目的  探索体外受精-胚胎移植技术（IVF-ET）助孕过程中促性腺激素释放激素（GnRH）拮抗剂添加日血黄体生成素（LH）水平对妊娠结局和胚胎质量的影响。

方法  回顾性分析2018年1月至2022年12月于武汉大学中南医院生殖医学中心接受拮抗剂方案常规IVF-ET治疗且预期卵巢正常反应的女性不孕症患者资料，根据其拮抗剂添加日LH水平进行分组，比较各组临床妊娠率、着床率、卵子成熟度、受精率、卵裂率、2原核胚胎比率、D3优质胚胎率、囊胚形成率，并绘制受试者工作特征（ROC）曲线评估LH水平对临床妊娠的预测价值。

结果  研究共纳入188例患者，其拮抗剂添加日LH水平的中位值为3.79（2.48，6.14）mIU/mL。当LH＜2.48 mIU/mL时鲜胚移植的临床妊娠率和着床率均最低（P＜0.05），而LH＞6.14 mIU/mL时则具有最高的临床妊娠率和着床率（P ＜0.01），但各组之间的配子和胚胎发育参数差异无统计学意义（P＞0.05）。ROC曲线下面积为0.678，LH水平对预测临床妊娠具有一定的准确性。

结论  控制性超促排卵过程中LH水平高于6.14 mIU/mL时使用拮抗剂可获得最优的临床妊娠结局。

控制性超促排卵（controlled ovary hyperstimulation，COH）是体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF- ET）技术进行辅助生殖治疗的重要环节[1]。在COH过程中，过早出现的黄体生成素（luteinzing hormone，LH）峰会导致卵泡过早黄素化，使得正常卵子和可利用胚胎数量减少，并可干扰子宫内膜容受性，因此对内源性LH水平的控制非常重要[2]。随着第三代促性腺激素释放激素拮抗剂（gonadotropin releasing hormone antagonist，GnRH-ant）药物（如西曲瑞克）的面世，COH时在卵泡发育的中后阶段应用GnRH-ant以预防早发性LH峰称之为GnRH拮抗剂方案（简称“拮抗剂方案”） [3]。第三代GnRH拮抗剂因其起效快、半衰期短、无组胺释放效应和亲脂性、副作用少等优点，在人类辅助生殖中的应用越来越广泛[4]。虽然LH在卵泡早期发育和晚期成熟过程中具有重要的生理调节作用，但当LH水平不足时亦可影响卵子发育，导致助孕结局不良[5]。因此，寻找给予GnRH-ant的恰当时机是拮抗剂方案实施过程中的关键。然而，目前关于启动GnRH-ant用药的最佳LH阈值尚无定论，且拮抗剂添加日LH水平对配子及胚胎发育是否存在影响，亦缺乏充分的研究数据。为解答上述问题，本研究采用回顾性分析方法，基于接受拮抗剂方案促排卵进行IVF治疗的正常卵巢反应人群，探讨GnRH拮抗剂添加日LH水平对助孕结局及胚胎发育的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

纳入2018年1月至2022年12月在武汉大学中南医院生殖医学中心接受IVF助孕治疗的女性不孕症患者为研究对象，收集其临床资料进行回顾性分析。纳入标准：①根据2019年指南诊断为不孕症且具有实施IVF技术助孕的指证[6]；②年龄＜38岁；③抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）值≥1.0 ng/mL；④ 月经周期 21~35 d；⑤月经周期第2~3 d基础卵泡刺激素（basal follicle-stimulating hormone，bFSH）＜10  mIU/mL；⑥月经周期第2~3 d双侧卵巢基础窦卵泡总数≥6个；⑦采用拮抗剂方案进行控制性超促排卵。排除标准：①因男性因素需行卵胞浆内单精子注射技术助孕；②接受胚胎植入前遗传学检测技术助孕；③患有宫腔粘连、子宫内膜息肉、粘膜下子宫肌瘤、子宫腺肌症或子宫肌瘤影响宫腔形态者；④患有多囊卵巢综合征、糖尿病、甲状腺疾病、肾上腺皮质增生等其他内分泌疾病。本研究获得患者知情同意，并经武汉大学中南医院伦理委员会审查批准（批件号：2020188）。

