目的  探讨芹菜素对高血糖肾小管上皮细胞（HK-2）的保护作用及其潜在机制。

方法  将HK-2细胞与D-葡萄糖孵育，建立体外糖尿病肾病模型。评估细胞活力、细胞凋亡和氧化应激水平。实时荧光定量PCR（q-PCR）测定核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶-1（HO-1）和Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）的mRNA水平。进行Western blot以测定Nrf2的蛋白表达水平。

结果  在HK-2 细胞中，高糖以浓度和时间依赖的方式降低细胞活力。芹菜素提高了高糖胁迫下HK-2细胞活力，降低了高糖胁迫下HK-2细胞凋亡率和促炎细胞因子的产生且抑制了氧化应激水平。芹菜素增加Nrf2和HO-1的mRNA表达以及Nrf2蛋白表达，降低了Keap1的mRNA水平。使用siRNA抑制Nrf2，减弱了芹菜素对高糖胁迫下的HK-2细胞的保护作用。

结论  芹菜素治疗可减轻高糖胁迫下的HK-2细胞损伤，并可通过Keap1-Nrf2-ARE途径发挥抗氧化和抗炎作用。

糖尿病肾病是因为糖尿病的微血管病变而导致的一种并发症，同时也是导致慢性肾脏病和肾功能衰竭的重要因素[1]。糖尿病肾病的发病机理尚未完全阐明，高血糖目前被认为是一个驱动因素[2]。近年来，虽然通过控制血糖、血压和降脂等手段，使糖尿病肾病的病情有所改善，但其预防和治疗作用仍十分有限，开发相关的药物具有重要意义。

氧化应激可引起胰岛β细胞损伤，是糖尿病发病的关键原因之一[3]。氧化应激也会影响与肾脏代谢相关的细胞信号转导途径，进而引起血流动力学及肾功能的恶化[4]，高血糖通过多种机制促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，从而加重氧化应激[5]。在机体处于氧化应激状态时，核转录因子红系2相关因子（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）会与Kelch样ECH相关蛋白1（epoxy chloropropane Kelch sample related protein-1，Keap1）解偶联，Nrf2磷酸化之后，会转移到核中，并与抗氧化反应因子（antioxidant response element，ARE）上的相应位点结合，进而启动ARE调节的下游Ⅱ相解毒酶以和抗氧化蛋白基因的表达，从而增强细胞抗氧化应激的能力[6]。前期研究发现，Keap1-Nrf2-ARE 信号通路的活化能够有效抑制糖代谢异常所致的氧化应激损伤，从而起到抗氧化的作用，提示 Keap1-Nrf2-ARE 信号通路在其中发挥着重要的作用[7]。

芹菜素，别名芹黄素，为一种黄酮，在温热带的蔬菜和水果中广泛分布，尤其在芹菜中有很高的含量。芹菜素具有较好的抗氧化、抗炎等生物活性，还可以抑制细胞的凋亡[8-9]。研究表明，芹菜素对顺铂化疗所致肾损伤小鼠具有保护作用，其机制可能与芹菜素激活Nrf2/HO-1通路，抑制氧化应激损伤、炎症和凋亡有关[10-11]。然而，芹菜素对糖尿病肾病的影响机制并不清楚。本研究构建体外糖尿病肾病模型，研究了芹菜素对高糖诱导的细胞活力、凋亡和氧化应激的保护活性，并评估了其潜在机制，以期为糖尿病肾病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

主要仪器包括：酶标仪（iMark，Bio-Rad）、FACScan流式细胞仪（BD Biosciences）。

1.2 细胞

HK-2细胞购自中国科学院（上海）细胞库，培养在含有10％胎牛血清（FBS）、1%青链霉素混合液的DMEM低糖培养基中，放置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。

