目的  研究木芙蓉叶多糖的提取工艺，并对其单糖组成进行分析及分离纯化。

方法  采用星点响应面法对木芙蓉叶多糖的酶法提取工艺进行优化研究，用Sevag法和三氯乙酸法对木芙蓉叶多糖脱蛋白，筛选最优脱蛋白方法；对脱蛋白后的木芙蓉叶多糖进行DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析分离纯化；采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生-高效液相色谱法对木芙蓉叶多糖以及纯化产物的单糖组分进行分析。

结果  木芙蓉叶多糖的最佳提取工艺为：提取时间3 h，液料比70 ∶ 1，温度40 ℃，酶用量1.3%，产率为56.42%；木芙蓉叶多糖脱蛋白最佳方法为三氯乙酸法；木芙蓉叶多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和岩藻糖6种单糖组成，其含量排序为葡萄糖＞半乳糖＞木糖＞甘露糖≈岩藻糖＞鼠李糖，且在9月份时总多糖含量达到最高；分离纯化得到的木芙蓉叶多糖Ⅰ含有葡萄糖和半乳糖，摩尔比为9.06 ∶ 1，木芙蓉叶多糖Ⅱα含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖、木糖和岩藻糖，摩尔比为0.23 ∶ 0.15 ∶ 1 ∶ 0.45 ∶ 0.21，木芙蓉叶多糖Ⅱb仅含少量岩藻糖。

结论  木芙蓉叶多糖的最佳提取工艺稳定可行，可为其生产提供理论依据；使用PMP柱前衍生-高效液相色谱法测定木芙蓉叶多糖单糖组成稳定性、准确度及重复性好，可作为木芙蓉叶多糖的质量控制方法；木芙蓉叶多糖的纯化工艺稳定可行，可成功纯化出均一多糖。

木芙蓉叶为锦葵科木槿属植物木芙蓉Hibiscus mutabilis Linn.的干燥叶[1]。李时珍在《本草纲目》中指出芙蓉叶“治一切大小痈疽肿毒恶疮，消肿排脓止痛”[2]，张璐在《本经逢原》称赞“芙蓉叶散痈疽殊有神效”[3]，《本草从新》也描述其“散热止痛，消肿排脓，治一切痈疽肿毒有殊功”[4]。尽管历代医家对木芙蓉叶外敷后解毒、消肿、止痛的功效很推崇，但《中国药典》至2015年版才将其作为新增品种收入，且目前对其药效物质基础研究尚少。

木芙蓉叶性滑涎黏，前期试验证实其所含有的大量黏液为多糖类物质。多糖在皮肤病领域已有较多研究，目前已报道白及、灵芝、魔芋、麦冬等所含多糖具有促进创面愈合、减轻痤疮症状、改善皮炎等药理作用[5-10]，木芙蓉叶消肿生肌、治疗疮疡肿毒的功效与上述植物多糖的作用有类同之处，由此推测木芙蓉叶多糖（Folium hibisci mutabilis polysaccharides，FHMP）为其有效成分之一。本文采用响应面法对FHMP的酶法提取工艺进行优化，然后考察最佳脱蛋白方法，对脱蛋白后的多糖进行分离纯化，最后对FHMP的单糖组分以及纯化产物进行分析，为FHMP的进一步研究与开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

LC-2030C 3D Plus型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SP-Scintific型冷冻干燥机（德祥科技有限公司）；IKA RV 10型旋转蒸发仪（成都世纪方舟科技有限公司）；SHZ-D (II)型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；IKA HB 10型水浴锅（成都世纪方舟科技有限公司）；UPL-IV-30EZ型超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；MH-2000型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）；JY10002型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；JW-1042型低速离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；TopPette 100~1 000 µL型手动单道可调式移液器[大龙兴创实验仪器（北京）股份公司]；UV-5880型紫外可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]。

1.2 主要药品与试剂

对照品：D-(+)无水葡萄糖（批号：MUST-21030214，纯度99.61%）、鼠李糖（批号：MUST-21040104，纯度99.99%）、D-(+)-木糖（批号：MUST-22091701，纯度99.59%）、L-岩藻糖（批号：MUST-2111804，纯度98.36%）、D-(+)-甘露糖（批号：AF20151053，纯度98%）、D-半乳糖（批号：AF20171204，纯度98%）均购自成都埃法生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（批号：20150307）、果胶酶（批号：20150307）、纤维素酶（批号：20150307）均购自上海源叶生物科技有限公司；考马斯亮蓝G250（批号：221123）和牛血清蛋白（批号：230210）购自合肥千盛生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

