目的  利用网络药理学方法研究孜亚比提片治疗2型糖尿病（T2DM）的分子机制。

方法  从TCMSP、ETCM、CNKI中得到孜亚比提片化学成分和药物靶点，利用OMIM和GeneCards数据库筛选T2DM的疾病靶点；使用Cytoscape 3.6.1软件构建“药物-成分-靶点网络”筛选出核心成分；运用蛋白质相互作用网络筛选出核心靶点；通过DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。

结 果 研究共收集到孜亚比提片活性成分144个，度值排名靠前的为槲皮素、山柰酚、异鼠李素等。活性成分相关靶点823个，其中与T2DM相关的有700个，包含为SRC、MAPK1、MAPK3等。GO功能分析提示与信号传导、蛋白质磷酸化以及蛋白质结合等分子功能有关。KEGG通路富集分析所涉及的主要信号通路有脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路及HIF-1信号通路等。

结论  孜亚比提片治疗T2DM具有多成分、多靶点、多通路协同干预的特点，其主要由槲皮素、山柰酚、异鼠李素等成分通过作用SRC、MAPK1、MAPK3靶点调控AGE-RAGE信号通路发挥综合治疗作用。

2型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM）是由胰岛素抵抗且伴胰岛β细胞功能缺陷所引起的脂肪、碳水化合物和蛋白质代谢异常，以高血糖为主要特征的内分泌-代谢性疾病[1]。糖尿病患者可出现心血管系统、内分泌系统及神经系统等并发症[2]。现代医学目前主要使用双胍类、磺脲类、胰岛素等药物控制血糖。孜亚比提片由马齿苋子、莴苣子以及天竺黄等12种中药组成，具有调节血糖和改善胰岛素功能的作用，可用于治疗糖尿病[3]。本研究拟通过网络药理学方法研究孜亚比提片治疗对T2DM的潜在分子机制，为其临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 获取孜亚比提片的活性成分及靶点

以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为筛选条件，通过中药系统药理数据库及分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）及中医药百科全书（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/）查询筛选孜亚比提片组成药物的活性成分，并进一步查询CNKI数据库补充其相关活性成分。将上述所得活性成分导入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）数据库预测孜亚比提片活性成分的靶点。

1.2 获取孜亚比提片治疗T2DM交集靶点

在GeneCards（https://www.genecards.org/）、在线人类孟德遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库（网址：https://www.omim.org/）数据库中搜索T2DM候选靶点。利用Venny 2.0作图工具将孜亚比提片活性成分候选靶点与T2DM候选靶点绘制韦恩图，图中交集部分即为孜亚比提片治疗T2DM的靶点。

1.3 构建药物-活性成分-交集靶点网络

将获得的活性成分、交集靶标及孜亚比提片的组成药物输入Cytoscape 3.6.1软件，构建药物-活性成分-交集靶点网络图并进行拓扑参数分析。在网络图中，节点为药物、活性成分和交集靶点；边则为节点间的相互作用关系；度（degree）值表示1个节点在网络中与其他节点连接的数量，degree值越大，表明该节点越重要，将degree排名靠前的活性成分作为核心成分。

1.4 构建PPI网络

将交集靶点导入STRING平台（https://cn. string-db.org/）中，选择“Organism”为“Homo Sapiens”，最小交互打分值设置为0.9，即得蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）结果。将得到的数据导入Cytoscape中，进行可视化处理，最终得到蛋白互作网络图。利用Cytoscape进行网络拓扑参数分析，设置网络节点的degree值为筛选条件，按照降序排列将排名靠前的靶点作为核心靶点[4]。

1.5 GO功能及通路富集分析

借助DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）数据库（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），对孜亚比提片治疗T2DM的靶点即交集靶点进行GO及KEGG富集分析。以count值为筛选条件，将前10个GO条目绘制成条形图。将KEGG分析结果按照P值排名靠前的20条通路构建气泡图，把这20条通路作为核心通路。

2 结果

2.1 筛选孜亚比提片活性成分及靶点

通过TCMSP和ETCM数据库共得到孜亚比提片中药有相关靶点的活性成分144个。从PubChem数据库中获取化学成分的Canonical SMILES结构并导入Swiss Target Prediction数据库，筛选出孜亚比提片144个活性成分的4 897个靶点，删除重复项后得到823个靶点。