1.3 主要试剂

芹菜素（纯度≥98%，货号：HK-QCS）购自陕西慧科植物开发有限公司；D-葡萄糖（纯度≥98%，货号：HY-B0389）购自MedChemExpress；FBS（货号：10099）和低糖DMEM（货号：10567014）购自Gibco；1%青链霉素混合液（货号：V900929）购自Sigma-Aldrich；超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（货号：A001-3-2）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（货号：A003-1）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（货号：A007-1-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）测定试剂盒（货号：H052）、白细胞介素-6（IL-6）测定测试盒（货号：H007）、白细胞介素-1β（IL-1β）测定试剂盒（货号：H002）购自南京建成生物工程研究所；一抗兔抗 Nrf2（货号：ab92946）、鼠抗β-actin（货号：ab8226）购自英国Abcam公司。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（货号：C1062M）购自碧云天公司。Lipofectamine™ 2000转染试剂盒（货号：11668500）购自赛默飞世尔科技公司。CCK-8试剂盒（货号：CK04）购自同仁化学。RT-PCR试剂盒（货号：RR014A）和逆转录试剂盒（货号：RR037Q）购自TaKaRa。Trizol裂解液（货号：R0016）购自碧云天。ECL化学发光液试剂盒（货号：1606902）购自Millipore公司。

1.4 方法

1.4.1 实验条件确定

本实验研究了不同浓度D-葡萄糖（5.5、10、15、20、25、30、40 mmol/L）孵育72 h对 HK-2 细胞活力的影响，以确定合适的葡萄糖浓度（同组浓度葡糖糖培养基利用甘露醇调整成渗透压相同的不同糖浓度的培养基）。用合适的葡萄糖浓度将HK-2细胞孵育6、12、24、48、72 h，以确定合适的孵育时间。在合适的葡萄糖浓度与孵育时间下，研究了不同剂量芹菜素（10、50、100、200、400 μmol/L）对 HK-2细胞活力的影响，以确定合适的芹菜素剂量。

1.4.2 细胞分组

HK-2 细胞覆盖率达到80%后，将细胞随机分为4组：对照组（5.5 mmol/L D-葡萄糖）、高糖组（30 mmol/L D-葡萄糖）和芹菜素组（30 mmol/L D-葡萄糖和100或200 μmol/L芹菜素），孵育48 h后，收集细胞和培养上清液进行进一步实验。

1.4.3 细胞活性测定

HK-2细胞以2×104 个/mL的密度接种于96孔板，每孔100 μL培养基。48 h后，每个孔中加入CCK-8溶液（10 μL），37 ℃孵育2 h。用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度。

1.4.4 细胞凋亡试验

HK-2细胞用30 mmol/L葡萄糖和芹菜素（100，200 μmol/L）孵育48 h，然后收集细胞，用冷PBS洗涤2次，用200 μL 1×Binding缓冲液（含5 μL Annexin V-fitc和5 μL PI）在暗环境中孵育15 min。最后使用FACScan流式细胞仪分析细胞凋亡，并使用CELLQuest软件（BD Biosciences）分析数据。

1.4.5 MDA、SOD、CAT测定

收集HK-2细胞，提取蛋白。用酶标仪在 532 nm 吸光度处测定MDA含量，在 520 nm 吸光度处测定SOD含量，在 240 nm 吸光度处测定CAT含量。

1.4.6 促炎细胞因子测定

采用ELISA法检测促炎细胞因子TNF-α、IL^-1β和IL-6的水平。用酶标仪在450 nm吸光度处测定吸光度。根据各组建立的标准曲线，测定TNF-α、IL^-1β、IL-6 的浓度。

1.4.7 Nrf2 siRNA 细胞转染

Nrf2 siRNA由GenePharma公司合成。引物如下：正向：5'-CGUGAAUCCCAAUGUGAAATT-3'，反向：5'-UUUCACAUUGGGAUUCACGTT-3'。将HK-2细胞在24孔板中铺板后，加入1 000 μL转染复合物溶液（含有0.5 μg Nrf2或对照 siRNA 质粒）后在37 ℃下温育8 h后，细胞在完全培养基中再温育48 h。将细胞分为5组：对照组（5.5 mmol/L D-葡萄糖），高糖组（30 mmol/L D-葡萄糖），芹菜素组（30 mmol/L D-葡萄糖+200 μmol/L芹菜素），Nrf2 SiRNA组（30 mmol/L D-葡萄糖+Nrf2 SiRNA），芹菜素+Nrf2 SiRNA组（30 mmol/L D-葡萄糖+200 μmol/L芹菜素+Nrf2 SiRNA）。孵育48 h后，收集细胞和培养上清液进行进一步实验。

1.4.8 Western blot

用预冷PBS冲洗细胞，RIPA裂解液提取蛋白质，然后用BCA法测定蛋白浓度。取等质量蛋白样品，100 ℃变性5 min后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离并转移至聚偏二氟乙烯膜，在4 ℃条件下加入Nrf2和β-actin一抗（1 ∶  1 000稀释）并4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，加入二抗（1 ∶ 10 000稀释）室温孵育1 h，TBST洗3次。加入ECL化学发光液曝光显影后用ImageJ软件分析条带灰度值。