收集9批木芙蓉叶样品（S1~S9号），来源于四川省成都市新都区固定的5个采摘点，经成都医学院药学院中药教研室游元元教授鉴定为锦葵科植物木芙蓉Hibiscus mutabilis Linn.的干燥叶。采摘洗净去除杂质，于50 ℃下烘干，粉碎过50目筛网，在室温下密封备用。

2 方法与结果

2.1 木芙蓉叶粗多糖的提取工艺研究

2.1.1 葡萄糖标准曲线的建立

取无水葡萄糖对照品，精确称定，定容至100 mL，得质量浓度为0.079 mg/mL的对照品溶液。精密吸取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00  mL的对照品溶液于比色管中，用超纯水补至1  mL。采用苯酚-硫酸法显色，于490 nm处测定吸光度。以浓度为横坐标（X，mg/mL）、吸光度为纵坐标（Y）绘制葡萄糖标准曲线，得线性回归方程：Y=12.422X+0.087 3，r=0.999 9，结果表明葡萄糖在0.015 8~0.079 0 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.1.2 多糖提取率的测定

将粗多糖提取液稀释一定倍数后，用显色反应测定吸光度，将吸光度值代入葡萄糖标准曲线中计算得到多糖浓度，再代入下式，即得多糖的提取率。

式中Y为多糖提取率（%），V为样品总体积（mL），C为多糖浓度（mg/mL），D为稀释倍数，m为称取的样品质量（g），0.9为转换系数。

2.1.3 酶种类的筛选

称取适量木芙蓉叶粉末，95%乙醇索氏提取2 h，除去叶绿素。取6份脱脂粉末各1 g，精密称定，分别加入50 mL提前在30 ℃条件下活化的果胶酶水溶液、纤维素酶水溶液、木瓜蛋白酶水溶液，50 ℃提取2 h后，90 ℃放置4 min终止酶解反应，加水补足重量。6 743×g离心10 min后取上清液，得到不同酶提取法提取的粗多糖液。将其在75  ℃下减压浓缩，加入无水乙醇使最终醇浓度达到80%，24 h后6 743×g离心10 min取沉淀，冷冻干燥，得粗多糖样品。在果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶作用下得到的多糖平均提取率分别为3.05%、3.39%、3.46%（n=3）。其中，果胶酶作用下提取率最小，纤维素酶和木瓜蛋白酶作用下结果相差不大，考虑到木瓜蛋白酶可用于后续粗多糖的纯化，故本试验选择木瓜蛋白酶提取法。

2.1.4 提取工艺优化

①单因素试验。考察单个因素对多糖提取率的影响规律，工艺参数及范围为：提取时间1、2、3、4 h；液料比30 ∶ 1、40 ∶ 1、50 ∶ 1、60 ∶ 1、70  ∶ 1 mL/g；提取温度30、40、50、60、70、80 ℃；酶浓度0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%。

由图1A可知，FHMP的提取率随着酶解温度的升高，总体呈现先升高后下降的趋势，并在50 ℃时达到最高。因此，本试验选择酶解温度为40、50、60 ℃作为响应面的3个水平。

由图1B可知，FHMP的提取率随着酶解时间的延长，总体呈现先增加后减少的趋势，并在2 h时达到最高。因此，本试验选择酶解时间为1、2、3 h作为响应面的3个水平。

由图1C可知，FHMP的提取率随着酶浓度的增大，总体呈现不断上升的趋势。在研究过程中发现，当酶浓度为1.3%时，酶水呈现轻微混悬液状态，推测已为饱和状态，故继续增加酶浓度可能造成数据不稳定。从减少生产成本兼顾提取效率的综合考虑下，本试验选择酶浓度为1.1%、1.2%、1.3%作为响应面的3个水平。

由图1D可知，FHMP的提取率随着液料比的增加，总体呈现先增加后下降的趋势，并在60  ∶ 1（mL/g）时达到最高。因此，本试验选择液料比为50 ∶ 1、60 ∶ 1、70 ∶ 1作为响应面的3个水平。

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  图1 单因素试验结果（n=3）

  Figure 1.The results of single-factor experiment (n=3)

  注：A. 酶解温度；B. 酶解时间；C. 酶浓度；D. 液料比。

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②根据单因素试验结果，采用Design Expert 10.0.1软件进行响应面试验设计，对FHMP提取工艺进行优化。采用Design Expert 10.0.1软件对试验数据进行分析拟合，得出了如下的回归方程：