2.2 筛选T2DM交集靶点

在GeneCards和OMIM数据库中查到的14 604个靶点作为T2DM的靶点，与孜亚比提片的823个靶点绘制韦恩图，匹配映射得到交集靶点700个，即孜亚比提片144个活性成分主要是通过这些交集靶点而发挥治疗T2DM的作用，结果见图1。

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  图1 孜亚比提片成分靶点-2型糖尿病靶点韦恩图

  Figure 1.The Venn diagram of component target of Ziyabiti tablets-T2DM target

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2.3 药物-活性成分-交集靶点网络分析

将药物、活性成分及交集靶点导入Cytoscape进行网络拓扑参数分析，degree值越大说明活性成分与靶点之间的联系越大，在抗T2DM的过程中贡献越大。degree值排名前10的分别为：槲皮素、山柰酚、异鼠李素、维生素E、芫荽异香豆酮A、花生四烯酸、亚油酸乙酯、己基癸醇、木犀草素以及洋芹脑。药物-活性成分-交集靶点网络结果显示，孜亚比提片治疗T2DM具有多成分、多靶点的作用特点。结果见图2和表1。

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  图2 中药-活性成分-交集靶点网络图

  Figure 2.The network diagram of traditional Chinese medicine-active ingredient-intersection target

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  表格1 孜亚比提片核心成分信息表

  Table 1.Information table of core components of Ziyabiti tablets

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2.4 交集靶点PPI网络分析

将700个交集靶点上传至STRING数据库中构建PPI蛋白互作网络，借助Cytoscape软件进行网络拓扑参数分析。PPI网络中degree值越大、节点越大、颜色越深，表示在网络中占有重要位置。度值排名前10的靶点核心靶点为：SRC、MAPK1、MAPK3、AKT1、HSP90AA1、STAT3、PIK3R1、PIK3CA、RELA、JUN。结果见图3和表2。

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  图3 交集靶点PPI网络图

  Figure 3.The PPI network diagram of intersection target

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  表格2 孜亚比提片核心靶点信息表

  Table 2.Core target information table of Ziyabiti Tablets

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2.5 交集靶点功能通路分析

利用DAVID在线工具对孜亚比提片治疗T2DM的交集靶点进行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析结果显示，孜亚比提片治疗T2DM的生物过程包括1 885种，主要涉及信号传导、蛋白质磷酸化以及蛋白质结合等，这些生物过程均与T2DM的发生、发展有密切的关系。分别筛选GO功能中生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）count值排名前10的条目见图4。KEGG信号通路204条包含脂质与动脉粥样硬化、前列腺癌、糖尿病等并发症中的AGE- RAGE信号通路等，选择P值排名前20的通路作气泡图。结果见图5。

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  图4 GO富集分析条形图

  Figure 4.The bar chart of GO enrichment analysis

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  图5 KEGG通路富集分析气泡图

  Figure 5.The bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

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2.6 中药-成分-靶点-通路网络图

将孜亚比提片中的中药、成分、靶点及核心通路导入Cytoscape中，构建中药-成分-靶点-通路网络图，如图6所示，红色代表中药，紫色代表通路，黄色代表成分，绿色代表靶点。通过对网络进行拓扑参数分析得出，槲皮素、山柰酚、异鼠李素等成分通过作用于SRC、MAPK1、MAPK3等靶点调控动脉粥样硬化、前列腺癌、糖尿病等并发症中的AGE- RAGE等信号通路发挥综合治疗作用。

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  图6 中药-成分-靶点-通路网络图

  Figure 6.the network diagram of traditional Chinese medicine-component-target-pathway