1.4.9 q-PCR

收集细胞，加入Trizol裂解液裂解，提取裂解后细胞和组织中总RNA，提取步骤按照试剂盒说明书进行。根据逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA。本实验中所使用引物由生工生物合成，瞬时离心各引物（引物序列见表1），在引物中加入去离子水并制成100 μmol/ L的液体，稀释引物终浓度为10 μmol/L。按照以下条件扩增引物，预变性95 ℃ 6 min；变性95 ℃ 10 s；退火60 ℃ 60 s；延伸 72 ℃ 10 s；共45个循环。采用2-△△CT法分析表达量。

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  表格1 表 1 引物序列

  Table 1.Primer sequences

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1.5 统计学分析

使用SPSS 13.0对实验数据进行分析，数据以表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），多组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D-葡萄糖降低HK-2细胞活力

将HK-2细胞与不同浓度的D-葡萄糖（5.5，10，15，20，25，30，40 mmol/L）孵育72 h，以确定合适的葡萄糖浓度，建立体外模拟高血糖诱导肾小管上皮细胞损伤的糖尿病肾病模型。CCK-8实验显示D-葡萄糖浓度依赖性降低细胞活力（图1A）。D-葡萄糖在浓度为30和40 mmol/L时，对HK-2细胞活性的抑制最为显著，由于30与40 mmol/L浓度的细胞活性无显著差异（P＞0.05），因此，选择D-葡萄糖浓度为30  mmol/L做后续实验。然后用 30 mmol/L D-葡萄糖孵育HK-2 细胞 6、12、24、48和72 h，随着时间的增加，细胞活力逐渐下降，48 和 72 h差异显著（图1B）。由于48 h和 72 h时的细胞活性无显著差异（P＞0.05），因此，选择孵育48 h做后续实验。

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  图1 D-葡萄糖对HK-2细胞活力的影响

  Figure 1.Effect of D-glucose on the viability of HK-2 cells

  注：A. HK-2细胞在不同浓度D-葡萄糖的DMEM中培养72 h的细胞活性；B. 在30 mmol/L D-葡萄糖的DMEM中培养不同时间的HK-2细胞细胞活性。图A中与5.5 mmol/L D-葡萄糖组比，aP＜0.05；图B中与0 h组比，aP＜0.05。

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2.2 芹菜素提高高糖胁迫下HK-2细胞的存活率，减少细胞凋亡

本实验研究了不同剂量芹菜素（10、50、100、200、400 μmol/L）对HK-2细胞活力的影响。结果表明，在10~100 μmol/L范围内，芹菜素在48 h内对细胞增殖影响不大，而在200和400 μmol/L范围内，芹菜素显著降低了细胞活力（图2A）。因此，选择在100 μmol/L和200 μmol/L下使用芹菜素进行进一步实验。

分别用30 mmol/L D-葡萄糖和30 mmol/L D-葡萄糖+芹菜素（100、200 μmol/L）共培养48 h，研究芹菜素对高糖条件下HK-2细胞的影响。结果表明，芹菜素（100和200 μmol/L）显著缓解高糖胁迫下HK-2细胞活力下降（P ＜0.05）（图2B）。

用Annexin V/PI染色细胞，检测细胞凋亡率，探讨细胞活力降低是否与细胞凋亡有关。结果显示，高糖胁迫显著增加HK-2细胞凋亡率（早凋与晚凋之和），100和200 μmol/L芹菜素显著降低凋亡率（图2C-2D）。

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  图2 芹菜素对高糖条件下HK-2细胞活力与细胞凋亡的影响

  Figure 2.Effect of apigenin on the viability and apoptosis of HK-2 cells under high glucose condition

  注：A. 不同浓度的芹菜素处理HK-2细胞48 h时的细胞活性；B. 30 mol/L含或不含芹菜素的D-葡萄糖处理HK-2细胞48 h时的细胞活性；C.  annexin V-FITC和PI双染色检测细胞凋亡；D. 芹菜素可减弱高糖诱导的细胞凋亡率升高。图A中与0 μmol/L组比，aP＜0.05；图B、D中与对照组比较，aP＜0.05；与高糖组比较，bP＜0.05。

