目的  建立不同产地龙葵中11个成分含量同步检测方法，并采用化学计量学和熵权-TOPSIS法对其质量进行评价。

方法  收集8省17个批次龙葵样品，采用HPLC法同时检测龙葵中梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇的含量，建立龙葵多组分定量控制模式；采用化学识别模式和熵权-TOPSIS法建立龙葵质量优劣评价模型，对其整体质量进行综合评价。

结果  11个成分分别在0.78~39.00，0.55~27.50，0.34~17.00，0.21~10.50，41.87~2 093.50，60.95~3 047.50，2.58~129.00，1.02~51.00，0.46~23.00，1.05~52.50，0.42~21.00 µg/mL（r＞0.999 0）范围内线性关系良好，平均加样回收率在96.81%~100.28%范围内（RSD＜2.0%，n=9）；17批样品聚为3类；澳洲茄边碱、澳洲茄碱、去半乳糖替告皂苷和梣皮树醇可能是影响龙葵产品质量主要潜在标志物；熵权-TOPSIS法分析结果显示17批龙葵质量评价贴近度分别为0.433 6、0.416 8、0.624 2、0.500 8、0.479 1、0.636 1、0.568 3、0.250 0、0.190 9、0.222 1、0.170 7、0.720 0、0.698 3、0.744 7、0.717 9、0.720 9、0.718 3，辽宁、吉林和黑龙江产地龙葵整体质量较好，其次为江苏、河南和安徽产地。

结论  建立的同时测定龙葵中11种成分含量的HPLC法，操作便捷，结果准确；化学计量学及熵权-TOPSIS法客观全面，可用于龙葵的整体质量评价。

龙葵为茄科植物龙葵Solanum nigrum L.的干燥地上部分，在我国生长范围较为广泛[1]，具有调血解毒、清热止渴、收敛消肿之功效，主要用于热性气管炎、咽炎、胃炎、肝炎等病症的治疗[2]。龙葵主要含有甾体类、有机酸类、木脂素类及黄酮类等成分[3-6]，现代研究发现龙葵具有抗肿瘤、免疫调节、抗菌抗病毒等多种生物学活性[4-7]，甾体类成分澳洲茄碱和澳洲茄边碱及其水解后的苷元澳洲茄胺是龙葵抗肿瘤作用的主要活性成分[8]。龙葵未被《中国药典（2020年版）》一部收录，曾收录于辽宁、安徽、陕西等省地方标准[9-11]，但质量控制仅局限于显微鉴别、薄层鉴别及其他检查项目，涉及的含量测定也仅有单一指标的检测 [10]。文献对其质量标准的研究也只针对1~2个成分的定量分析[12-16]。中药成分复杂，易受产地、炮制方法和采收时间的影响，为保证临床疗效，有必要建立科学合理的质量评价模式来评控龙葵的整体质量。TOPSIS（technique for order preference by similarity to an ideal solution）法利用各评价指标与理想方案和负理想方案的欧式距离，通过计算各指标对最优方案的的贴近度，由繁到简，实现多目标决策分析，易计算、易理解、应用灵活、评价结果直观、科学、合理。同时融合化学计量学投影中的可变重要性（variable importance in projection, VIP）值为权重，使评价结果更具说明力。本研究收集河南、安徽、江苏、广西、广东、辽宁、吉林和黑龙江等8省不同产地17批龙葵药材，采用HPLC法同时测定龙葵中梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇含量，并采用主成分分析（principal component analysis, PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA）等化学计量学方法筛选影响龙葵产品质量的主要潜在标志物，同时利用熵权-TOPSIS法建立龙葵质量优劣评价模型，以期为龙葵整体质量控制提供科学的试验依据，同时为龙葵道地性研究提供数据支撑。

1 材料

1.1 主要仪器

KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Agilent 1260 Ⅱ型高效液相色谱仪，配备G7111B二元泵、Agilent 1260柱温箱、Agilent G7114A可变波长紫外检测器（美国Agilent公司）；XP105型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 主要药品与试剂

