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目的 探讨积雪草酸（AA）通过调节磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路对七氟烷（SEVO）诱导的HT-22细胞凋亡的影响。
方法 使用不同浓度（0、5、10、15、20、30 μmol/L）AA处理七氟烷诱导HT-22细胞24 h，CCK-8检测HT-22细胞活力；将HT-22细胞分为对照（Control）组、七氟烷（SEVO）组、AA低浓度（AA-L，10 μmol/L）组、AA中浓度（AA-M，15 μmol/L）组、AA高浓度（AA-H，20 μmol/L）组和AA高浓度+PI13K通路抑制剂LY294002（AA-H+LY294002，20 μmol/L AA+5 μmol/L LY294002）组。显微镜下观察各组细胞形态变化，ELISA检测炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）及氧化应激指标超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）水平，活性氧（ROS）试剂盒检测ROS水平，TUNEL试剂盒检测HT-22凋亡，JC-1法检测线粒体膜电位，三磷酸腺苷（ATP）含量检测试剂盒检测ATP含量，Western blot检测B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白表达。
结果 与0 μmol/L相比，5~30 μmol/L AA处理的HT-22细胞活力呈浓度依赖性升高（P＜0.05），选择浓度为10、15、20 μmol/ L的AA用于后续实验。与SEVO组相比，AA-L组、AA-M组和AA-H组TNF-α、IL-6、MDA和ROS水平、细胞凋亡率、Bax和Caspase-3蛋白表达降低，SOD和GSH- Px水平、红/绿JC-1荧光比、ATP含量、Bcl-2蛋白表达、PI3K和AKT磷酸化水平增加（P＜ 0.05），且呈浓度依赖性。LY294002可逆转AA对七氟烷诱导的HT-22细胞损伤的保护作用（P ＜0.05）。
结论 AA通过激活PI3K/AKT信号通路保护七氟烷诱导的HT-22细胞损伤，为新型减轻七氟烷诱导的神经毒性的药物开发提供了一定的理论参考。
七氟烷（sevoflurane，SEVO）因具有麻醉效果好、苏醒快、不良反应少、气道刺激性小等优点被广泛用作儿科镇静和麻醉的诱导剂，但长期使用七氟烷具有神经毒性，可导致细胞凋亡、神经炎症，甚至会损伤神经认知功能[1]。积雪草酸（asiatic acid，AA）是一种天然的五环三萜类化合物，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化作用，可防止神经毒性和神经变性，保护神经系统[2]。研究表明AA能减轻SEVO诱导的新生大鼠神经毒性[3]，但其作用机制尚未阐明。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路是调控神经系统损伤的关键通路，PI3K/AKT通路参与SEVO麻醉诱导的发育神经毒性[4]。据报道，SEVO麻醉通过抑制PI3K/AKT信号通路可诱发幼年大鼠一过性认知功能障碍[5]。本研究基于PI3K/AKT信号通路，探讨AA对七氟烷诱导的HT-22细胞活力的影响，以期为新型减轻七氟烷导致的神经毒性的药物开发提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
Multiskan SkyHigh型酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司；CKX41倒置显微镜、BX51荧光显微镜购自日本OLYMPUS公司。
1.2 材料
