎症因子激活 [24]。研究表明，NR具有良好的安全性和有效性，其可口服，且具有良好的生物利用度：单次口服NR可以使人体循环中的NAD+增加多达2.7倍[25]；长期口服NR补充（500 mg，qd，6周）可有效地刺激NAD+代谢，并且健康成人包括中老年人都能够良好地耐受[26]。因此，NR可能成为临床治疗新的辅助用药，用于保护视神经。

综上所述，NR在氧化应激状态下，通过保护线粒体功能来阻止RGCs损伤和凋亡。且由于NR可口服吸收利用，具有良好的生物利用度，为神经保护治疗提供了新的、可行的治疗方案。本研究也具有一定局限性，由于NR强大而广泛的作用，其不仅具有抗氧化应激的能力，也参与多条代谢通路的调控，NR也有可能通过其他途径保护了R28细胞的功能。尽管现有研究已表明NR对RGCs具有保护作用，但在未来的研究中，仍需进一步深入探讨NR如何通过改善细胞功能来发挥其保护作用。

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