对照品槲皮素（批号：100081-201610，含量99.1%）、薯蓣皂苷元（批号：111539-202303，含量96.6%）、芦丁（批号：100080-202012，含量91.6%）和β-谷甾醇（批号：110851-201909，含量92.7%）购于中国食品药品检定研究院；澳洲茄碱（批号：PRF9032603，含量99.6%）、澳洲茄边碱（批号：PRF9052942，含量99.4%）、客西茄碱（批号：PRF10022141，含量99.5%）和澳洲茄胺（批号：PRF9041324，含量99.3%）购于成都普瑞法科技开发有限公司；去半乳糖替告皂苷（批号：20211221，含量98.0%）购于上海酶联生物科技有限公司；梣皮树脂醇（批号：CFS202201，含量≥98%）和松脂素（批号：CFS202201，含量≥98.0%）购于武汉天植生物技术有限公司；龙葵药材经浙江中医药大学药学院李志国教授按《安徽省中药材标准》（2022年版）鉴定，为茄科植物龙葵Solanum nigrum L.的的干燥地上部分，采集地信息见表1；液相用乙腈和磷酸均为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

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  表格1 17批龙葵样品信息

  Table 1.Information of 17 batches Solanum nigrum samples

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2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取各对照品适量，精密称定后用70%甲醇制成含梣皮树脂醇0.156 mg/mL、松脂素0.110 mg/ mL、槲皮素0.068 mg/mL、芦丁0.042  mg/ mL、澳洲茄碱8.374 mg/mL、澳洲茄边碱12.190 mg/mL、客西茄碱0.516 mg/mL、澳洲茄胺0.204 mg/mL、去半乳糖替告皂苷0.092 mg/ mL、薯蓣皂苷元0.210 mg/mL和β-谷甾醇0.084  mg/ mL的对照品贮备液；精密吸取贮备液1 mL，经70%甲醇稀释20倍，摇匀，即得（11个对照品质量浓度依次为7.80，5.50，3.40，2.10，418.70，609.50，25.80，10.20，4.60，10.50，4.20 µg/mL）。

2.2 供试品溶液的制备

取龙葵粉末约1 g，精密称定，加70%甲醇约20 mL，对龙葵样品超声（功率：250 W，频率：40 kHz）处理45 min，冷却，经提取溶剂定容至25 mL，摇匀，静置，过滤，即得，待HPLC分析。

2.3 色谱条件

采用HPLC法，色谱柱：Hypersil BDS C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长：280 nm检测梣皮树脂醇和松脂素，360 nm检测槲皮素和芦丁，203 nm检测澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇；流动相：0.5%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~11 min，15.0%B；11~18 min，15.0%→35.0%B；18~27 min，35.0%→45.0%B；27~45 min，45.0%→80.0%B；45~54 min，80%B；54~60 min，80.0%→15.0%B）；柱温：30℃，流速：1.0 mL/min，进样量：10 µL[13-14]。

2.4 耐用性试验

取对照品溶液和供试品溶液各10 µL，按“2.3”项下色谱条件下进样测定，记录色谱图，结果基线平稳，供试品溶液中11种成分的保留时间与对照品基本一致，且与相邻色谱峰分离效果良好，分离度均≥1.5，具体见图1。

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  图1 HPLC色谱图

  Figure 1.HPLC chromatogram

  注：A.混合对照品；B.供试品；C.空白溶剂（70%甲醇）；1.梣皮树脂醇；2.松脂素；3.槲皮素；4.芦丁；5.澳洲茄碱；6.澳洲茄边碱；7.客西茄碱；8.澳洲茄胺；9.去半乳糖替告皂苷；10.薯蓣皂苷元；11.β-谷甾醇。

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2.5 线性关系考察

精密吸取“2.1”项下的对照品贮备液，分别用70%甲醇稀释4，10，20，40，100，200倍制成系列浓度标准液，按“2.3”项下色谱条件下进样测定，分别以梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇浓度为横坐标（X，µg/mL），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，并计算回归方程，结果见表2，显示11个成分在相应范围内线性关系良好。

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  表格2 龙葵中11个成分的线性关系

  Table 2.Linear relationship of 11 constituents in Solanum nigrum

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2.6 精密度、稳定性及重复性试验

精密吸取同一供试品溶液（编号：S1），按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，计算得梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇峰面积的RSD依次为1.31%，1.25%，1.52%，1.61%，0.39%，0.23%，1.05%，1.12%，1.41%，1.16%，1.47%（n=6）。