1.2 方法

1.2.1 研究设计及分组

本研究采用回顾性研究，采集患者的基本信息及临床诊疗数据。所有患者均为首次接受IVF治疗，且采用拮抗剂方案进行控制性超促排卵（具体见“1.2.2临床方案”）。根据开始使用GnRH拮抗剂添加日的LH中位数和四分位数[3.79（2.48，6.14） mIU/mL]为分界点设立4组（A：＜2.48 mIU/mL，B：≥2.48 且＜3.79 mIU/mL，C：≥3.79且＜6.14 mIU/mL，D：≥6.14 mIU/mL），对各组IVF助孕结局参数进行对比分析。

1.2.2 临床方案

具体临床处理流程为：月经周期第2~3 d启动促排卵治疗，给予外源性促性腺激素（gnadotropin，Gn）150~225 IU/d，用药4~5  d后检测血清LH和雌二醇（estrodial，E₂）水平，并行阴道B超监测双侧卵巢发育中的卵泡大小。根据卵泡发育情况调整Gn用量，并以1次 /2  d的频率重复阴道B超和血清LH、E₂及孕酮（progesterone，P）水平检测，必要时次日可复查。拮抗剂的使用采用灵活方案[7]，即出现以下任一情况：①优势卵泡直径＞14 mm；②优势卵泡直径＞12 mm且血清E₂＞300 pg/ mL；③LH＞10  mIU/ mL，和（或）优势卵泡平均直径＞12 mm，和（或）血清E₂＞300  pg/ mL，则给予GnRH拮抗剂以预防过早出现LH峰。GnRH拮抗剂选择醋酸西曲瑞克（瑞士默克雪兰诺公司，规格：0.25  mg）0.25 mg，ih，qd。当优势卵泡至少1个直径≥18  mm，或2个直径≥17  mm，或3个直径≥16 mm时，给予绒促性素（中国丽珠医药，规格：2000 IU）10  000  IU，im，36  h后经阴道B超引导下穿刺取卵进行体外受精和体外培养。血清激素测定均采用化学发光法（瑞士罗氏公司，型号：cobas e411），B超监测均固定由两位资深主治医师实施。取卵当日计为d₀天并给予黄体支持，选择1~2枚d₃天卵裂期胚胎或d₅天囊胚期胚胎进行移植。卵裂期胚胎移植后14 d或囊胚期胚胎移植后12 d查血HCG值判断是否妊娠，若妊娠则间隔2周进行阴道B超检查，观察到孕囊则确定为临床妊娠。

1.3 观察指标

根据2018年中华医学会生殖医学分会颁布的关于人类辅助生殖技术临床关键指标及胚胎实验室数据质控的专家共识[8-9]确定主要和次要观察指标。

1.3.1 主要观察指标

以临床妊娠率及着床率作为主要临床观察指标。

1.3.2 次要观察指标

分析各组卵子成熟度、受精率、卵裂率、2原核（2 pronuclear，2PN）胚胎比率、D3优质胚胎率、囊胚形成率，作为配子及胚胎质量评估指标。此外，分析流产率作为不良妊娠结局评估指标。2PN胚胎比率（%）=2PN胚胎数 /（1PN+2PN+≥3PN+0PN晚期卵裂）胚胎总数 ×100%，PN观察时间为受精后16~20 h，0PN晚期卵裂是指正常观察原核的时间点未观察到原核出现，但后期发生了胚胎的卵裂，亦计为受精。

1.4 统计学分析

采用SPSS 16.0 和Graphpad Prism 6.04进行统计和作图；计量资料以或M（P₂₅， P₇₅）表示，两组间比较采用t检验或 Mann-Whitney U检验、多组间比较采用方差分析或 Kruskal-Wallis检验；计数资料以n（%）表示，组间比较采用卡方检验；Pearson相关性分析评估因变量与自变量之间的相关性，受试者工作特征（receive operating characteristic，ROC）曲线下面积评估变量对结局的预测价值，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

研究共纳入188例女性不孕症患者，患者拮抗剂添加日的血LH中位值为3.79（2.48，6.14） mIU/ mL。A、B、C、D四组间平均年龄、不孕年限、体重指数、窦卵泡数、AMH值、基础FSH值、Gn总量、Gn天数、扳机日E₂、扳机日P、扳机日子宫内膜厚度差异均无统计学意义（P＞0.05）；4组间扳机日LH水平间差异有统计学意义（P＜0.05）。具体见表1。