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3 讨论

孜亚比提片与T2DM的“药物-活性成分-交集靶点”网络中筛选出的核心成分包含槲皮素、山柰酚、异鼠李素、维生素E、芫荽异香豆酮A、花生四烯酸、亚油酸乙酯、己基癸醇、木犀草素以及洋芹脑等10个。槲皮素作为黄酮类化合物，能够抑制葡萄糖的吸收、利用，进而发挥抗氧化、降血糖等作用[5-6]。研究显示，槲皮素可通过抑制胰岛B细胞氧化应激及其凋亡而增加胰岛素的分泌，使改善糖尿病患者的糖代谢得以改善[7]。山柰酚能够发挥胰岛细胞保护功能、降血糖以及降血脂等作用而用于预防糖尿病的心血管病变及其并发症的发生[8]。研究显示，山柰酚可以调节血脂和胰岛素，提高T2DM胰岛素的敏感性，有效防治胰岛素抵抗[9-10]。木犀草素能通过与自由基反应，提高机体抗氧化能力，缓解糖尿病患者的氧化应激反应，减轻胰岛细胞的氧化损伤[11-12]。综上，孜亚比提片可通过多成分发挥调节血糖、血脂，提高机体抗氧化能力，从而改善胰岛素抵抗而治疗T2DM。

由PPI网络分析可得dgree值排名前10的靶点：SRC、MAPK1、MAPK3、AKT1、HSP90AA1、STAT3、PIK3R1、PIK3CA、RELA及JUN，提示其在孜亚比提片治疗T2DM过程中至关重要。其中，MAPK是细胞传递应激信号的关键蛋白，参与糖尿病的高糖-蛋白激酶C通路、氧化应激等过程，影响生长因子、糖基化终产物等，亦与其神经病变、血管并发症等慢性并发症的发生息息相关[13]。MAPK参与细胞生长、凋亡过程，动物实验表明，通过抑制MAPK1/3的表达能够改善糖尿病模型大鼠的心肌纤维化，亦提示MAPK1、MAPK3基因在T2DM的病程中发挥重要作用[14]。AKT1为PI3K的下游基因，其可诱导β细胞的增殖分化而维持血糖的稳定；相反，若AKT1缺少则会导致内质网应激及加速β细胞凋亡，导致血糖升高[15]。PIK3R1为PI3K的亚型之一，其可参与多种细胞的生长、增殖分化及凋亡等功能，进而参与糖尿病的发展进程。PI3K作为AKT1的上游基因，通过调控PIK3R1、AKT1的表达及其信号通路，可调节胰岛素分泌而使血糖处于稳定状态，进而起到防治T2DM的作用 [16]。综上，孜亚比提片可通过多成分、多靶点对T2DM起到防治作用。

GO注释结果显示，孜亚比提片防治T2DM主要涉及信号传导、蛋白质磷酸化以及蛋白质结合等。KEGG通路富集分析所涉及的主要信号通路有脂质与动脉粥样硬化、前列腺癌、糖尿病等并发症中的AGE- RAGE信号通路及HIF-1信号通路等。其中AGE-RAGE信号通路在孜亚比提片防治T2DM过程中至关重要。RAGE是一种免疫球蛋白，其配体AGE为非酶促糖基化和蛋白质氧化的产物，在糖尿病组织中蓄积且在高血糖症中可加速形成[17]。通过激活RAGE可促进AGE的生成，进而激活AGE-RAGE信号通路导致细胞应激使细胞功能障碍，导致糖尿病并发症的发生[18]。HIF-1为一种调节蛋白，当机体缺氧、血糖升高时可诱发其过量表达而加重疾病。HIF-1α为HIF-1的亚基，其可激活下游基因而改善缺氧，参与血管生成及细胞凋亡等过程而促进糖尿病的过程及并发症的发生[19]。表明孜亚比提片通过调控T2DM的发生发展过程中多个生物学过程、多条通路，进而缓解T2DM的症状。

网络药理学是系统生物学和多方向药理学融合的产物，能够为复方研究提供新的思路。本研究基于网络药理学对孜亚比提片治疗T2DM的分子机制进行探究，结果显示孜亚比提片通过槲皮素、山柰酚及异鼠李素等活性成分调控SRC、MAPK1、MAPK3以及AKT1等靶点介导AGE-RAGE信号通路、EGFR信号通路等通路发挥治疗T2DM的作用，体现了其多成分、多靶点、多通路的作用特点。本研究为孜亚比提片临床治疗T2DM及其新药的开发奠定一定的理论基础，但由于本研究是基于计算机模拟预测，并未考虑到有效成分在体内的相关药物代谢动力学变化，因此孜亚比提片的分子机制有待进一步深入研究。

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