Y=37.39+3.05A-2.88B+0.62C+6.33D-1.74AB-0.34AC+0.013AD-0.59BC-2.12BD+1.68CD-0.33A²-0.11B²+0.42C²+0.38D²（其中Y为多糖提取率，A为酶用量，B为温度，C为时间，D为液料比）。结果显示，该模型的P＜0.01，说明模型极其显著；失拟项的P＞0.05，说明未知因素对试验结果的干扰很小[11]，可用该回归方程来分析试验结果[12]。回归方程中的A、B、D、AB、BD、CD的P均＜0.05，表明这些因素均对总多糖提取率产生了显著影响。该模型的相关系数R²=0.918 1，表明模型拟合优度比较高。调整决定系数R²_Adj=0.841 7，表明忽略自变量个数的影响后，84.17%多糖提取率的变化能用此方程进行解释[13]。各因素对总多糖提取率有影响程度依次是D＞B＞A，C对多糖提取率无显著影响（P ＞0.05）。

三维响应面和等高线图是将其中1个或多个因素固定于中心值不变，直观反应另外两个因素的交互作用对多糖含量的影响。若等高线呈椭圆形，响应面曲线陡峭，说明两因素之间的交互作用对多糖含量的影响较大[14-15]。由响应面3D图（图2）可知，4个因素之间的交互作用对总多糖提取率有影响的程度依次是BD＞AB＞CD，其余因素之间的交互作用对总多糖提取率不产生显著影响（P＞0.05）。

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  图2 响应面分析的3D图

  Figure 2.3D plot of response surface analysis

  注：A. 酶用量与温度；B. 酶用量与时间；C. 酶用量与液料比；D. 温度与时间；E. 温度与液料比；F. 时间与液料比。

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2.1.5 验证试验

软件预测的最佳提取工艺条件为提取时间3  h、液料比70 ∶ 1（mL/g）、提取温度40 ℃，酶浓度1.3 %。此条件可操作性强，不需作任何调整。按照最优条件进行3次验证试验，测得FHMP的提取率平均值为53.40 %，与预测值相差不大。

2.2 木芙蓉叶粗多糖纯化工艺研究

2.2.1 葡萄糖标准曲线的建立

同“2.1.1”项下方法。

2.2.2 蛋白标准曲线的建立

精密称取考马斯亮蓝G250 0.100 0 g，置1  000 mL量瓶中，用50 mL 90%乙醇溶解，摇匀，再加入100 mL 85%磷酸，用超纯水稀释至刻度，减压抽滤，4℃冰箱保存。取BSA，精密称定，定容至100 mL，得质量浓度为0.1 mg/mL的蛋白质对照品溶液。精密吸取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于比色管中，用超纯水定容至1 mL，摇匀。加入考马斯亮蓝染液5 mL，涡旋30 s，放置3 min[16]。在595 nm处测吸光度，以浓度为为横坐标（X，mg/mL）、吸光度为纵坐标（Y）绘制蛋白质标准曲线，得线性回归方程：Y=6.203X+0.044 22，r=0.999 4，结果表明蛋白质在0.02~0.10 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.2.3 Sevag法脱蛋白

将Sevag试剂（正丁醇:氯仿=1 ∶ 4）和粗多糖溶液按5 ∶ 2的体积比混合，充分振荡摇匀后静置，弃去下层二元有机体系和中间层蛋白乳浊液，重复操作5次。用考马斯亮蓝法和苯酚-硫酸法分别测定蛋白去除率和多糖损失率。由图3可知，蛋白去除率和多糖损失率随脱蛋白次数的增加而增大，随后趋于平稳。当脱蛋白次数大于2次时，无法兼顾高蛋白去除率和低多糖损失率。综合考虑，最佳脱蛋白次数为2次。

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  图3 脱蛋白次数对多糖损失率和蛋白去除率的影响（n=3）

  Figure 3.Effect of the number of deproteinization on the rate of polysaccharide loss and protein removal (n=3)

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2.2.4 三氯乙酸法脱蛋白

取适量多糖提取液，加入等体积的2%、5%、7.5%、10% 三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），并立即调节pH至中性，于60 ℃水浴加热30 min，冷却至室温，在4 ℃冰箱中冷藏过夜，6 743×g离心5 min，取上清液。用考马斯亮蓝法和苯酚-硫酸法分别测定蛋白去除率和多糖损失率。由图4可知，蛋白去除率和多糖损失率随TCA浓度的增加而增大，当TCA的质量超过5%时，多糖损失率剧增，蛋白去除率趋于平缓。因此，TCA的质量浓度应该控制在5%左右。将该结果与“2.2.3”项结果对比，本试验将采用质量浓度为5 %的TCA进行脱蛋白处理。

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  图4 不同TCA浓度对多糖和蛋白质的影响（n=3）

  Figure 4.Effect of TCA on polysaccharide and protein content (n=3)