AA（批号：IA1010）和七氟烷（批号：YZ-101147）均购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠海马神经元HT-22（批号：ZQ0476）购自上海中乔新舟生物科技有限公司；P13K通路抑制剂LY294002（批号：HY-10108）、细胞计数试剂盒（CCK-8，批号：HY-K0301）购自MCE；肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号：CB10851-Mu）、白细胞介素-6（IL-6，批号：CB10187-Mu）、超氧化物歧化酶（SOD，批号：CB10221-Mu）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，批号：CB10326-Mu）和丙二醛（MDA，批号：CB10205-Mu）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒均购自上海科艾博生物技术有限公司；活性氧（ROS）检测试剂盒（批号：E004-1-1）购自南京建成生物工程研究所有限公司；原位末端标记法（TUNEL）试剂盒（批号：P-CA-301）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；JC-1线粒体膜电位测定试剂盒（批号：40706ES60）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；三磷酸腺苷（ATP）含量检测试剂盒（批号：JN24706）购自上海纪宁实业有限公司；抗B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2，批号：ab182858）、抗Bcl-2相关X蛋白（Bax，批号：ab32503）、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，批号：ab184787）、抗磷酸化PI3K（p-PI3K，批号：ab278545）、抗PI3K（批号：ab302958）、抗磷酸化AKT（p-AKT，批号：ab38449）、抗AKT（批号：ab8805）和与辣根过氧化物酶标记的二抗（批号：ab6721）均购自英国Abcam。
1.3 方法
1.3.1 CCK-8法检测七氟烷诱导的HT-22细胞活力
小鼠海马神经元HT-22在含有10%胎牛血清的F12培养基中，置于培养箱（37 ℃，5% CO2）中生长。根据参考文献[6]用4%七氟烷处理HT-22细胞，每天2 h，连续3 d。将对数生长期的HT-22（约1×104个）接种在96孔板中，并用不同浓度（0、5、10、15、20、30 μmol/ L）的AA进行处理；然后将细胞再培养24 h，向每孔加入CCK-8溶液10 μL，培养3 h；于酶标仪450 nm处测定吸光度值。细胞活力计算：细胞活力（%）=（实验组吸光度值-空白组吸光度值） /（对照组吸光度值-空白组吸光度值）×100%。式中， 实验组为添加AA处理的细胞，对照组为未处理的细胞，空白组为不含细胞的培养基。
1.3.2 细胞分组及处理
将对数生长期的HT-22分为对照（Control）组、七氟烷（SEVO）组、AA低浓度（AA-L）组、AA中浓度（AA-M）组、AA高浓度（AA-H）组和AA高浓度+PI13K通路抑制剂LY294002（AA-H+LY294002）组。Control组正常培养细胞。用4%七氟烷处理细胞，每天2 h，连续3 d后，AA-L组、AA-M组、AA-H组和SEVO组分别使用10、15、20 μmol/L的AA和等量的生理盐水处理细胞24 h，AA-H+LY294002组使用20 μmol/L的AA和5 μmol/L的P13K通路抑制剂LY294002[7]共同处理细胞24 h。
1.3.3 细胞形态变化观察
按照“1.3.2”项下中分组处理HT-22细胞，培养24 h后，在倒置显微镜下观察细胞形态变化并进行拍照。
1.3.4 TUNEL检测海马神经元凋亡
在24孔板中放入已消毒的盖玻片，加入HT-22细胞（约1×105个/mL）培养过夜，按照“1.3.2”项下的分组处理HT-22细胞，严格按照TUNEL试剂盒说明书进行凋亡检测，荧光显微镜下随机选取3个视野拍照观察HT-22凋亡情况[TUNEL阳性细胞（凋亡细胞）]，并计算凋亡率（TUNEL阳性细胞数目/DAPI×100%）。
1.3.5 ELISA检测细胞促炎性因子和氧化应激水平
按照“1.3.2”项下分组处理HT-22细胞，培养24 h后，收集细胞，离心获得上清液，使用ELISA检测试剂盒分析上清液中促炎性因子TNF-α和IL-6水平、氧化应激SOD、GSH-Px和MDA水平，使用ROS测定试剂盒检测ROS水平。
