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目的 “黄芪-水蛭”药对可以减轻脑缺血再灌注损伤（CIRI），但其作用机制尚未明确。铁死亡是CIRI的新靶点，本文利用网络药理学方法探究“黄芪-水蛭”药对通过调控铁死亡治疗CIRI的作用机制。
方法 通过检索PubChem、SwissTargetPrediction、Batman-TCM、UniProt、TCMSP等数据库分别获得黄芪、水蛭的有效活性成分和作用靶点；检索GeneCards数据库收集CIRI相关靶点；利用Venny在线工具获得“黄芪-水蛭”药对活性成分和CIRI的共同作用靶点。通过Cytoscape软件得出“黄芪-水蛭”药对活性成分、疾病及预测靶点之间相互关系的网络，将蛋白互作网络图进行可视化处理，并使用CytoHubba插件计算得出核心靶点。应用R语言软件对“黄芪-水蛭”治疗CIRI的靶点进行GO分析和KEGG分析。利用FerrDb数据库，获取调控铁死亡的相关基因，将“黄芪-水蛭”药对活性成分、CIRI、铁死亡三者之间的公共基因进行分析，探究其关系并作出预测。使用AutoDockTools 1.5.7等软件对药对活性成分与关键靶点进行分子对接验证。
结果 通过数据库检索共收集到“黄芪-水蛭”药对有效活性成分28个、预测得到药对基因靶点680个，CIRI相关靶点1 513个，药对-疾病的共同靶点253个，铁死亡相关靶点259个，进行相关预测得到包括PIK3CA、RELA、MAPK1、MAPK8、PTGS2、STAT3、SRC、NOS2 等28个“黄芪-水蛭”药对调控铁死亡干预CIRI的可能作用靶点，及包括PI3K-Akt、Ras、TNF、MAPK、HIF-1信号传导途径在内的279条信号通路。分子对接显示，药对关键成分和核心靶点之间有相互作用关系，“黄芪-水蛭”药对可能通过调控铁死亡干预CIRI的发生发展而发挥治疗作用。
结 论 利用网络药理学方法，分析挖掘出“黄芪-水蛭”药对活性成分通过调控铁死亡抗CIRI的潜在靶点及其相关通路，提示“黄芪-水蛭”可能通过氧化应激和抗炎途径调控铁死亡途径发挥其抗CIRI的作用，并为后续进一步的细胞和动物实验提供依据。
脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）是指脑组织持续缺血一段时间后恢复缺血区域的血液供应，导致脑组织结构及功能损伤更严重的一种脑血管疾病。其病理机制错综复杂，有氧化应激、炎症反应等多种病理环节参与其中，并与细胞凋亡、细胞焦亡等多种细胞死亡方式有关，最终导致线粒体功能障碍、血脑屏障破坏及神经元坏死[1-2]。铁死亡是不同于细胞凋亡的细胞程序化死亡方式，呈铁依赖性，是由脂质过氧化物堆积导致的。新近研究显示，铁死亡作为新的细胞死亡方式参与CIRI：脑缺血再灌注诱导神经元铁死亡，使用铁死亡抑制剂等可以显著减轻CIRI[3-4]。铁死亡已经成为CIRI干预的重要潜在靶点，寻找干预铁死亡的中药及其有效组分，可能成为CIRI药物研究的方向之一[5]。
缺血性中风的基本病机之一是气虚血瘀，其基本治法为益气活血，而黄芪、水蛭为益气活血法的代表药物，同时也是临床脑梗通汤、芪蛭通络胶囊等常用药的共有重要药对。本团队前期实验研究显示，黄芪、水蛭配伍可以有效降低脑卒中大鼠的脑梗死面积，并能明显延长凝血酶原时间，显示出对脑缺血的有效保护作用[6]。现代药理学研究显示，黄芪有效成分可以增强脑细胞的抗缺氧能力，具有改善微循环、抗自由基等作用，同时还能够促进脑组织血流量的增加，改善临床症状[7]。另有研究显示，黄芪能抑制耳蜗组织中活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等水平，发挥抗氧化应激和抗炎作用，从而抑制细胞凋亡[8]。水蛭不仅在抗血栓方面发挥重要作用，同时也具有抗炎、抗纤维化作用[9]。研究表明，水蛭水提物可以提高血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、总谷胱甘肽（total glutathione，T-GSH）含量和谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（glutathione/oxidized glutathione，GSH/GSSG）比值，降低血管组织内ROS、MDA和血清中TNF-α含量[10]。提示黄芪、水蛭配伍可能通过抗炎抗氧化应激作用调控铁死亡，对CIRI发挥保护作用，但目前对“黄芪-水蛭”药对调控铁死亡干预CIRI治疗的机制层面的研究未见报道。本研究利用网络药理学系统地分析“黄芪-水蛭”药对的活性成分-靶点-疾病-通路之间相互作用的网络关系，探索该药对通过调控铁死亡治疗CIRI的潜在作用机制，为后续实验研究提供理论参考和新思路。