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  表格1 给予拮抗剂添加日不同LH水平区间患者的基础临床资料

  Table 1.Basic information of patients in different LH level intervals on the day of antagonist administration

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2.2 临床助孕结局的分析

以临床妊娠率、着床率作为患者助孕成功的评价指标，以卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）发生率和流产率作为并发症及不良妊娠结局的评价指标，结果见表2。随着拮抗剂添加日LH水平区间的升高，各组临床妊娠率依次升高（P＜0.05）。其中，C组及D组均较A组显著升高（P＜0.05）；D组较B组显著升高（P＜0.05）。各组间着床率差异亦有统计学意义（P＜0.05），与临床妊娠率的变化趋势相似且更加明显。C、D组均较A、B组着床率有显著升高（P＜0.05）。此外，所有患者均未出现卵巢过度刺激综合征；尽管B组流产率的绝对值明显较其他组低，但各组间流产率差异无统计学意义（P＞0.05）。

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  表格2 给予拮抗剂添加日不同LH水平区间患者的临床助孕结局情况（%）

  Table 2.Clinical outcomes of assisted conception in patients with different LH level intervals on the day of antagonist administration (%)

  注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05。

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2.3 配子及胚胎发育情况的分析

拮抗剂添加日不同LH水平区间的患者，其卵子成熟度、受精率、卵裂率、正常受精率、正常受精胚胎卵裂率、D3优质胚胎率、囊胚形成率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

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  表格3 给予拮抗剂添加日不同LH水平区间患者的配子及胚胎情况（, %）

  Table 3.Information of gametes and embryos in patients with different LH level intervals on the day of antagonist administration (, %)

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2.4 拮抗剂添加日LH水平与临床助孕结局的关系及预测价值

采用Pearson相关性分析评估拮抗剂添加日LH水平与临床妊娠之间的关系，结果显示两者存在一定相关性且具有统计学意义（r=0.193，P=0.008）。采用ROC曲线下面积评价拮抗剂添加日LH水平对临床妊娠的预测价值，结果为0.678，提示其具有一定的意义（图1）。

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  图1 利用ROC曲线下面积评估拮抗剂添加日LH水平对临床妊娠的预测价值

  Figure 1.Assessment of the prognostic value of LH levels on the day of antagonist administration for predicting clinical pregnancy by using the area under the ROC curve

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3 讨论

IVF-ET及其衍生技术俗称“试管婴儿”技术，自1978年问世以来，该技术已得到了长足的进步，未来的发展方向聚焦于在更加安全、经济、个性化的前提下进一步提升助孕成功率。为了获得足够的成熟卵子和可利用胚胎，在IVF-ET实施过程中往往需要进行超促排卵。传统的COH方案存在一些不足，如长方案需使用GnRH类似物降调节，用药时间长、Gn用量大，有研究认为Gn量越大卵子染色体异常的发生率越高，且OHSS等并发症的发生率亦升高[10-11]；而短方案虽用药时间短，但卵泡发育速度不同，尤其是在卵泡发育成熟前若过早出现LH峰，则可能损害卵子质量和内膜容受性，导致助孕失败 [12]。随着第三代GnRH拮抗剂的出现，为解决上述问题提供了新的思路。与传统方案相比，拮抗剂方案不会对下丘脑和垂体造成深度抑制，用药时间短，Gn用量少，OHSS并发症发生率低，可灵活快速地抑制早发性LH峰，因其半衰期仅48 h左右，抑制作用消除快，仍可进行新鲜胚胎移植[13]。这些优点使得拮抗剂方案迅速被人们所接受，在卵巢反应低、中、高人群中均有广泛应用[14-15]。

但LH激素具有“双刃剑”的作用。卵泡膜细胞、晚卵泡期的颗粒细胞和子宫内膜细胞表面均存在LH受体。早卵泡期（直径＜10~12 mm）的卵泡膜细胞在LH的作用下合成雄激素，为雌激素生成提供底物，雌激素则可以诱导卵泡颗粒细胞FSH受体的表达，因此卵泡的早期发育和激素合成需要一定水平的LH[16]。当LH峰超过了优势卵泡的上限值时，颗粒细胞的分裂被抑制，优势卵泡停止发育并发生黄素化[2]。由于人群的个体化差异，LH的理想阈值并无定论。如何寻找恰当的LH阈值以指导GnRH-ant的给药节点成为本领域关注的重要科学问题。