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2.3 芹菜素抑制高糖胁迫下HK-2细胞的氧化应激和炎症反应

研究测定了细胞内氧化应激指标，研究芹菜素对氧化应激的影响。高糖显著增加HK-2细胞中MDA含量，降低SOD和CAT活性，但经芹菜素处理后可缓解（P＜0.05）（图3A-2C）。采用ELISA法测定上清液中TNF-α、IL^-1β和IL-6的含量，研究芹菜素是否调节高糖诱导的HK-2细胞的炎症反应，。结果显示，芹菜素显著抑制30 mmol/L D-葡萄糖诱导的HK-2细胞培养上清中TNF-α、IL^-1β和IL-6的升高（P＜0.05）（图3D-3F）。

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  图3 芹菜素对高糖条件下HK-2细胞氧化应激和炎症因子的影响

  Figure 3.Effects of apigenin on oxidative stress and inflammatory factors in HK-2 cells under high glucose condition

  注：将HK-2细胞与30 mmol/L D-葡萄糖和芹菜素孵育48 h。芹菜素降低细胞内MDA (A)，升高SOD (B)和CAT (C)水平。ELISA检测促炎细胞因子的产生，芹菜素降低30 mmol/L D-葡萄糖HK-2细胞上清培养基中TNF-α (D)、IL-1β (E)和IL-6 (F)的含量。与对照组比较，a P＜0.05；与高糖组比较，b P＜0.05。

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2.4 芹菜素激活高糖胁迫下HK-2细胞Keap1-Nrf2-ARE通路

通过RT-PCR和Western blot检测Nrf2、HO-1和Keap1的表达，探讨芹菜素抑制氧化应激的分子机制。结果显示，芹菜素处理可显著提高高糖胁迫下HK-2 细胞中 Nrf2 mRNA和蛋白的表达（P＜0.05）（图4A-3C），芹菜素也增加了HO-1 的 mRNA表达（图4D），降低了Keap1的 mRNA表达P＜0.05（图4E）。

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  图4 芹菜素对高糖条件下HK-2细胞的Keap1-Nrf2-ARE信号通路的影响

  Figure 4.Effect of apigenin on Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway in HK-2 cells under high glucose condition

  注：加或不加芹菜素的30 mmol/L D-葡萄糖处理HK-2细胞48 h。A. Western blot结果显示，芹菜素增强了HK-2细胞Nrf2蛋白的表达；B. Nrf2与β-actin灰度值比值；C-E.qRT-PCR结果显示，芹菜素增强了HK-2细胞Nrf2、HO-1、Keap1 mRNA的表达。与高糖组比较，aP＜0.05。

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2.5 芹菜素通过 Nrf2途径保护高糖胁迫下HK-2细胞损伤

为研究Nrf2是否介导芹菜素对高糖胁迫下HK-2的保护作用，将Nrf2 siRNA转染HK-2细胞48 h，然后用D-葡萄糖（30 mmol/L）和芹菜素（200 μmol/L）培养48 h。采用Western blot法测定HK-2细胞中 Nrf2蛋白水平。结果显示，在芹菜素处理后，Nrf2下调后，HG-2 细胞 Nrf2蛋白表达显著降低（降低率58%）（图5A, 4B）。

本实验分析了 Nrf2在细胞活力、氧化应激和炎症细胞因子产生中的作用。与D-葡萄糖和芹菜素处理的HK-2细胞相比，转染 Nrf2 siRNA的细胞存活率明显降低（图5C），MDA含量升高（图5D），上清液TNF-α水平升高（图5E）。表明Nrf2在芹菜素保护高糖胁迫下HK-2细胞中的机制中起着关键作用。

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  图5 Nrf2介导芹菜素对高糖诱导损伤的保护作用

  Figure 5.Nrf2 mediates the protective effect of apigenin against high glucose-induced injury

  注：A. Western blotting检测HK-2细胞中Nrf2的蛋白水平；B. Nrf2 siRNA可逆转apigenin对Nrf2蛋白的升高；C-E.Nrf2 siRNA逆转了芹菜素增加细胞活力、降低上清TNF-α和MDA。与对照组比较，aP＜0.05；与高糖组比较，ns P＞0.05，bP＜0.05；与芹菜素组比较，cP<0.05。