1 资料与方法
1.1 数据库及软件
TCMSP数据库（https://tcmsp.com/tcmsp.php）；BATMAN-TCM分析工具（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）；PubChem数据库（https://pubchem.nc-bi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.C）；UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）；STRING数据库（https://stringdb.org）；GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）；Venny图在线工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/Venn/）；FerrDb数据库（http://www.zhounan.org/ferrdb/）；Cytoscape 3.9.1软件；R软件（https://www.r-project.org/）；RStudio软件（https://www.rstudio.com/）、PDB数据库（https://www.rcsb.org/）、CBdock（https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php）
1.2 方法
1.2.1 黄芪–水蛭活性成分的收集筛选及药物靶点预测
黄芪：通过TCMSP数据库检索得到黄芪的主要活性成分，设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-like，DL）≥0.18为条件对检索结果进行筛选，得到黄芪活性较高的成分。经过查阅文献，将不在筛选结果中但药理作用较好的成分黄芪甲苷IV、黄芪多糖纳入研究范围。分别将筛选得到的化合物名称输入TCMSP数据库，获取化合物的对应靶点，最终得到黄芪有效活性成分的蛋白作用靶点。再将活性成分化合物名称输入PubChem数据库获取其SMILES结构，利用SwissTargetPrediction数据库，将化合物SMILES结构输入其中，并选择物种为“Homo sapiens”，筛选出可能性大于10%的蛋白作用靶点进行补充。
水蛭：通过BATMAN-TCM数据库，设置目标预测参数值为20、P为0.05，输入“SHUIZHI”进行搜索，得到水蛭的主要活性成分和蛋白作用靶点。考虑化合物在中药中的含量、代谢及药理作用对水蛭的有效成分进行补充，将水蛭素纳入水蛭的研究范围。将活性成分化合物名称输入PubChem数据库获取其SMILES结构，通过SwissTargetPrediction数据库检索化合物的SMILES结构，物种选择“Homo sapiens”，补充可能性大于10%的蛋白作用靶点。基于UniProt数据库中UniProtKB搜索功能，将“Organisms”选项设置为“human”，对黄芪、水蛭的蛋白作用靶点进行Gene symbol规范化名称转换。
1.2.2 “药对-活性成分-靶点”网络构建
使用Excel表格建立黄芪、水蛭各活性成分与预测靶点之间对应关系文件，将表格导入Cytoscape 3.9.1软件建立“药对-活性成分-靶点”网络图。
1.2.3 CIRI潜在致病靶点筛选
在GeneCards数据库中搜索获得CIRI相关的人类基因靶点，检索词为“cerebral ischemia reperfusion injury”，得到CIRI的全部基因靶点。
1.2.4 蛋白质相互作用网络的构建与核心靶点的筛选