取同一供试品溶液（编号：S1），于制备后每间隔4 h进样，持续检测至24 h，计算得梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇峰面积的RSD依次为1.69%，1.85%，1.97%，1.96%，0.53%，0.47%，1.65%，1.71%，1.98%，1.56%，1.79%（n=7）。

取同批次龙葵样品（编号：S1）6份，分别按“2.2”项下方法制成供试品溶液，再按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算得梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇的平均含量依次为0.156，0.115，0.068，0.041，11.618，18.325，0.730，0.211，0.099，0.241，0.083 mg/g，各成分含量的RSD依次为1.55%，1.49%，1.78%，1.93%，0.64%，0.53%，1.39%，1.58%，1.73%，1.56%，1.82%（n=6）。以上结果表明该方法重复性和精密度良好，龙葵供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

取9份同批次（编号：S1）已知11个成分含量的龙葵细粉，每份约0.5 g，精密称定，按已知各成分含量的80%，100%，120%加入混合对照品溶液（每mL含梣皮树脂醇0.081 mg、松脂素0.054 mg、槲皮素0.036 mg、芦丁0.019 mg、澳洲茄碱5.760 mg、澳洲茄边碱9.172 mg、客西茄碱0.364 mg、澳洲茄胺0.108 mg、去半乳糖替告皂苷0.049 mg、薯蓣皂苷元0.117 mg和β-谷甾醇0.043 mg的溶液），每个水平制备3份，再按“2.2”项下方法制得加样供试品溶液。各精密吸取10 µL进样，结果低、中、高3个浓度水平11个成分的平均加样回收率及RSD分别为梣皮树脂醇98.17%（1.59%），松脂素97.18%（1.40%），槲皮素96.90%（1.36%），芦丁96.81%（0.91%），澳洲茄碱100.04%（0.86%），澳洲茄边碱100.28%（0.72%），客西茄碱99.10%（1.26%），澳洲茄胺99.01%（1.66%），去半乳糖替告皂苷97.74%（1.26%），薯蓣皂苷元98.32%（1.19%），β-谷甾醇97.97%（1.30%）（n=9）。

2.8 样品测定

取不同批号的龙葵样品（S1~S17），分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液（每批平行3份），各精密吸取10 µL测定，代入回归方程，按外标法以峰面积计算样品中梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇的含量，结果见表3。

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  表格3 龙葵中11个组分含量测定结果 (mg/g, n=3)

  Table 3.Determination results of 11 components in Solanum nigrum (mg/g, n=3)

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2.9 化学计量学评价模式的建立

以17批龙葵中梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇的含量数据为变量，借助SIMCA 14.1软件对17×11矩阵数据构建PCA模型（图2）[17]，提取出2个主成分，17批龙葵样品大致分成3组，所有数据点均在95%置信区间内，表明所有检测数据无异常。进一步运行OPLS-DA，结果X轴方向模型累积解释率R²X＝0.999、Y轴方向模型累积解释率R²Y＝0.930、模型预测能力Q²＝0.797，均大于0.5，表明建立的模型稳定可靠、预测能力好（图3和图4）[18-19]。图4显示VIP＞1的组分分别为澳洲茄边碱（VIP=2.173）、澳洲茄碱（VIP =1.773）、去半乳糖替告皂苷（VIP =1.055）和梣皮树脂醇（VIP=1.048），表明上述4个组分对不同产地龙葵质量差异影响显著。

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  图2 17批龙葵样品的PCA得分图

  Figure 2.Score chart of PCA for 17 batches of Solanum nigrum samples

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  图3 17批龙葵样品的OPLS-DA得分图

  Figure 3.Score chart of OPLS-DA for 17 batches of Solanum nigrum samples

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  图4 龙葵中11个成分的VIP图

  Figure 4.VIP images of 11 components in Solanum nigrum

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2.10 熵权-TOPSIS分析法的建立

2.10.1 数据归一化处理

以17批龙葵样品中梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇的含量值为X_bc（b=1，2，3，……，17；c=1，2，3，……，11），组成多指标17×11数据矩阵。由于以上11种成分均为有效成分，根据越大越优型指标公式（1）对17×11矩阵数据进行归一化[20]，11个指标归一化处理结果见表4。