1.3.6 线粒体膜电位和ATP含量检测
收集HT-22细胞（1×106个），与1 μg/mL JC-1溶液孵育20 min；离心并用稀释缓冲液洗涤；DAPI染色，荧光显微镜下分析并计算JC-1荧光强度；并使用ATP含量检测试剂盒检测细胞中ATP含量。
1.3.7 Western blot检测相关蛋白表达
根据“1.3.2”项下分组处理HT-22细胞，收集细胞培养液，RIPA缓冲液裂解HT-22细胞提取总蛋白，BCA定量蛋白，通过10% SDS-PAGE分离等量蛋白，并转移到PVDF膜上；用5%脱脂牛奶封闭，4 ℃下用一抗：抗Bcl-2、抗Bax、抗Caspase-3、抗p-PI3K、抗PI3K、抗p-AKT和抗AKT（稀释比例1 ∶ 1 000）孵育过夜。将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释比例1 ∶ 5 000）室温孵育1 h，ECL显影；使用Image J软件测定蛋白质条带的灰度值。蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值 /内参蛋白灰度值。
1.4 统计学分析
所有实验数据采用SPSS 20.0进行统计分析，计量资料符合正态分布以
表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LDS-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 AA对七氟烷诱导的HT-22细胞活力的影响
培养24 h后，与0 μmol/L相比，5~30 μmol/ L AA处理的HT-22细胞活力升高，且随着AA浓度的增加，HT-22细胞活力逐渐升高。因浓度为5 μmol/L时细胞活力与0 μmol/L差异无统计学意义（P＞0.05），选择10、15、20 μmol/L的AA浓度用于后续实验。具体见图1。
2.2 AA对七氟烷诱导的HT-22细胞形态变化的影响
与Control组相比，SEVO组HT22细胞分布稀疏，细胞分化严重，细胞突起收缩，胞间连接断裂，可见部分胞体溶解死亡。AA-L组、AA-M组和AA-H组细胞损伤减轻，细胞体完整，突起延伸，细胞分化明显改善，细胞大部分呈现多极形或锥形，细胞间突起相互连接成网；与AA-H组相比，AA-H+LY294002组HT-22细胞形态学损伤加重。具体见图2。
2.3 AA对七氟烷诱导的HT-22细胞凋亡的影响
与Control组相比，SEVO组HT-22细胞凋亡率、Bax和Caspase-3蛋白水平增加（P ＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）；AA-L组、AA-M组和AA-H组细胞凋亡率、Bax和Caspase-3蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平增加（P＜0.05），且呈浓度依赖性；与AA-H组相比，AA-H+LY294002组细胞凋亡率、Bax和Caspase-3蛋白水平增加（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P ＜0.05）。具体见图3~图5。
2.4 AA对七氟烷诱导的HT-22细胞炎性因子和氧化应激水平的影响
与Control组相比，SEVO组HT22细胞TNF-α、IL-6、MDA和ROS水平增加（P＜0.05），SOD和GSH-Px水平降低（P＜0.05）；AA-L组、AA-M组和AA-H组TNF-α、IL-6、MDA和ROS水平降低（P＜0.05），SOD和GSH-Px水平增加（P＜0.05），且呈浓度依赖性；与AA-H组相比，AA-H+LY294002组TNF-α、IL-6、MDA和ROS水平增加（P＜0.05），SOD和GSH-Px水平降低（P＜0.05）。具体见图6和图7。
2.5 AA对七氟烷诱导的HT-22线粒体膜电位的影响
与Control组相比，SEVO组红/绿JC-1荧光比和ATP含量降低（P＜0.05）；与SEVO组相比，AA-L组、AA-M组和AA-H组红/绿JC-1荧光比和ATP含量呈浓度依赖性增加（P＜0.05）；与AA-H组相比，AA-H+LY294002组红/绿JC-1荧光比和ATP含量降低（P＜0.05）。具体见图8和图9。
2.6 AA对七氟烷诱导的HT-22通路相关蛋白表达的影响