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2.2.5 DEAE-52纤维素柱层析

取适量脱蛋白后的多糖粉末用少量反渗透水进行溶解并上柱，按照蒸馏水、0.2、0.5、0.7、1.0  mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，每次洗脱液体积200 mL，10 mL/管，收集完成后于490 nm下测定吸光度，以管数为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）绘制洗脱曲线[17]。由图5可知，第1个峰为蒸馏水洗脱部分，命名为FHMP-Ⅰ；第2个峰为0.2 mol/L NaCl溶液洗脱部分，命名为FHMP-Ⅱ。分别收集各吸收峰洗脱液，旋蒸浓缩，计算得率分别为41.6%和12.7%。

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  图5 木芙蓉叶多糖DEAE-52纤维素柱层析洗脱曲线

  Figure 5.Cellulose column chromatography elution curve of Folium hibisci mutabilis polysaccharide DEAE-52

  注：1.FHMP-Ⅰ；FHMP-Ⅱ。

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2.2.6 Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析

将“2.2.5”项下得到的洗脱部分过Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱，以蒸馏水为洗脱液，5 mL/管，收集完成后于490 nm下测定吸光度，管数为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）绘制洗脱曲线[18]。FHMP-Ⅰ和FHMP-Ⅱ的Sephadex G-100层析柱洗脱曲线见图6，结果表明FHMP-Ⅰ为均一多糖，FHMP-Ⅱ洗脱后得两种均一多糖，分别命名为FHMP-Ⅱα和FHMP-Ⅱb。

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  图6 Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线

  Figure 6.Sephadex G-100 dextran gel column chromatography elution curve

  注：A. FHMP-Ⅰ；B. FHMP-Ⅱ。

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2.3 FHMP的单糖组分分析

2.3.1 HPLC色谱条件

采用RD-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈（A）- 0.02 mol/L磷酸盐缓冲液（B）（pH 6.8）为流动相，梯度洗脱（0~10 min，17%A；10~20  min 17%~20%A；20~35 min，20%~24.5%A；35~40 min，24.5%~30%A）；检测波长为254 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样体积为10 μL[19]。

2.3.2 粗多糖水解衍生液及纯化产物衍生液的制备

精密称取木芙蓉叶粗多糖、纯化后多糖各0.1  g分别置于西林瓶中，加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸溶解，密封后于100 ℃热水中微沸水解3  h；水解完成后，取出倒于蒸发皿上，置于90  ℃水浴锅上，反复多次滴加少量甲醇，直至三氟乙酸完全挥干后，加入4 mL反渗透水复溶得水解液。取1  mL水解液于10 mL离心管中，加入1 mL 0.5  mol/ L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）甲醇溶液及1 mL 0.3  mol/ L NaOH溶液，密封后涡旋混匀，70 ℃下反应30 min，完成后冷却至室温，再加入1 mL 0.3  mol/L HCl溶液中和，最后加入4  mL氯仿涡旋萃取多余的PMP，每次5 min，重复操作2次，弃去氯仿层，经0.45 µm滤膜后进行HPLC分析。

2.3.3 混合对照品衍生液的制备

精密称定甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖对照品适量，混合定容至10 mL，加水配制成质量浓度分别为0.14、0.27、5.60、0.51、0.40、0.15 mg/mL的混合单糖对照品溶液。按“2.3.2”项下方法制备混合对照品衍生液。

2.3.4 空白对照衍生液的制备

按“2.3.3”项下方法制备空白对照溶液衍生液。

2.3.5 专属性试验

空白对照溶液、单糖混合对照品溶液、木芙蓉叶粗多糖水解液的衍生化-HPLC色谱图见图7。测定结果显示空白对照溶液对样品峰的测定不产生干扰，且6种单糖衍生物的色谱峰均都能实现基线分离（各组分分离度＞1.5），理论塔板数以甘露糖计都在8 000以上。

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  图7 各溶液的衍生化-HPLC色谱图

  Figure 7.Derivatization of each solution-HPLC chromatogram

  注：A. 木芙蓉叶粗多糖水解液；B. 单糖混合对照品溶液；C. 空白对照溶液；1. 甘露糖；2. 鼠李糖；3. 葡萄糖；4. 半乳糖；5. 木糖；6.  岩藻糖。

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2.3.6 各单糖标准曲线的建立

将“2.3.3”项下的混合单糖对照品溶液逐级稀释成不同浓度的混合对照品溶液，分别经PMP衍生化后，进样分析，记录峰面积。以每种单糖的质量浓度为横坐标（X，μg/mL）、色谱峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。

