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目的 建立超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱（UPLC-MS/MS）分析方法，以灰毡毛忍冬皂苷乙为指标成分，对金菊五花茶颗粒中可能存在的山银花掺伪行为进行有效鉴别。
方法 采用Waters BEH C18色谱柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm），以水-乙腈（均含0.1%甲酸）为流动相梯度洗脱，流速：0.3 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：2 μL；采用电喷雾离子源质谱，负离子扫描多反应监测模式测定。
结果 灰毡毛忍冬皂苷乙在0.10~10.00 μg/mL范围内线性关系良好（r=0.999 5）；加样回收率为101.31%，RSD为2.94%（n=6）。30批样品中，有15批样品检出了灰毡毛忍冬皂苷乙，其中4批的掺伪量超过3%。
结论 建立的检查方法灵敏度高、专属性强、快速准确，可为金菊五花茶颗粒掺伪山银花投料检查提供参考。
金菊五花茶颗粒收载于原《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第10册［1］，其处方由金银花、木棉花、葛花、野菊花、槐花五味花类中药和一味根茎类中药甘草组成。方中的主药金银花为我国药典收载品种，该品种曾经包含山银花，然而自《中国药典》2005年版起，金银花和山银花2个品种分列，金银花只有忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）一种来源，山银花则来源于忍冬科植物灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.）、红腺忍冬（Lonicera hypoglaucaMiq.）、华南忍冬（Lonicera confusa DC.）及黄褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosaHsu et S. C. Cheng）［2］。2种药材的形态特征有一定相似度，但山银花的市场价仅约为金银花的一半，故市场上存在将山银花掺入金银花药材中销售以牟利的现象。《中国药典》2025年版一部［2］已有清开灵注射液、银黄颗粒（丸、片、口服液）、连花清瘟颗粒（片、胶囊）、双黄连胶囊（滴眼剂）等多个品种收载了以灰毡毛忍冬皂苷乙为指标成分的山银花检查项，国家药品监督管理局亦先后发布了银柴颗粒、小儿咽扁颗粒、清热解毒口服液中灰毡毛忍冬皂苷乙检查项补充检验方法［3-5］，用以加强制剂中金银花投料合规性的检查。上述检验方法均为以蒸发光散射检测器为核心的液相色谱法，补充检验方法则增加了必要时可采用液质联用法对液相色谱测定结果进行验证的文字描述。基于金菊五花茶颗粒处方中金银花的占比不高，单位制剂中金银花原药材含量低的特点（每1 g制剂中约含金银花0.04 g），为考察金菊五花茶颗粒中金银花的投料是否存在掺伪山银花的情况，本研究采用灵敏度和专属性更强的液质联用法对山银花的特征性成分测定开展研究，现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 主要仪器
Xevo-TQ超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（美国沃特世公司）；XPR10百万分之一微量天平和ME204T万分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-400GKDV超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：160~400 W，频率：40 kHz）；H1750台式高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）。
1.2 主要药品与试剂
灰毡毛忍冬皂苷乙对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111814-202106，纯度96.1%）；乙腈（批号：F2407M202，色谱级）、甲酸（批号：244337，质谱级）均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；水为超纯水；其余试剂为分析纯。
采用来自监督抽样且按现行标准［1］全项检验合格的各处方药味中药饮片及山银花中药饮片，同时按标准［2］中金菊五花茶颗粒的处方和制法制备1份金菊五花茶颗粒全方模拟样（代号：S-qf）和2份分别掺入3%、5%山银花的金菊五花茶颗粒掺伪模拟样（代号：S-3%、S-5%）；金菊五花茶颗粒样品共30批，样品信息见表1，均为指定品种评价性抽检样品，按标准［1］检验均合格。
2 方法与结果
2.1 分析条件
2.1.1 色谱条件
色谱柱：Waters BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为水，流动相B为乙腈，均含0.1%甲酸，按表2进行梯度洗脱；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：2 μL。
2.1.2 质谱条件
离子源：电喷雾离子源；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：2 kV；脱溶剂气（氮气）流量：800 L/h、温度：500 ℃；锥孔气（氮气）流量：50 L/h；碰撞气（氩气）流量：0.15 mL/min；测定模式：负离子扫描；监测模式：多反应监测，母离子（m/z）1 397.8、定量子离子（m/z）1 073.5，定性子离子（m/z）603.4和471.4，锥孔电压20 V，碰撞能量依次为30、75、80 eV。
2.2 溶液的制备
2.2.1 系列对照品溶液
精密称取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品，用甲醇溶解制成浓度为500 μg/mL的溶液，作为贮备液。精密量取贮备液，用70%乙醇稀释制成0.10、0.50、1.50、2.50、5.00、7.50、10.00 μg/mL的系列对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液
取本品，研细，取约1 g粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，超声处理（功率：400 W，频率：40 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用提取溶剂补足减失的质量，摇匀，离心（6 873 ×g）10 min，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 基质效应和线性关系考察