将“黄芪-水蛭”活性成分靶点集与CIRI靶点集分别输入Venny在线工具中，得到交集靶点，即为“黄芪-水蛭”药对活性成分治疗CIRI的潜在作用靶点。将交集基因靶点导入STRING，物种选择“Homo sapiens”，Required score设为0.4；获取各靶点之间相互作用关系网络，设置导出格式为TSV。将TSV格式文件导入Cytoscape软件中，对得到的蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络进行可视化处理并分析，再依据节点的度（degree）值进行调节。
Cytoscape中的插件CytoHubba，可以提供11 种基于最短路径的拓扑分析方法，其中最大集团中心度算法被证实可以较为精确地预测重要靶点，用以对网络的特征进行分析，完成对网络中的节点的排序。通过最大相关熵（maximum correlation criterion，MCC）拓扑算法分析的到“黄芪-水蛭”治疗CIRI的关键靶点，构建关键靶点的子网络。
1.2.5 基因通路与生物学功能富集分析
通过R软件，安装相关数据包进行各种生物信息学分析和结果可视化。设定P＜0.05与Q ＜0.05，对交集基因进行GO分析和KEGG分析，将GO功能分析中生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellular component，CC）的前10项以及KEGG富集分析中与CIRI关系最密切的前20条信号通路分别进行可视化处理，用条形图展示GO功能分析的结果，用气泡图展示KEGG富集分析的结果。
1.2.6 铁死亡调控基因获取及其与“黄芪-水蛭”药对、CIRI 三者靶点综合分析
利用Excel表格收集通过FerrDb数据库检索得到的铁死亡过程的标记基因、驱动基因及抑制基因。利用Venny在线分析工具获取铁死亡调控基因与“黄芪-水蛭”药对参与调控CIRI的靶基因提取公共基因，得到“黄芪-水蛭”药对通过调控铁死亡干预CIRI的靶点。利用STRING数据库对得到的3者公共基因构建PPI网络，并用R软件对上述公共基因进行GO分析和KEGG分析。
1.2.7 “黄芪–水蛭”药对有效活性成分与CIRI和铁死亡作用靶蛋白的分子对接验证
取结果中得到的“黄芪-水蛭”药对中发挥主要作用的有效成分，在Pubchem网站中输入其CAS号得到其3D结构；利用UniProt网站下载“黄芪-水蛭”药对调控铁死亡干预CIRI中发挥重要作用的靶点的PDB文件；通过AutoDockTools对蛋白质受体和小分子配体进行结构优化；使用CBDock预测蛋白质结构的潜在活性口袋，通过AutoDock Vina平台将蛋白质结构中已有的结合口袋和预测活性口袋与小分子进行分子对接，根据蛋白的活性口袋设置对接盒子的大小、坐标、格点数、格点距离；设置对接的构象数为200个，运行AutoGrid4. exe和AutoDock4.exe程序生成对接结果。根据打分排序，选出得分最高的小分子结合构象。根据分子对接模型，筛选可以和靶点结合的潜在构象。
2 结果
2.1 “黄芪-水蛭”药对主要活性成分筛选
检索TCMSP数据库得到黄芪化学成分87个，根据条件筛选后得到14种黄芪有效活性成分，文献补充后最终获得16种黄芪的有效活性成分，将其分别编号为HQ1~HQ16；通过BATMAN-TCM数据库共收集了水蛭活性成分11种，结合文献补充后最终得到有效活性成分12种，将其分别编号为SZ1~SZ12。“黄芪-水蛭”药对主要活性成分的基本信息见表1。
2.2 “黄芪-水蛭”药对潜在靶点预测
通过TCMSP数据库得到黄芪有效活性成分对应的靶点，经过SwissTargetPrediction平台的补充，去除无效和重复靶点，并通过UniPort数据库完成基因名的转换，最终得到411个黄芪潜在活性成分的作用靶点。通过BATMAN-TCM数据库搜索并去重后得出水蛭有效活性成分对应的345个作用靶点。
2.3 “黄芪-水蛭”药对干预CIRI的相关基因靶点
利用GeneCards数据库获得CIRI相关分子靶点1 513个。通过Venny图在线工具获得“黄芪-水蛭”药对干预CIRI的253个预测作用靶点。其中属于黄芪的靶点有180个，属于水蛭的靶点有110个靶点，两者共有靶点有37个，提示“黄芪-水蛭”药对配伍治疗CIRI，两味药既可以单独起作用，又可以共同发挥作用。