一项研究对567名接受辅助生殖治疗的患者进行回顾性分析发现，当LH峰值＜4 IU/L时不使用拮抗剂可获得更高的临床妊娠率和持续妊娠率，但以LH 4 IU/L作为阈值进行分组，使用拮抗剂并未改变不同LH区间患者的临床和胚胎参数[17]。该研究对象的纳入范围较宽泛，未对预期卵巢正常反应、低反应、高反应人群进行进一步的分层，且主要是基于日常经验以LH 4IU/L作为分组阈值。其后的一项研究中，研究者将试验对象限定为预期卵巢正常反应人群，仍以LH峰值4 IU/L为界进行分组，发现低LH组的Gn使用总量显著增加，且新鲜移植周期的活产率、临床妊娠率显著降低，早期妊娠丢失率升高，且鲜胚移植是导致累积妊娠率下降的独立风险因素 [18]。以上研究为拮抗剂方案的临床应用具有积极的借鉴意义，但仍存在以下问题：一是未排除男性因素对妊娠结局的影响；二是分组阈值的选择欠缺更充分的客观依据；三是仅对D3卵裂期胚胎参数进行评估，而分化期的囊胚参数较卵裂期更能反映胚胎质量和发育潜能。

因此，本研究制定了更严格的纳入标准，对预期卵巢正常反应且仅接受常规IVF-ET的首次辅助生殖助孕患者进行研究，而且所有研究对象均进行了鲜胚移植。这样就能够充分排除卵巢功能差异、男性不育因素造成的影响。此外，为了在指导拮抗剂的使用时机上更具有实操性，收集拮抗剂使用首日的LH水平数值，并根据其四分位数值划分为4组，对其临床结局参数和胚胎发育参数进行了更细化地统计分析。结果显示，当拮抗剂使用首日LH＜2.48 mIU/mL时，鲜胚移植的临床妊娠率和着床率均最低，且随着LH水平区间的升高，临床妊娠率逐渐升高，当LH水平高于3.79 mIU/mL时，其着床率显著高于低LH水平的亚组，而LH＞6.14 mIU/mL时则具有最高的临床妊娠率和着床率，差异有显著的统计学意义。这种变化趋势也在LH水平与临床妊娠率的相关性分析上得到了验证。而根据各组间卵子成熟度、受精、卵裂、正常受精胚胎比率、D3优质胚胎率和囊胚形成率的分析结果，本研究提示，拮抗剂添加日LH水平的高低对上述配子和胚胎发育参数并无显著影响。既往的Meta分析提示板机日测量的子宫内膜厚度可能与IVF-ET的临床妊娠结局具有相关性[19]，为排除这一影响，本研究对板机日各组间子宫内膜厚度进行了比较，结果发现差异无统计学意义，且各组间的拮抗剂使用天数及总量、扳机日E₂、P水平差异亦无统计学意义，虽然扳机日LH组间有统计学差异，但局限于A、D组之间，最高值（8.26 mIU/mL）未超过扳机日LH正常范围，不足以形成LH峰并影响妊娠结局，因而考虑扳机日LH组间差异与拮抗剂添加日的LH基线有关。本研究亦存在一些不足：为了探讨拮抗剂添加日LH水平对临床妊娠的预测价值，本研究绘制的ROC曲线显示LH水平具有一定的预测准确性，但效能较弱（曲线下面积为0.678）；另外，本研究对胚胎质量的评估主要是基于形态学观察，未进行胚胎遗传学状态的分子检测。在后续研究中，通过增加样本量，纳入遗传学检测或Time-lapse胚胎动力学评分系统[20]，进一步完善研究。

综上，本研究证实了拮抗剂添加日LH水平会影响临床妊娠率和着床率，且与配子和胚胎质量无关。此外，还对拮抗剂添加日的LH水平给出了更加细化的参考数据，除3.79  mIU/ mL（约4.0  mIU/mL）外，还提出2.48 mIU/mL（约2.5  mIU/ mL）和6.14 mIU/mL（约6.0 mIU/ mL）两个亚组阈值，是现有研究的有利验证和补充，并为拮抗剂方案的临床实施提供了更具有实操性的新经验。

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