取金菊五花茶颗粒全方模拟样，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，作为基质溶液。取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液贮备液，分别用基质溶液和70%乙醇按“2.2.1”项下方法制成系列浓度对照品溶液，并一同按“2.1”项下条件进行测定，以对照品溶液的质量浓度为横坐标（X，μg/mL），相应定量离子对的峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。溶剂标准曲线的方程为Y=5.178 8×103X-2.189 4×102，基质标准曲线的方程为Y=5.141 0×103X-4.6991×102。2条标准曲线几乎重合，斜率的相对平均偏差为0.37%，各浓度点的基质效应因子最小为0.93，最大为1.02，可视为无显著基质效应。2条标准曲线的相关系数均为0.999 5，表明线性关系良好。
2.3.2 检测限、定量限考察
取“2.2.1”项下制备的最低浓度点的对照品溶液，逐级稀释，按“2.1”项下条件进样测定，以信噪比3∶1对应的浓度作为检测限浓度，以信噪比10∶1对应的浓度作为定量限浓度，分别为0.002 μg/mL和0.008 μg/mL。
2.3.3 专属性试验
取金菊五花茶颗粒全方模拟样（灰毡毛忍冬皂苷乙阴性样品）及样品编号为D1的金菊五花茶颗粒（灰毡毛忍冬皂苷乙阳性样品），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，与“2.2.1”项下制备的对照品溶液一同按“2.1”项下条件进行测定，色谱图见图1，提示金菊五花茶颗粒的本底不含灰毡毛忍冬皂苷乙，附近也无干扰峰。
2.3.4 精密度试验
取“2.2.1”项下制备的系列对照品溶液的中间浓度点对照品溶液，按“2.1”项下的条件连续进样6次，测得灰毡毛忍冬皂苷乙定量离子对峰面积的RSD为1.68%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.3.5 重复性试验
取一批金菊五花茶颗粒（编号：D1），按“2.2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，与“2.2.1”项下制备的系列对照品溶液一同按“2.1”项下的条件依次进样，测得灰毡毛忍冬皂苷乙含量的平均值为0.082 2 mg/g，RSD为2.75%（n=6），表明方法重复性良好。
2.3.6 稳定性试验
取中间浓度点对照品溶液，置25 ℃样品仓中，按“2.1”项下的条件分别于0、2、4、6、8、10、12 h时进样，测得灰毡毛忍冬皂苷乙定量离子对峰面积的RSD为3.38%（n=7），表明对照品溶液在12 h内稳定性良好。
2.3.7 加样回收率试验
取一批金菊五花茶颗粒（编号：D1），平行取样6份，每份取样量为0.5 g，精密称定，按100%水平加入对照品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，与“2.2.1”项下制备的系列对照品溶液一同按“2.1”项下的条件进样测定，计算回收率。结果灰毡毛忍冬皂苷乙的加样回收率为101.31%，RSD为2.94%（n=6），回收率结果良好。
2.4 样品测定
取金菊五花茶颗粒全方模拟样、掺3%山银花和5%山银花的金菊五花茶颗粒掺伪模拟样，以及表1所列30批金菊五花茶颗粒抽检样品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，与“2.2.1”项下制备的系列对照品溶液一同按“2.1”项下条件进样测定，计算含量。结果见表3。
3 讨论
3.1 提取参数选择
参考文献［6-10］报道，对金菊五花茶颗粒的山银花阳性样品，分别考察了不同提取溶剂、不同提取方法和不同提取时间，根据测定数据将提取方法确定为以70%乙醇作为提取溶剂，超声提取45 min。
3.2 指标成分和监测离子的选择
灰毡毛忍冬皂苷乙是山银花的专属性成分，其作为含金银花制剂中掺伪山银花检查的指标成分已被《中国药典》2025年版一部［2］及国家药品监督管理局发布的多个药品检查项补充检验方法［3-5］所采用。灰毡毛忍冬皂苷乙在甲酸水-乙腈体系中主要以［M-H］-和［M+Na］+这2种离子形式存在。文献报道中，该成分监测离子对的母离子以［M-H］-为主［6，8-9，11-12］，也有采用［M+Na］+监测的报道［10，13-14］，采用［M+H］+的较少［7］。本研究显示，在甲酸水-乙腈体系中，以［M-H］-为监测对象具有较高的响应以及极弱的基质效应。若以［M+Na］+为监测对象，响应约为［M-H］-的1/7，同时基质效应十分明显，溶剂标曲和基质标曲的斜率相差近1倍，［M+Na］+在基质中的响应约为溶剂中的一半。若在流动相中添加Na离子，［M+Na］+的响应接近不添加Na离子的流动相中［M-H］-的响应，基质效应也有明显改善，但是基质效应和线性还是稍差于不添加Na离子的流动相中的［M-H］-，故最终确定负离子模式作为灰毡毛忍冬皂苷乙的测定模式。
3.3 液相色谱法可行性探讨
灰毡毛忍冬皂苷乙另一个常用的检测方法为用蒸发光散射检测器检测的液相色谱法，但是每1 g金菊五花茶颗粒中相当于金银花原药材的量仅约为0.04 g，若金银花中掺杂了3%山银花，则其中灰毡毛忍冬皂苷乙的含量约为0.05 mg/g，含量极低。使用岛津LC-20AT液相色谱仪，以奥泰3300蒸发光散射检测器对灰毡毛忍冬皂苷乙进行检测，进样量为20 μL时，检测限浓度约为5 μg/mL，与液质联用法的0.002 μg/mL相差较大。若采用液相色谱法检测，取样量至少需为液质联用法的5倍才能检出掺杂3%山银花中的灰毡毛忍冬皂苷乙，如需准确测定则还需增加净化浓缩的步骤。
3.4 结果分析
本项目共测定了7家生产企业的30批样品，有15批样品中检出灰毡毛忍冬皂苷乙，其中4批的含量高于掺伪3%山银花模拟样中灰毡毛忍冬皂苷乙的含量，4批中的2批的含量高于掺伪5%山银花模拟样中灰毡毛忍冬皂苷乙的含量，提示存在掺伪风险，具体比例需结合各企业实际转移率进一步确证（制备掺伪山银花模拟样所用山银花中灰毡毛忍冬皂苷乙的含量为5.7%，转移率为80%）。
3.5 小结
综上所述，本研究采用UPLC-MS/MS法测定金菊五花茶颗粒中灰毡毛忍冬皂苷乙的含量，该方法灵敏度高、专属性强、快速准确，可为金菊五花茶颗粒中金银花掺伪山银花投料检查提供参考。
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