2.4 “药对-成分-靶点”网络图构建
通过Cytoscape软件建立“药对-活性成分-靶点”网络图（图1）。其中，左、右侧圆圈圆心分别代表药物黄芪、水蛭，左、右圈上节点分别代表黄芪、水蛭有效活性成分，中间节点代表活性成分的对应靶点，连接线代表活性成分与靶点的相互关系。在“药对-成分-靶点”网络中有710个节点和1 161条边。
2.5 “黄芪-水蛭”药对调控CIRI作用靶点蛋白互作网络
将“黄芪-水蛭”药对与CIRI的253个交集基因导入STRING得到PPI网络图，PPI网络中共有253个节点，代表靶点；1 821条相互作用连线，代表靶点之间相互联系。对PPI网络进行可视化处理后，根据Cytohubba插件中的MCC算法筛选出排名前20的靶点（表2和图2）。其之间的网络联系可能在“黄芪-水蛭”药对抗CIRI发病机制中发挥重要作用。
2.6 GO功能分析和KEGG富集分析
利用R软件，对“黄芪-水蛭”药对和CIRI共同靶点进行GO富集（P ＜0.001），对GO分析排名靠前的类别进行说明。BP类分析表明，这些靶点主要与激活酶的正向调节、炎症反应的调节、对细菌来源分子的反应、钙离子稳态等有关。CC类分析表明，靶点主要分布在膜筏、膜微区、突触膜、神经元细胞体的组成部分中。MF类分析包括肽结合、神经递质受体活性、蛋白酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性等（图3）。KEGG通路分析共富集到155条通路（P＜0.001），人工筛选与疾病无关的信号通路，涉及到PI3K-Akt信号通路、钙信号传导途径、Rap1信号传导途径、Ras信号传导途径、催乳素信号传导途径、炎症介质对TRP通道的调节、IL-17信号传导途径等20条信号通路（图4）。
2.7 铁死亡调控因子的获取及其与“黄芪-水蛭”药对、CIRI共同基因筛选和分析
在FerrDb数据库中检索到259个与铁死亡过程相关的基因，通过Venny分析，得到铁死亡过程相关基因与“黄芪-水蛭”药对和CIRI的253个公共基因共28个交集基因，即为“黄芪-水蛭”药对调控铁死亡过程干预CIRI的关键基因（图 5），包括PIK3CA、RELA、MAPK1、MAPK8、PTGS2、STAT3、SRC、NOS2等。通过STRING数据库得到28个交集基因PPI网络可视图（图6），表明这些基因之间有相互作用且联系紧密。
对交集基因进行KEGG分析，共得到279条信号通路。包括PI3K-Akt信号通路、Ras信号传导途径、HIF-1信号传导途径、IL-17信号传导途径、炎症介质对TRP通道的调节、细胞凋亡、TNF信号传导途径、MAPK信号传导途径等信号通路（图 7）。本研究发现，“黄芪-水蛭”药对调控铁死亡途径的靶点与参与CIRI的核心靶点及核心蛋白质网络高度重合，推测“黄芪-水蛭”药对能够通过调控铁死亡途径干预CIRI。
2.8 “药对-活性成分-靶点-通路”网络的构建与分析
将“黄芪-水蛭”的活性化合物与筛选的排名前20信号通路及其作用核心靶点基因结合，应用 Cytoscape软件构建网络（图8）。如图所示，共17种活性化合物作用于上述 20种信号通路，分析显示kaempferol（山萘酚）、2-（chloromethyl）-4-（4-nitrophenyl）-1,3-thiazole（黄芪多糖）、astragaloside IV（黄芪甲苷）、crocetin（藏花酸）、hirudin（水蛭素）等成分发挥着重要作用；PIK3CA、RELA、MAPK1、MAPK8、MAPK9、MAPK14、PTGS2、STAT3、SRC、NOS2可能是“黄芪-水蛭”调控铁死亡抗CIRI的关键靶点。
2.9 分子对接验证药物关键成分与靶点间作用情况
根据“2.8”项下结果，选择“黄芪-水蛭”中发挥主要作用的关键成分黄芪多糖、黄芪甲苷及水蛭素与核心靶点PIK3CA、RELA、PTGS2、SRC（表3）进行分子对接，预测药物成分与靶点之间结合模型（图9）。分子对接结果显示黄芪多糖与PIK3CA、PTGS2之间有相互作用，黄芪甲苷与PIK3CA之间有相互作用，水蛭素与4个靶点蛋白均有相互作用关系，并预测其结合模型（图9）。1种成分可以调控多个靶点，同时1个靶点可以被多种成分调控，表明“黄芪-水蛭”药对可以通过多靶点、多通路调控铁死亡干预CIRI。