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  表格4 龙葵中11个成分归一化处理结果

  Table 4.The normalization treatment results of 11 components in Solanum nigrum

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2.10.2 加权决策矩阵和最优、最差向量确认

以OPLS-DA中11个成分VIP值为权重，将归一化决策矩阵数据与各成分权重相乘，得加权决策矩阵（表5）[20]。由表可知，11个成分的最优向量（Z⁺）分别为1.048、0.200、0.258、0.187、1.773、2.173、0.621、0.357、1.055、0.432和0.284，最差向量（Z^-）均为0。

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  表格5 龙葵11个组分加权决策矩阵结果

  Table 5.The weighted decision matrix result of 11 components in Solanum nigrum

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2.10.3 贴近度计算及产品质量优劣性评价

在熵权-TOPSIS分析中，相对贴近度（J_b）在[0, 1]之间，数值越接近1，表明被评价样品质量最优。按最优向量欧氏距离计算公式（2）和最差向量欧氏距离计算公式（3）分别计算D_b⁺和D_b^-，再按相对贴近度计算公式（4）计算17批龙葵样品的相对贴近度，并根据对样品质量进行排序（表6） [20]。由表可知，辽宁、吉林和黑龙江产地的龙葵药材的相对贴近度J_b值高于其他产地，提示辽宁、吉林和黑龙江产地的龙葵药材的整体质量较佳。

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  表格6 龙葵药材质量评价结果

  Table 6.Quality evaluation result of Solanum nigrum

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3 讨论

3.1 提取溶剂及方法的选择

本试验提取供试品时，首先对不同溶剂（70%乙醇、乙醇、70%甲醇、甲醇和水）进行对比，结果以70%甲醇为溶剂时，所提取的龙葵样品中梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇的综合提取率较高。选用超声和加热回流的提取方式，结果加热回流时杂质干扰较多，同时超声易操作更便捷。对于提取时间，考察了10，30，45，60 min，结果显示龙葵供试品最佳提取方式为70%甲醇超声提取45 min。

3.2 检测波长的确定

龙葵中待检测成分梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇检测波长主要集中在190~400 nm之间。综合基线平稳情况、色谱峰数量、11个成分色谱峰峰面积等情况，本研究分别采用不同波长进行对比考察后发现，在检测波长为280 nm时[21]，梣皮树脂醇和松脂素有最大吸收；在检测波长为360 nm时[22-23]，槲皮素和芦丁的色谱峰信号响应值较高且色谱峰分离度较好、基线较平；在检测波长为203 nm时[15,24-26]，澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇的色谱峰响应值较大，同时能达到基线分离，色谱峰正常积分。故选择“2.3”项下色谱条件同时检测龙葵中以上11个成分的含量。

3.3 评价结果分析

本试验以8省17批龙葵为检测样品，采用外标法对龙葵所含的梣皮树脂醇、松脂素、槲皮素、芦丁、澳洲茄碱、澳洲茄边碱、客西茄碱、澳洲茄胺、去半乳糖替告皂苷、薯蓣皂苷元和β-谷甾醇等成分进行定量分析，在建立的色谱条件下，11个成分在各自范围内线性关系良好，精密度、稳定性、重复性及回收率结果均符合要求。化学计量学对检测数据进行分析，结果显示各批次间质量差异较大（PCA得分图各批次散点不够集中），OPLS-DA结果显示VIP＞1的组分有4 个，分别为澳洲茄边碱、澳洲茄碱、去半乳糖替告皂苷和梣皮树脂醇，说明这4个成分对不同产地龙葵质量差异影响显著；熵权-TOPSIS法同样显示各批次间龙葵质量差异较大（J_b值在0.170 7~0.744 7之间），其中辽宁、吉林和黑龙江产地的龙葵药材的J_b较高，提示辽宁、吉林和黑龙江产地的龙葵药材的整体质量较佳。

本试验建立的龙葵中11个指标成分HPLC法定量质控模式，方法简便可行、准确性好，为其质量标准提升提供研究基础，化学模式识别联合熵权-TOPSIS法客观全面，可用于龙葵的整体质量评价，为其道地性研究提供数据参考。

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