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  表格1 FHMP中6个单糖测定标准曲线

  Table 1.Standard curves for the determination of six monosaccharides in FHMP

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2.3.7 精密度试验

取“2.3.6”项下中间浓度的混合对照品溶液，经PMP衍生化后，重复进样6次。计算得甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖峰面积的RSD分别为0.55%、0.72%、0.32%、0.23%、0.22%、1.62%，保留时间的RSD分别为1.68%、1.36%、1.20%、1.16%、1.33%、1.17%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.3.8 稳定性试验

取0.1 g木芙蓉叶粗多糖（编号：S5），经水解并衍生化后，于0、2、6、10、16、20、24 h后进样分析，记录峰面积。计算得甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖峰面积的RSD分别为1.23%、1.78%、2.77%、1.95%、2.21%、3.82%（n=7），结果表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.3.9 重复性试验

取0.1 g木芙蓉叶粗多糖6份（编号：S5），经水解并衍生化后，进样分析，记录峰面积，代入标准曲线计算6种单糖的含量。计算得甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖的平均含量为0.06%、0.11%、22.58%、0.45%、0.33%、0.04%，RSD分别为3.88%、3.40%、2.50%、2.36%、2.93%、2.88%（n=6），结果表明该方法的重复性良好。

2.3.10 加样回收率试验

取约0.05 g木芙蓉叶粗多糖6份（编号：S6），加入与之含量相近的混合对照品溶液，经水解和衍生化，进样分析，记录峰面积，代入标准曲线计算6种单糖的含量，并计算其加样回收率。结果见表2，结果表明该方法准确度良好。

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  表格2 6种单糖成分的加样回收率试验结果（n=6）

  Table 2.Results of recovery rate of 6 kinds of monosac-charides (n=6)

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2.3.11 样品含量测定

取9批不同月份的FHMP各约0.1 g，精密称定，经水解和衍生化，进样分析，记录峰面积，根据标准曲线计算6种单糖的含量。不同月份FHMP的单糖组分的含量测定结果见表3。木芙蓉叶单糖含量及总多糖含量均为葡萄糖＞半乳糖＞木糖＞甘露糖≈岩藻糖＞鼠李糖，且在9月份时总多糖含量达到最高。

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  表格3 不同采收期木芙蓉叶的单糖组成及总多糖测定结果（n=3）

  Table 3.Determination of monosaccharide composition and total polysaccharides of Folium hibisci mutabilis at different harvesting stages (n=3)

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2.4 纯化产物组分测定结果

FHMP-Ⅰ、FHMP-Ⅱα及FHMP-Ⅱb部位的单糖组成及其摩尔比结果，见表4。

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  表格4 单糖组成分析结果（n=3）

  Table 4.The analysis results of monosaccharide composition (n=3)

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3 讨论

目前对于木芙蓉叶的研究主要集中于黄酮、有机酸、挥发性等成分及其生物活性[20-25]。尚未见木芙蓉叶多糖研究的报道。酶解法被认为是提高多糖得率的常用方法[26]，本文探究了不同酶解法提取FHMP的最优工艺，以多糖提取率作为评价指标确定酶种类，根据结果可以看出木瓜蛋白酶的提取率最大。对成都市9批同一产地不同采摘时间的木芙蓉叶样品检测分析，确定了单糖成分及其质量分数，经方法学验证，所建立的柱前衍生HPLC方法可靠、适用性强，可用于FHMP中6种单糖的定性和定量分析。由结果可以看出，9批样品的各单糖质量分数差异不大，波动无明显规律，但9月份总含量最大。通过酶解法提取得到的粗多糖成分较为复杂，通常伴随着一些色素、脂肪、无机盐和蛋白质等物质[27]，这些物质不利于多糖的活性分析及结构鉴定，因此需要进一步分离纯化，即除杂和组分分离。本文经过试验，最终选择质量浓度为5%的TCA进行脱蛋白处理，利用DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析分离纯化，成功分离出均一多糖。

综上，本试验对FHMP的提取、纯化工艺及组分分析进行了探索，为其进一步开发利用奠定了基础。但本研究仅为基础性研究，仍有需要深入探讨的地方。酶具有专一性，不同的酶作用于多糖的连接位点不同[28]，会影响提取出来的木芙蓉叶多糖的相对分子质量和黏度，从而导致不同酶解法提取出来的多糖活性产生差异。因此，今后还应深入研究不同酶解法得到的FHMP活性差异，及其对多糖结构的改变、单糖组成的变化以及连接方式的影响。在对木芙蓉叶开发应用中可以根据实际需要选择不同的提取方法。

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