3 讨论
CIRI在中医理论中属于“中风”范畴，主要病机是气虚血瘀，其中瘀血为贯穿整个疾病过程的病理因素[11]。黄芪归属肺脾二经，能够行气补脾、活血生血，扶助正气以逐瘀；水蛭作为活血化瘀代表药，破血消癥效强，同时具有祛风通络的功效，两药合用，共行补气活血、逐瘀去癥之用。现代药理学研究表明，黄芪、水蛭相伍能够减少血小板凝聚，具有抗凝血、促进受损组织修复的作用[12]。CIRI的主要特征有炎症级联反应、氧化应激，再灌注过程引起大量的ROS和炎性因子的释放，从而导致脑水肿和神经功能缺陷。铁死亡的概念是由Dixon等[13]于2012年首次提出，是一种非凋亡的、新的调节性细胞死亡形式，呈铁依赖性，有氧化还原体系的失衡、脂质过氧化物的过度蓄积等表现。过度蓄积的活性氧和脂质过氧化物将加重细胞内炎症因子级联释放和细胞凋亡，最终导致细胞免疫反应失调和组织损伤[14]。新近研究发现，铁代谢失调、脂质过氧化物蓄积及GSH/GPX4轴失衡与CIRI密切相关，提示铁死亡可能参与了CIRI的病理过程 [15-16]。“黄芪-水蛭”药对可能通过调控铁死亡成为干预CIRI的有效治疗手段。
本研究通过网络药理学分析发现“黄芪-水蛭”药对关键成分黄芪多糖、黄芪甲苷、水蛭素等发挥主要是通过参与氧化应激反应和ROS类反应发挥调控铁死亡治疗CIRI的作用，这些成分作用的靶点通过调控与铁代谢紊乱、脂质过氧化和炎症反应等相关的信号通路调控铁死亡，抑制氧化应激和炎症反应治疗CIRI。
铁死亡可能是氧化应激过程中重要的一环，氧化应激中包含着铁死亡，两者相互作用[17]。PIK3CA[18]、SRC-1（属于SRC家族）[19]能够激活PI3K/AKT信号通路，激活的AKT通过磷酸化级联反应调控下游效应分子，上调AKT的磷酸化减少ROS的生成，从而缓解氧化应激，减轻神经元的氧化损伤[20]。低氧条件下，PI3K/AKT通路可激活铁死亡的重要介质缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）。HIF-1α在脑缺血后神经元和星形胶质细胞中的表达显著升高[21]，缺氧诱导PI3K/AKT通路通过激活HIF-1上调铁死亡核心基因GPX4的表达[22]，从而抑制脂质过氧化物的积累，降低细胞铁死亡水平[14]。PI3K/AKT通路在调节CIRI的炎症、细胞死亡以及氧化应激中发挥重要作用[20]。研究发现，SRC敲除可以缓解脑卒中小鼠的脑梗死和神经元损伤。SRC是miR-137的靶基因，上调miR-137或抑制SRC可抑制炎症因子的分泌，抑制氧化应激，减少星形胶质细胞的凋亡[23]。MAPK1又称ERK2，是Ras/ERK通路的关键激酶，研究显示Ras/ERK通路调控HIF-1α的表达[24]。EGFR通过激活MAPK信号通路降低GPX4的表达，并通过NOX4增加H2O2的产生，从而增加了细胞对铁死亡的敏感性[25]。黄芪甲苷[26]可以通过激活PI3K-AKT信号通路，抑制CIRI引起的氧化应激反应，调节细胞凋亡，减少ROS生成，保护机体组织细胞。Zhou[27]和黎晨等[28]的实验结果显示，由黄芪多糖处理过的心肌微血管内皮细胞（MMECs）凋亡率降低，NO含量增加，其作用与黄芪多糖通过调控PI3K/Akt/eNOS信号通路来缓解氧化应激引起的损伤有关。
TP53编码的肿瘤抑制因子p53是细胞铁死亡启动过程的重要调节因子，在ROS应激下，p53通过抑制SLC7A11的转录过程，下调SLC7A11的表达，从而使胱氨酸合成减少，诱导细胞铁死亡的发生[29-30]。研究表明，TP53受到PI3K/AKT信号通路的调控，PI3K/AKT通路下游调控因子MDM2负向调控p53，这可能是减轻CIRI中神经元铁死亡的重要途径[31]。MAPK8又称JNK，编码JUN N-末端激酶。JNK信号通路作为p53重要的上游信号，可以上调p53的表达[29, 32]。MAPK9又名JNK2，与MAPK8关系最为密切。JNK1/2抑制剂可以通过抑制p53的表达从而抑制铁死亡，同时经过铁死亡诱导剂的处理使p-JNK 的蛋白表达显著增加[33]。ALOX15，由p53的诱导基因SAT1调控，研究显示，p53介导的SAT1的转录激活对ROS诱导的铁死亡至关重要[34]。Yang等[35]研究发现黄芪甲苷可以下调p-JNK/JNK通路的激活，抑制Bax/Bcl-2的表达，最终上调Nrf2/Keap1信号通路，通过抑制氧化应激和凋亡对大鼠原代培养星形胶质细胞OGD/R损伤起保护作用及其分子机制。