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3 讨论

糖尿病肾病是导致终末期肾功能衰竭的主要病因。糖尿病肾病患者的全因死亡率、心血管死亡率和肾功能衰竭的风险显著升高[12]。已有研究表明芹菜素对肾脏疾病有保护作用，芹菜素通过减少p53 激活和促进 HK-2 细胞中 PI3K/Akt 通路来改善顺铂诱导的细胞凋亡[13]。有研究表明，芹菜素通过抑制氧化应激和纤维化改善大鼠糖尿病肾病[14]。然而，芹菜素在高糖损伤HK-2细胞中的作用尚不清楚。本研究发现芹菜素可减轻高糖胁迫下HK-2细胞损伤，并证明 Nrf2介导其发挥保护作用。

氧化应激、细胞凋亡及炎症反应在糖尿病肾病高血糖损伤中起着关键作用[15]。持续高血糖增加ROS、MDA的产生，导致细胞损伤[16]。SOD和CAT是机体重要的抗氧化防御系统，有研究表明，与健康大鼠相比，糖尿病大鼠中SOD和CAT的表达明显降低[17]。因此，MDA、SOD和CAT是检测糖尿病肾病中氧化应激的3个生物标志物。本研究中，HK-2细胞在高糖胁迫下，细胞活力降低，氧化应激增强，细胞上清中MDA升高，SOD和CAT水平降低，说明本实验成功建立高糖引起的肾脏细胞损伤模型。此外，芹菜素可提高高糖胁迫下HK-2细胞活力，抑制氧化应激，这与既往报道的芹菜素可减轻高脂饮食和缺血再灌注引起的肾损伤一致[18-19]。这证明，芹菜素在高糖引起的肾脏细胞氧化损伤中也有良好的抗氧化作用。

TNF-α属于一种多效的炎症性细胞因子，其可刺激肾系膜细胞产生氧自由基，从而对基底膜造成损伤，还可以促进炎症细胞聚集与黏附，使微血管扩张，通透性增加，从而引发炎症反应，参与肾小球组织损伤[20]。IL-1β能够增强胰岛β细胞中的NO的生成以及细胞的凋亡，从而对β细胞进行选择性的破坏，导致胰岛素抵抗的发生，从而使肾脏的损伤程度变得更加严重[21]。IL-6 可以激活中性粒细胞，让其在炎症部位聚集，从而释放出大量的酶和氧自由基，进而促进氧化代谢物快速增多，加剧肾脏组织及内皮细胞损伤[22-23]。本实验中，芹菜素显著抑制高糖胁迫下的 HK-2 细胞培养上清中 TNF-α、IL-1β和IL-6的升高，这一结果表明，芹菜素能抑制 HK-2细胞中高糖诱导的炎症反应。

研究表明，Keap1-Nrf2-ARE 信号通路的活化，可能对糖代谢紊乱所致的氧化应激反应起到保护作用[24]。Cheng等[25]研究表明，阻断Keap1-Nrf2-ARE信号通路可导致内皮细胞功能障碍，胰岛素抵抗及血管新生障碍，这提示Keap1-Nrf2-ARE通路在糖尿病中具有重要的调控作用。Nrf2是一个重要的因子，能够防止糖尿病并发症的发生，并在糖尿病肾病的发病过程中发挥双重作用。一方面，Nrf2的抑制能够改善糖尿病小鼠模型的高血压和肾脏损伤；另一方面，Nrf2 的活化对于糖尿病性肾病具有保护作用[26-27]。本研究表明，芹菜素在高糖条件下HK-2细胞中激活 Nrf2 及其下游抗氧化反应基因 HO-1，且降低了Keap1的 mRNA表达，这表明在高糖条件下 HK-2 细胞中添加的芹菜素可以作为一种新的 Nrf2 激活剂，是否还有其他受芹菜素调控的上游和下游分子有待进一步研究。除此之外，与单独使用芹菜素治疗高糖胁迫下的 HK-2 相比，使用芹菜素和 Nrf2 siRNA 的高糖胁迫下的 HK-2 细胞活性降低、促炎细胞因子的产生增加、氧化水平升高，这说明 Nrf2 介导芹菜素对高糖胁迫HK-2细胞损伤的保护作用。

综上所述，芹菜素治疗可减轻高糖胁迫下的HK-2细胞损伤，发挥抗氧化和抗炎作用，其机制可能与Keap1-Nrf2-ARE途径有关。本研究为应用芹菜素防治糖尿病肾病的相关研究提供理论依据及试验基础，并完善了芹菜素的药理作用分子机制。

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