与Control组相比，SEVO组PI3K和AKT磷酸化水平降低（P＜0.05）；与SEVO组相比，AA-L组、 AA-M组和AA-H组PI3K和AKT磷酸化水平增加（P＜0.05），且呈浓度依赖性；与AA-H组相比，AA-H+LY294002组PI3K和AKT磷酸化水平降低 （P ＜0.05）。具体见图10和图11。
3 讨论
七氟烷是一种常用的吸入麻醉剂，大量及长期使用会改变大脑的病理生理状况，导致神经炎症和神经退行性变化，以及神经元细胞死亡、树突状改变和突触异常[8]。药用植物来源的天然产物因其穿透血脑屏障、调节神经元活动和预防神经元损伤的能力而受到重视[9-10]。AA具有强大的神经保护、抗惊厥和认知增强特性[11]。本研究结果显示，AA能有效抑制七氟烷诱导的HT-22细胞活力的降低，挽救HT-22细胞形态学损伤；这与宋阳等[4]研究结果一致，再次证实AA对七氟醚诱导的神经毒性具有抑制作用。
炎症反应在麻醉后会被激活，诱导炎症因子产生，导致神经元损伤。TNF-α和IL-6作为常见的促炎因子，是与神经系统疾病相关的炎症反应的关键介质[12-14]。MDA、SOD和GSH-Px是氧化应激标志物，在受损的神经细胞中MDA升高，SOD和GSH-Px降低，氧化应激水平增高 [15]。Zhang等[16]研究表明，七氟醚诱导HT-22细胞凋亡并阻碍增殖，加剧炎症因子和氧化应激介质的释放。Bax是Bcl-2家族中最重要的凋亡诱导基因，通过线粒体通透性转化通道蛋白将CytC释放到细胞质中，形成CytC-Apaf-Pro-Caspase-9凋亡复合物，激活Caspase-3，并抑制Bcl-2，启动凋亡[17-18]。线粒体功能障碍被认为是神经退行性疾病的病理标志，七氟醚暴露诱导线粒体钙稳态失调，并刺激ATP减少、ROS激活和线粒体呼吸损伤，导致神经细胞损伤和凋亡 [19]。线粒体膜电位、细胞活力和线粒体ATP合成的关键因素，因七氟醚作用而降低[20]。而AA通过改变线粒体膜电位以调节线粒体功能障碍，并抑制小胶质细胞中的NLRP3炎症小体，直接改善MPP诱导的SH- SY5Y细胞活力和线粒体功能障碍[21]。Lu 等 [22]发现，AA（30 mg/kg）可通过激活AKT来减少海马神经元损伤，同时增加突触和线粒体功能，预防大鼠癫痫发作并改善认知障碍。在本研究中，给予AA干预后，七氟烷诱导的HT-22细胞中TNF-α、IL-6、MDA和ROS水平、细胞凋亡率及凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达降低，SOD和GSH-Px水平及Bcl-2蛋白表达增加，且JC-1聚集体（红色）/JC-1单体（绿色）荧光比和ATP的产生增加，表明AA能通过抑制炎症反应和氧化应激，抑制细胞凋亡，改善线粒体功能，减轻七氟烷诱导的HT-22细胞损伤。
PI3K/AKT信号通路在神经细胞存活中起关键作用[23]。据报道，PI3K/AKT通路失活与七氟烷麻醉诱发的神经炎症有关，增加PI3K/AKT通路活性可能是减轻七氟烷麻醉术后神经炎症的一种有前途的治疗策略[24]。Cai等[25]发现重组人三结构域包含蛋白72（TRIM72）可通过上调AKT和PI3K磷酸化水平，增强七氟醚诱导人类神经干细胞的细胞活力，抑制细胞凋亡和线粒体膜电位。Zhang等[26]研究表明，用PI3K抑制剂LY294002预培养PC12细胞后，6-OHDA诱导的PC12细胞中SOD活性、Akt磷酸化水平及JC-1红/绿荧光强度降低。在本研究中，AA干预HT-22细胞后PI3K和AKT磷酸化水平均增加，且PI3K抑制剂LY294002减弱了AA对七氟烷诱导的HT-22细胞损伤的保护作用，表明AA可能通过上调PI3K和AKT表达，抑制炎症反应、氧化应激和凋亡，改善线粒体膜电位功能，从而对七氟烷诱导HT-22的神经毒性发挥保护作用。
综上所述，AA通过激活PI3K/AKT信号通路，抑制炎症、氧化应激和细胞凋亡，改善线粒体功能，增强七氟烷诱导的HT-22细胞活力，发挥神经保护作用。本文初步探索了AA对七氟烷诱导的HT-22细胞活力的影响，表明AA可减轻七氟烷的神经毒性，对新型减轻七氟烷诱导的神经毒性的药物开发具有重要意义。但AA对神经元保护作用机制复杂多样，还需进一步深入探究。
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