HMOX1编码铁死亡过程中铁依赖性脂质过氧化的必需酶血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）[36]。HO-1是Nrf2调控的抗氧化蛋白，Nrf2/HO-1信号通路是细胞抗氧化应激的重要信号通路，激活Nrf2可以促进HO-1的表达[37]。HO-1通过减少体内自由基的生成，降低氧化应激损伤，发挥抗氧化作用[38]。HO-1一方面可以阻止游离血红素参与氧化反应，同时HO-1及其酶解产物也发挥着抗氧化、抗炎、改善组织微循环等作用。越来越多的研究表明，在CIRI等神经系统疾病中，Nrf2/HO-1信号通路发挥抑制铁死亡、减轻神经损伤及神经功能障碍的作用[39-40]。研究显示，水蛭水提物可以降低ROS积累和MDA含量，提高Nrf2和HO-1蛋白表达水平，通过Nrf2介导的抗氧化作用预防静脉血栓形成，显著减轻了血管损伤[10]。
炎症反应是脑缺血/再灌注的主要病理特征，而铁死亡与炎症反应关系密切。研究报道铁死亡具有较强的促炎作用，通过释放损伤模式相关分子（DAMPs）激活固有免疫，继而释放IL-1β、IL-6等促炎因子、激活促炎通路；另外，铁死亡可通过脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）和环氧化酶（cy-clooxygenase，COX）产物参与并加重炎症反应[41]，最终导致细胞免疫反应失调、细胞死亡和组织损伤[42]。
PTGS2基因主要编码COX2，研究发现铁死亡组织中该基因表达增加，花生四烯酸通过COX途径进一步代谢为炎症介质，从而促进炎症信号分子的释放[43-44]。RELA为原癌基因，编码NF-κB的p65亚基。NF-κB转录因子家族参与免疫、炎症和凋亡等多种生物过程，是一系列信号转导事件的终点，同时NF-κB通路也是调节细胞氧化还原状态的关键。研究显示RELA在铁死亡抑制剂的处理下水平降低[45]，提示其可能参与调控铁死亡。研究表明，MAPK1在MAPK/ERK通路同样发挥关键作用，其磷酸化后激活该通路，进而调控下游炎症反应[46]。黄芪甲苷通过下调MAPK1的磷酸化继而抑制MAPK/ERK通路的激活，减弱神经炎症[47]。
多种基因如STAT3、NOS2等同样参与炎症，增强促炎介质如IL-6的合成，刺激NF-κB的激活，调控铁死亡的过程。GPX4通过调控NF-κB信号通路实现对LOX和ROS合成的抑制作用，以缓解机体炎症反应[48]。反之若缺乏GPX4，则可以诱发或加重炎症反应[49]。NF-κB是p38 MAPK的下游分子，抑制p38 MAPK通路，可抑制NF-κB的激活，从而减弱TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子的释放，减轻脑组织损伤[50]。研究显示，重组水蛭素降低ApoE-小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6和CRP的水平，改善慢性炎症状态；同时减少TLR4和NF-κB的表达，从而抑制炎症反应、改善内皮功能[51]。
新进研究显示铁死亡在CIRI的发病过程中起着重要作用，已成为CIRI的研究热点。本研究通过网络药理学的方法，预测“黄芪-水蛭”药对可能通过PIK3CA、RELA、MAPK1、MAPK8、PTGS2、STAT3、SRC、NOS2等28个核心靶点干预CIRI的铁死亡进程，其作用机制与PI3K-Akt信号通路、MAPK信号传导途径、HIF-1信号传导途径等信号通路密切相关，且其关键成分与 PI3K-AKT通路上的靶蛋白相互结合能力较好，为课题组进一步探索“黄芪-水蛭”药对通过调控铁死亡治疗缺血性脑卒中的作用机制提供了新的思路和方向，后续将开展相关实验研究来证实此研究预测结果的可靠性。
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